CN1930283A

CN1930283A - 白细胞刺激基体

Info

Publication number: CN1930283A
Application number: CNA2005800069398A
Authority: CN
Inventors: 马丁·舒尔茨
Original assignee: Leukocare AG
Current assignee: Leukocare AG
Priority date: 2004-03-04
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2025-03-04
Also published as: WO2005085420A2; DE502004010393D1; US20070172490A1; EP1571204A1; ATE449161T1; CN1930283B; EP1571204B1; WO2005085420A3

Abstract

本发明涉及白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的白细胞刺激基体，所述基体包括以下组分：a)一种或多种载体；b)用于包埋一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分的可溶性基体；c)包埋进可溶性基体中的一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分。本发明也涉及包括所述基体的组件及其用途。

Description

白细胞刺激基体

发明领域

本发明涉及白细胞刺激基体，包括白细胞刺激基体的白细胞刺激组件，和/或刺激白细胞和/或诱导免疫耐受的方法。

背景技术

白细胞抗原的特异性刺激是免疫反应调节(接种疫苗，过继性免疫治疗等)的重要的和正在发展的研究领域。除常规意义上的疫苗接种外，目前已知的主要治疗方法还有离体刺激。

目前，对许多慢性病毒性传染病还没有充分有效的疗法。慢性是基于组织中病毒性抗原的持续性和缺乏针对它的免疫应答。病毒性疾病大部分以化学疗法治疗。这种治疗通常导致病毒的耐药性及强烈的副作用。例如涉及肿瘤疾病的以前关于离体刺激树突细胞和通过树突细胞(DC)刺激效应细胞的实验仅取得了部分成功(Cerundolo et al.，Nature Immunology，Bd.5，Nr.1，S.7-10，2004)。效应细胞的离体刺激以及随后这些细胞回到患者体内可能对干扰过于敏感并且太微弱以至于不能诱导临床相关效果。另外，目前所应用的方法中，分离出在血液中仅非常少量存在的树突细胞和效应细胞。这些细胞的离体扩增是对干扰敏感的另一步。在全血中(体内)的抗原特异性刺激白细胞较之离体刺激有优势，由于血液中对于白细胞的抗原特异性活化所必需的所有生理学和必需因子都能被利用。

WO 00/27999公开了将造血前体细胞、抗原呈递细胞和淋巴网状内皮基质细胞包埋于多孔固体基体，其中所述基体被生物试剂覆盖并且被凝胶状试剂所浸透。此基体可用于体外T细胞反应性的诱导。

WO 93/20185公开了体外增殖树突细胞前体的方法。

WO 97/03186(US 6,121,044)公开了具有被包埋的树突细胞(DC)的基体并且能引发初次和再次免疫应答的可植入组件。此文献涉及到能用于体内的组件，但是，所述组件具有缺点，即依靠其中公开的组件或基体的免疫应答不能进行时间调节。依靠此种刺激不能确保白细胞的活化完成后，白细胞能从刺激基体中以受控方式被释放回血流中。

Banchereau和Steinmann在Nature，vol.392，p.245-252，1998的综述文章中描述了树突细胞及其在免疫应答调控中的参与。

WO 03/030965公开了白细胞刺激组件，其中抗原呈递细胞复合物(MHC)和抗原固定于所述组件中的载体上。此文献也公开了发生被刺激的白细胞的释放，但是没有公开怎样能够以受控方式调控这样的释放。

WO 03/031473公开了降低白细胞活性的组件，其中所述组件包括载体和结合于载体且能够与白细胞受体相互作用的配体。

本发明的目的是提供能够在体内刺激白细胞和/或在血液循环中诱导免疫耐受的基体或包含基体的装置，其中所述经刺激的白细胞能够以时间可控模式从基体中释放出。

发明内容

以上提及的问题通过提供根据权利要求1的白细胞刺激基体和根据权利要求12的白细胞刺激组件来解决。

本发明的白细胞刺激基体具有以下组分：

a)一种或多种载体；

b)用于包埋一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分的可溶性基体；

c)包埋进可溶性基体中的一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分。

依据本发明，循环的抗原特异性白细胞与包埋在可溶性基体中的组分结合，保持结合一段时间、经受刺激并作为活性细胞分别从所述基体或包括基体的组件中释放。

依据本发明，这样的白细胞刺激基体能确保在预定的时间范围内其外部基体表面持续受控的溶解，该时间范围优选为数小时至约一天。可溶性基体以受控方式逐层释放到含白细胞的液体中，优选释放到全血中，由此可溶性基体中包含的组分也能被释放以产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导(如抗原)，并且由此与这些组分结合的白细胞也从所述基体释放。分别将白细胞刺激基体或包含白细胞刺激基体的组件导入机体以导致这些白细胞通过血流回到体内。选择可溶性基体各外层的溶解时间以使得能确保结合强度和结合时间适合于各抗原特异性白细胞活化。

在本发明的优选实施方案中，除组分a)到c)之外，还提供了一个或多个偶联组分，以介导载体与一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分之间的结合。这种介导的结合更适宜为共价结合，以使得至少部分用于产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的被包埋组分可通过偶联组分共价结合于载体。但是，这些组分与偶联组分的非共价结合，如离子结合，基于疏水作用、范德华作用的结合等，也包括在本发明中。本发明也包括了这样的实施方案，即其中用于产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的所述组分结合于偶联组分且部分包埋进可溶性基体而没有与偶联组分结合。

载体

本发明白细胞刺激基体的载体无特别限定，只要本发明的可溶性基体能置于其上。优选生物相容性材料的载体。优选有孔载体。

如聚氨基甲酸酯、聚酰胺或聚脂的材料能被用作硬质塑料(duroplastic)载体材料，其中优选聚氨基甲酸酯。在聚氨基甲酸酯中，可使用具有开放孔的亲水性材料以及疏水性聚氨基甲酸酯泡沫，它们任选地包含诸如碳色素和/或硅酮色素的色素。

另外，可利用任选地包含以上提及的色素的聚氨基甲酸酯涂剂或其它半成品。尤其优选医用级(购自KCI)。如聚碳酸酯和聚苯乙烯的材料适于作热塑性载体材料。也可利用聚乙烯或聚丙烯，其中这些材料可优选与吸附色素结合使用。也可利用弹性体。

其它合适的聚合物例如为PTFE(聚四氟乙烯)、涤纶或聚甲基戊烷。

进一步优选的材料为那些外科用(缝合)可溶性材料，如monocryl(聚卡普隆25，PDS-2(polydioxanon)、Maxon(聚葡糖酸酯)、vicryl(polyglactin-910(丙交酯和乙交酯共聚物-910))和Dexon-Plus(聚乙醇酸)。这些在例如全血的体液中可溶的材料的使用具有在外部基体或涂层分别完全溶解后载体再逐渐溶解的优点，这样无需从体内除去用作植入物的白细胞刺激组件或白细胞刺激基体。

另外，任何可能形式的玻璃，如具有开放孔或泡沫状的纤维，适于作为载体材料。

另外，金属适于作载体，优选相容性金属或覆盖有生物相容性金属的载体。可优选采用诸如肠衣的天然材料或诸如海绵体生物性材料。

尤其优选有孔的聚合物材料，尤其是聚氨基甲酸酯。所述孔可为任何尺寸。优选平均孔径范围为0.5-2mm，尤其为约1mm。

可溶性基体

本发明的白细胞刺激基体还包括载体上的可溶性基体，其中包埋于基体中的一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分被包埋。此处使用的术语“可溶性”表示可溶性基体在数小时至数天的时间范围内溶解于全血中。

在本发明的优选实施方案中，可溶性基体(b)由诸如淀粉、纤维素和/或糖原的长链糖化合物制成，或者由聚乙二醇制成。但是，本发明不是必须包含长链糖化合物。因此，在本发明的优选实施方案中，PEG是可溶性基体的必需组分，长链糖为任选组分。在本发明的进一步优选实施方案中，除PEG外，可溶性基体不含有长链糖组分。

在以上提及的含有长链糖化合物的实施方案中，基于长链糖化合物和聚乙二醇的总量，可溶性基体优选包括50-90wt.％、更优选60-80wt.％的一种或多种长链糖化合物，和10-50wt.％、优选20-40wt.％的聚乙二醇。在本发明的这两个可溶性基体实施方案中，能确保可溶性基体在约4-12小时内缓慢溶解在血液中。原则上，PEG含量的增加可减缓溶解。因此，可溶性基体溶解时间的调控可通过PEG和长链糖化合物含量的变化实现。

可溶性基体溶解时间的调控可进一步通过PEG分子量的变化实现。优选采用分子量在1-200KD范围内的聚二乙醇(PEG)。优选10至约60KD的分子量，更优选约10-30KD的分子量，尤其优选约30KD的分子量。也可采用修饰的PEG，如那些其中以间隔基连接的PEG分子。PEG优选用作水溶液，其中采用约1-10wt.％、优选约5wt.％的分子量为15-20KD的PEG。对于低分子量的PEG(如约6KD)，浓度可达到20wt.％，但是，对于较高分子量的PEG，它的浓度也可低一些。适宜的浓度可由技术人员进行实验来决定。PEG也可结合至各种细胞因子，如干扰素(IFN)，其中这样的PEG干扰素产品也可用作本发明可溶性基体的组分。这样，可将作为白细胞刺激试剂的细胞因子并入可溶性基体。

产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分

依据本发明，白细胞刺激表示先前的条件免疫细胞在它们的免疫应答方面被特异性增强。术语白细胞包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、粒细胞和中性粒细胞。

此处所用术语耐受诱导表示白细胞被诱导成对特异性抗原无反应性，这指发生失活。白细胞被抗原刺激并且同时共刺激分子被抑制。

依据本发明，诸如抗原、半抗原、MHC分子、共刺激因子的分子、细胞组分和/或抗原呈递细胞的膜碎片可分别用作产生或引发或生成白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分。抗原并不是必须事先分离出。自然的或大部分自然的病毒、细菌、细胞或包含抗原的外被也可用作产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分。也可采用失活的病毒、细菌等。所述失活可由已知方法进行，如UV-照射。从例如病毒、细菌或肿瘤细胞的制剂分离得到的抗原，例如肽，可与待治疗患者的MHC分子或抗原呈递细胞(如树突细胞(DC))(自体细胞)的膜组分偶联，或者它们可来源于异源供体。依据本发明，可溶性基体的免疫相关成分，即引起免疫应答的部分，可称为免疫刺激复合物(IK)。抗原可为合成抗原，或抗原可从病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫(如蠕虫)、肿瘤、变应原、细胞培养物或从机体自身组织中收集。MHC分子和/或共刺激因子可从机体自身组织、细胞培养物中收集，或者它们可以合成产生。

例如在Rothstein和Sayegh，Immunological Reviews 2003中，可发现共刺激因子的综述“T-cell co-stimulatory pathways in allo-graftreaction and tolerance(在同种异体移植反应和耐受中的T细胞共刺激通路)”。将这些分子纳入到本发明中作为参考。

依据本发明，以下共刺激分子可在抗原存在下使用。

-CD28/CTLA-4：B7-家族所有的共刺激分子：CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、B7-1、B7-2、B7RP-1、PD-L1、PD-L2。

-肿瘤坏死因子：肿瘤坏死因子受体家族：

CD154/CD40L、4-IBB(CD137)、Ox-40(CD134)、CD27；配体：CD40、4IBBL(CD137L)、Ox40L(CD134L)、CD70。

未来发现的其它共刺激分子也包括在内。

优选那些针对以下物质产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分：病毒，疱疹病毒科的病毒，尤其是巨细胞病毒(CMV)、爱普斯坦巴尔病毒(EBV)或单纯疱疹病毒(HSV 1+2)，或包含引起免疫应答的抗原的其部分或片段、病毒外壳或其病毒外壳碎片。

另外，以下组分可被采用：SARS(冠状病毒)；鼻病毒；细小核糖核酸病毒，尤其是脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，逆转录病毒，尤其是人免疫缺陷病毒(HIV)，引起肝炎的病毒，尤其是乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)，冠状病毒，尤其是SARS相关冠状病毒；和/或含有引起免疫应答的抗原的它们各自的抗原或片段或部分、病毒外壳或其中病毒外壳碎片。

另外，依据本发明，可采用所有其它与慢性炎性疾病或肿瘤疾病相关的病毒、正粘病毒(流感)、副粘病毒(腮腺炎，未接种或不完全接种产生的麻疹))、乳多空病毒(乳头瘤病毒)。也可采用针对其无疫苗接种和/或具有急性致病性/致死性的病毒。

白细胞刺激基体尤其适于对抗病毒化学疗法无反应(因为他们例如已产生耐药性)或者对由病毒引起局部炎症(如CMV视网膜炎)的系统治疗不成功情况下的患者。

尤其优选巨细胞病毒CMV Hi 91、AD169、Towne、Davis株或其外壳、部分或片段的抗原。但是，其它实验室毒株或野生型毒株也包括在本发明中。

RNA病毒、DNA病毒、有壁病毒、无外壳病毒、致癌病毒(乳头瘤病毒)和HHV-8等可作为病毒类型被采用。

在抗生素不相容、耐药性或由细菌引起的局部炎症的情况下，依据本发明可使用细菌或其中包含抗原的部分或碎片。

基本上，所有分别来自于葡萄球菌、链球菌、肠球菌、奈瑟氏球菌、肠细菌、弧菌(霍乱)、所有不发酵细菌、弯曲杆菌属、螺旋杆菌、嗜血杆菌、博德特氏菌、军团杆菌、所有引起人兽共患病的微生物、棒状杆菌、杆菌、梭菌、分枝细菌、奴卡氏菌、密螺旋体，疏螺旋体(优选即时检测疏螺旋体病患者)、细螺旋体、巴尔通氏体、支原体、衣原体科或属的种类都可被采用。

在真菌之中，尤其可采用plastomyce(念珠菌属)、丝孢菌类(霉菌、曲霉菌)、二态真菌及其它，如肺囊虫，尤其是人病原性真菌和所谓的“医院微生物”，如曲霉菌或白色念珠菌属。

依据本发明，在寄生虫中，原虫、吸虫、绦虫或线虫尤其可被采用。

本质上可采用朊病毒或其它未知的或未定义的病原。

对肿瘤来说，优选采用未活化肿瘤细胞的膜成分，尤其是恶性黑素瘤细胞的膜成分。

对于自体免疫病/变态反应来说，可采用基本上目前已知或将来被了解的所有相关抗原，尤其是胶原、胆上皮细胞的细胞膜等。

优选可被采用以产生免疫耐受的抑制因子为LIR-1。

涂层中产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分的浓度可由技术人员采用适宜的实验确定。优选这种成分进入机体的量或浓度与用在常规免疫接种中的量相当。在常规接种时，例如使用约20μg的病毒抗原。

在本发明的优选实施方案中，所述可溶性基体连同包埋抗原的全部组成大致如下：

基体定义(wt.％)

可能范围优选范围

PEG和长链糖总量 99.5-99.999wt.％ 99.9-99.99wt.％

抗原 0.001-0.5wt％ 0.01-0.1wt％

如果全病毒、细菌、其外壳或类似物用于替代基本上分离的抗原，上述提及的抗原含量也可多于0.5wt.％或0.1wt.％。

如上所述，长链糖不是必需的。基于长链糖化合物与聚乙二醇的总量，PEG与长链糖混合物的比例在优选实施方案中长链糖混合物为50-90wt.％，优选60-80wt.％，聚乙二醇为10-50wt.％，优选20-40wt.％。

偶联组分

在本发明的优选实施方案中，偶联组分用于介导载体与一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分间的连接。此偶联组分优选介导共价结合并且优选为选自溴化氰、氰基硼氢化物、琼脂糖、琼脂糖衍生物、硅烷、硅烷衍生物或它们的组合的成分。在不太优选的实施方案中，可采用对甲苯磺酰氯。尤其优选烷氧基硅烷，甚至更优选脱水烷氧基硅烷或具有至少一个羧基的其它烷氧基硅烷。烷氧基优选甲氧基或乙氧基。尤其优选的脱水烷氧基硅烷为3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐(GENIOSILGF 20，Wacker)。也可采用包含氨基的烷氧基硅烷，如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷或[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷。还优选(3-(2，3-环氧丙氧基)丙基)三甲氧基硅烷(GENIOSILGF 80)。其它的烷氧基硅烷可根据各自载体和条件选择。

已发现烷氧基硅烷，尤其是脱水烷氧基硅烷如GENIOSILGF 20，还有GENIOSILGF 80，尤其适于介导与聚氨基甲酸酯或玻璃载体的结合。

本发明使得能以有限时间结合全血中的白细胞或从全血中分离出的白细胞、它们的特异性抗原刺激以及通过分别在全血中或含有白细胞的生理液中溶解基体而将被刺激的白细胞再循环至血液循环中。

另外，依据本发明，通过抑制因子的添加和同时的特异性活化可诱导免疫耐受。抑制因子的添加例如可在可溶性基体的形成期间进行，这意味着当可溶性基体形成后抑制因子被包埋于其中，或者该添加在白细胞刺激期间进行。抑制因子也可通过一种上述的偶联组分被包埋于可溶性基体中。在免疫耐受诱导中，使白细胞与抗原接触，但是由于抑制因子对抗原的影响，它不能被活化。适宜的抑制因子例如为LIR-1。其它的抑制因子为技术人员已知，且包括于本发明中。有待发现的抑制因子也包括于本发明中。

本发明的白细胞刺激基体也可用作植入物。

白细胞刺激组件

本发明的白细胞刺激基体可用在白细胞组件中。该白细胞刺激组件包括优选玻璃或塑料所制备的壳体，其中塑料优选无毒且对诸如全血的生物液为化学惰性的，这意味着它基本上是不溶性的。白细胞刺激组件包括至少一个开孔。优选至少一个进口开孔和至少一个出口开孔，更优选恰好一个进口开孔和恰好一个出口开孔。在另一实施方案中也可分别提供壳体或组件，该实施方案例如仅有一个开孔，含有白细胞的液体流入也流出。组件其它实施方案可由技术人员设计，如具有多于一个开孔的实施方案，例如两个进口开孔和/或出口开孔。

另外，本发明涉及白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的方法，其中将诸如全血的含有白细胞的液体与本发明的白细胞刺激基体相接触。该接触优选在本发明的白细胞刺激组件中进行。所述接触更优选在患者血液循环中进行，即指在体内。

本发明的所述组件可分别用于诸如针对病毒或细菌感染或肿瘤抗原缺乏细胞免疫应答的患者或临床情形。

本发明的组件可被引入患者的血液循环中。在优选的实施方案中，通过用于将组件暂时导入患者的Sheldon导管，将组件被导入患者的血液循环。在此情形下，结合至包埋进所述基体的组分的循环的抗原特异性T细胞在那里被结合一段时间，被刺激且作为高度活化细胞离开基体。仅具有不充分的特异性功能的效应细胞被刺激且作为高度活化细胞离开基体。事先与包埋于可溶性基体的组分接触的记忆细胞也与基体结合。这些条件细胞也被高度活化。另外，非条件(初始)的T细胞能与基体结合且根据存在的呈递抗原MHC分子、共刺激因子或其它细胞成分被调节。能任选地加入至基体或包埋于可溶性基体中的共刺激因子(如DC-粘附因子，细胞因子等)引起这些细胞的活化，它们再循环至血液循环，目的在于通过血液循环中的特异性效应机制消除病原因素。接着可诱导体液免疫应答(T细胞介导的B细胞的活化)。

如上所述，通过采用包埋有抑制因子的各基体或者通过在白细胞刺激期间将抑制因子添加进基体可实现免疫耐受。

被结合和受刺激的白细胞由于可溶性基体的溶解被释放并且进入机体。同时，在基体溶解期间，较深层的含有抗原决定簇的基体显现于表面，并且新的未占用的结合位点空出来。抗原介导的白细胞结合与刺激持续进行直至没有可溶性基体为止。

本发明的组件的使用使得能在确定的容积内集聚白细胞和免疫刺激机制，这是一个优点。在依据常规技术的离体应用中，受刺激的白细胞再循环至患者机体，然而在它们回归至患者内后，完全不清楚受刺激的白细胞的分布。

白细胞刺激组件的使用(即尤其是通过将其导入患者血流)或基体与患者全血离体孵育导致诸如T细胞的循环白细胞结合在可溶性基体的外层。本发明可溶性基体的组成导致外层持续溶解。因此，通过血流效应或机械处理(如摇动)，被结合并受刺激的白细胞也从固体上释放并且再循环至血液循环中。壁外层的溶解导致免疫表面的更新。白细胞能结合于新显现于表面的免疫刺激复合物、抗原、细胞组分、MHC分子等。此过程不断重复直至壁完全溶解。溶解的组分在血液中是无毒无害的，因为它们是生物相容性材料和/或患者的自体组分。血液中循环的免疫刺激复合物可能的持续免疫原性是附加优点，因为直至这些组分被生物降解，在患者中一直有进一步的抗原特异性免疫刺激。

组件优选塑料壳体，该壳体优选为约5-500ml容积。调节进口与出口管口的直径以适于导管的管连接。导管可具有两个腔(如Sheldon导管)，因此可能使得每腔降低高至50％的血液流速。该壳体包含本发明的白细胞刺激基体。

如果必要，充满患者血液的白细胞刺激基体充满后，作为功能性单元它可断开与导管的连接，用于进行例如进一步离体修饰(如共刺激因子、细胞因子、激素、抑制因子等的添加)而不必从所述组件中除去血液。填充血液的壳体可在30℃以上持续摇晃孵育数小时，然后可通过导管直接从白细胞刺激组件回归于患者。此操作可重复数次。

本发明优点

目前没有分别在血流中或在全血中，或通常在含白细胞的液体中进行时间可控的抗原特异性白细胞刺激的方法。本发明解决了这样的问题，即现有技术中固定抗原对白细胞的刺激导致对固体基体的稳定结合，使得白细胞不可能释放。这可能导致白细胞在现有使用的组件中的集聚。这就导致阻力增加及对白细胞的特定压力，以及不期望的副反应及增加的阻塞效应。依据本发明，受刺激的白细胞持续再循环入血液循环能够解决以上提及的问题。

依据本发明，白细胞刺激组件或白细胞刺激基体分别可用于针对慢性病毒感染性疾病的治疗。所述慢性基于组织中抗原持续存在及对其不充分的免疫应答。病毒性疾病大部分以化学疗法治疗。这种治疗通常导致肾记忆和剧烈的副作用。本发明可确保分别诱导或增强针对病原因素的从无到有的高度特异性免疫应答。

与用以产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分的结合可导致先前条件免疫细胞免疫应答的增强。由于这些细胞通过血流自动进入白细胞刺激基体及在此基体被刺激，这些以低浓度存在于血液中的细胞不必费力分离以及不必离体扩增。它们活化后，所述白细胞作为效应细胞依靠可溶性基体的溶解直接进入血液循环和组织。血流中的生理学环境确保了使高度活化的效应细胞成熟所必需的所有因子都存在。

另外，本发明使新的免疫作用及耐受诱导成为可能。

本发明还涉及本发明的白细胞刺激基体或白细胞刺激组件在白细胞刺激和/或免疫耐受诱导中的用途，以及在活化T细胞亚型的分布的检测或疫苗接种方法中的用途。

本发明将通过以下实施例进行描述，但无意限制本发明的范围。

1.涉及包埋进可溶性基体中的抗原的实施方案

巨细胞病毒Hi91株在培养的人包皮成纤维细胞中培养。发生细胞病变后，收集细胞培养上清，通过超离心浓缩病毒，以磷酸盐缓冲液(含Ca²⁺、Mg²⁺的0.1M PBS，pH7.4)洗涤，UV照射灭活。在含5wt.％的15-20KD PEG(产品号P2263，Sigma-Aldrich，具有α-羟基聚(氧-1，2-乙二基)的2，2’-([甲基亚乙基]-二[4，1-亚苯基-甲醛])-二-环氧乙基-聚和物)的100μl碳酸氢钠缓冲液(50mM；pH 8.0-9.6)中室温短时间(3-5分钟)孵育病毒(PEG化)。10mg具有开孔的聚氨基甲酸酯泡沫(PU医用级，KCI)与包含在反应混合物中的PEG化的病毒一起室温孵育，然后干燥。

接着，向其中加入20μl抗原制品(CMV Hi91)。1×10⁶-1×10⁷病毒的抗原用于刺激实验。然后，向预处理的样品中加入已知可检测出的及具有持续CMV特异性细胞免疫活性的CMV阳性供者的全血(500μl)，37℃摇晃孵育1小时。

载体以上述的碳酸氢钠缓冲液洗涤后，制备血液用于通过流式分析(FACS)细胞计数，用于T细胞中新生成的促炎细胞因子(CD4和CD8)的检测。可购得的标准测试试剂盒(Becton Dickinson)用于T细胞活化(CD69/IFN-γ)的检测。

2.具有共价结合抗原的实施方案

如上述1部分所述进行实验。但是，抗原不和PEG一起添加，而是在与PEG和纤维素接触前PU泡沫用偶连组分3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐(5％的溶于甲醇的GeniosilGF 20)预处理1-2小时。接着，来自上述预处理的巨细胞病毒的外壳的抗原通过孵育共价连接到载体材料。

结果

共价结合的抗原和包埋在可溶性基体中的抗原都能诱导全血中T细胞介导的免疫应答。具有共价结合抗原的载体在数次重复持续测定中显示出免疫反应的降低(CD69/IFN-γ)。与此相反，由可溶性基体诱导产生的免疫反应不随时间变化。图1表示通过共价结合CMV抗原(经硅烷(溶于甲醇的5％Geniosil)预处理的聚氨基甲酸酯，KCI医用级)和通过非共价包埋的CMV抗原刺激CMV特异性免疫应答(活化标记物CD69/干扰素γ产生)，利用流式试验细胞计数获得实验结果的实例。通过以布雷菲德菌素A预处理细胞来抑制细胞因子的释放。象限分析表明减去对照值(未受刺激细胞的0.02％)后，有2.49％的淋巴细胞特异性活化(CD4⁺)。

因此，共价结合至载体或包埋在可溶性基体中的抗原可诱导全血中特异性T细胞介导的免疫应答。可溶性基体导致与血液接触的抗原刺激组分持续更新。血液组分因而不会抑制其功能性能力。

图1a和b：通过流式试验的细胞计数，以象限分析表示。每个右上部分的圆点表示被健康CMV阳性供者全血中CMV-HI91抗原(CD69/IFN-γ)CD4+活化的细胞。

A)未受刺激对照：0.02％；

B)在以硅烷处理的聚氨基甲酸酯上的CMV-HI91抗原：2.49％；

C)在以硅烷处理的聚氨基甲酸酯上的CMV-HI91抗原(重复)：0.75％；

D)可溶性基体上的CMV-HI91抗原(重复后)：2.02％。

上述实验以其它载体重复，如琼脂糖、玻璃和聚苯乙烯，显示出相似的结果。

Claims

1.用于白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的白细胞刺激基体，具有以下组分：

a)一种或多种载体；

c)包埋进所述可溶性基体的一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分。

2.如权利要求1所述的白细胞刺激基体，其还含有一种或多种用于介导所述载体与所述一种或多种产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分的结合的偶联组分。

3.如权利要求2所述的白细胞刺激基体，其中所述结合为共价结合。

4.如前述权利要求中任一项所述的白细胞刺激基体，其中所述产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分选自抗原、MHC分子、共刺激因子、细胞成分、细胞外被、细菌、病毒及其组合。

5.如前述权利要求中任一项所述的白细胞刺激基体，其中所述产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分为合成抗原或从病毒、细菌、真菌、肿瘤、变态反应原、内源性组织获得，和/或所述MHC分子和共刺激因子从内源性组织、细胞培养物获得和/或通过合成获得。

6.如权利要求4或5所述的白细胞刺激基体，其中所述产生白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的组分为疱疹病毒科的病毒或其片段，优选巨细胞病毒或其片段。

7.如前述权利要求中任一项所述的白细胞刺激基体，其中所述载体选自聚氨基甲酸酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、外科用可溶性材料、玻璃、诸如肠衣的天然材料或诸如海绵体生物材料或其组合。

8.如权利要求2-7任一项所述的白细胞刺激基体，其中所述偶联组分选自溴化氰、氰基硼氢化物、琼脂糖、琼脂糖衍生物、硅烷、硅烷衍生物或其组合。

9.如权利要求8所述的白细胞刺激基体，其中所述硅烷衍生物为烷氧基硅烷，优选脱水烷氧基硅烷或具有至少一个羧基的其它烷氧基硅烷。

10.如前述权利要求中任一项所述的白细胞刺激基体，其中所述可溶性基体由一方面的诸如淀粉、纤维素、糖原的长链糖化合物和/或另一方面的聚乙二醇所制成。

11.如权利要求10所述的白细胞刺激基体，其中基于长链糖化合物与聚乙二醇的总量，所述可溶性基体由50-90wt.％、优选60-80wt.％的长链糖化合物和10-50wt.％、优选20-40wt.％的聚乙二醇制成。

12.白细胞刺激组件，包括具有至少一个开孔的壳体和包含在其中的前述权利要求中任一项所述的白细胞刺激基体。

13.如权利要求12所述的白细胞刺激组件，包括至少一个进口开孔和至少一个出口开孔，优选一个进口开孔和一个出口开孔。

14.白细胞刺激和/或免疫耐受诱导的方法，其特征在于将含有白细胞的液体与权利要求1-11任一项所述的白细胞刺激基体接触。

15.如权利要求14的方法，其中所述接触在权利要求12或13所述的白细胞刺激组件中进行。

16.如权利要求1-11任一项所述的白细胞刺激基体或如权利要求12或13所述的白细胞刺激组件在白细胞刺激和/或免疫耐受诱导中的用途。

17.如权利要求1-11任一项所述的白细胞刺激基体或如权利要求12或13所述的白细胞刺激组件在用于检测活化T细胞亚型分布或用于免疫接种的方法中的用途。