CN106905343A - 含有两个羟基的菲并咪唑‑荧光素pH荧光探针及其制备方法 - Google Patents

含有两个羟基的菲并咪唑‑荧光素pH荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

含有两个羟基的菲并咪唑‑荧光素pH荧光探针及其制备方法，它涉及荧光素类pH荧光探针及其制备方法。它是要解决现有的荧光素类pH荧光探针的修饰位点少、结构单一，没有明确的响应位点，不能定量检测pH值的技术问题。本发明的含有两个羟基的菲并咪唑‑荧光素pH荧光探针的结构式如下：制法：一、以菲醌、间硝基苯甲醛、苯胺、乙酸铵为原料，以冰乙酸做溶剂，合成中间体化合物I；二、用中间体化合物I、雷尼镍和水合肼溶液合成中间体化合物II；三、用荧光素、甲醇溶液、氢氧化钠溶液和氯仿合成中间体化合物III；四、以中间体化合物II和中间体化合物III为原料，以酸性介质为溶剂合成pH荧光探针，可用于pH值的检测与监控。

Description

含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种菲并咪唑-荧光素类pH荧光探针及其制备方法。
背景技术
pH值是生物体的一个重要指标，特定的pH值在很多生理、病理过程中起着十分重要的作用。细胞内的pH在许多生理、病理过程中起着重要的作用。酸性或碱性过强会引起细胞功能紊乱，导致心、肺病变或神经类疾病，严重时甚至会有生命危险。因此监测细胞内pH值的变化可以为研究生理和病理过程提供重要信息。荧光素类pH探针由于其非破坏性及灵敏度高而被广泛应用。2011年，《四面体快报》(Tetrahedron letters)中报道了一个系列带有电子供体的荧光素pH荧光探针(Study on various fluorescein derivatives as pHsensors)。该系列荧光素pH荧光探针主要依据光诱导电子转移的(photo-inducedelectron transfer，PET)的设计原理，采用苯基胺，哌啶，吗啉等供电子给体对荧光素进行修饰。所报道的荧光素pH探针是对荧光素结构单元本身进行修饰；同时，文献并未定量的给出每个荧光素pH荧光探针的荧光响应的pH值，没有明确的pH响应位点，不能定量检测pH值。使荧光素pH探针的应用范围收到了限制。所以，开发具有结构多样的，能够定量检测pH值的荧光素pH荧光分子探针仍然是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明是要解决现有的荧光素类pH荧光探针的修饰位点少、结构单一，没有明确的响应位点，不能定量检测pH值等技术问题，而提供含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针及其制备方法。
本发明的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式如下：
上述含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：
一、中间体化合物I的合成：
将菲醌、间硝基苯甲醛、苯胺、乙酸铵按照1:(1.0～2.0):(1.0～2.0):(2～5)物质的量的比加入到反应器中，再加入冰乙酸作为溶剂，升温至80～130℃并搅拌4～12h后，冷却至室温，向反应器中加入水，再调pH值至8～10，抽滤，收集黄色固体，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥后得到中间体化合物I 2-(3-硝基苯基)菲并咪唑；
二、中间体化合物II的合成：
称取中间体化合物I、雷尼镍和质量百分浓度为75％～80％的水合肼溶液，其中中间体化合物I的物质的量与雷尼镍的质量的比为1mmol：(0.04～0.11)g；中间体化合物与水合肼的摩尔比为1：(1～1.5)；将l中间体化合物I和雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在25～30℃的温度条件下搅拌，并滴加质量百分浓度为80％的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50～80℃，反应5～10h，冷却至室温，抽滤，并用乙酸乙酯洗涤，收集滤液，浓缩，得到中间体化合物II 2-(3-氨基苯基)菲并咪唑；
三、中间体化合物III的合成：
称取荧光素、质量百分浓度为20～30％的甲醇溶液、质量百分浓度为40％～60％的氢氧化钠溶液和氯仿；其中荧光素的质量与质量百分浓度为10％～20％的甲醇溶液的体积的比为1g：(1～3)ml，荧光素的质量与质量百分浓度为40％～60％的氢氧化钠溶液的体积的比为1g：(5～10)ml，荧光素的质量与氯仿的体积的比为1g：(2.5～5.5)ml；将荧光素加入到反应器中，加入甲醇溶液搅拌均匀，再加入氢氧化钠溶液搅拌均匀，冷至50～60℃，滴加氯仿，搅拌3～12h，停止反应，冷却至25～30℃；调至pH值为4～6，抽滤，收集褐色固体，干燥，柱分离后，得到中间体化合物III荧光素单醛；
四、二羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的合成：
按照1:(1～4.5)的物质的量比称取中间体化合物II和中间体化合物III，加入到反应器中，再加入酸性介质为溶剂，25～30℃下搅拌反应4～8h，停止反应，加水淬灭，再用碱性溶液调pH值至6～10，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，得到含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针。
本发明的合成过程如下式子所示：
含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针
本发明基于激发态分子内电子转移的原理设计了通过亚胺基团链接的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针，该pH荧光探针中与亚胺基团相邻的羟基与亚胺基团形成分子内氢键，便于在基态下形成分子内电子转移，在形成的分子内电子转移的基础上，随着pH变化分子内电子转移被破坏，具有明确的pH响应位点，可提供明确的pKa值；同时另外一个没有形成氢键的羟基为该化合物提供了更多的修饰可能性。
本发明的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH值为6.5～8.0的范围内，具有明确的pH响应，选择性高、灵敏度高。同时该pH荧光探针在pH值为6.5～8.0的范围内具有良好的线性关系，可定量检测pH值，而且不受K+、Ba2+、Ca2+、Na2+、Mg2+、Zn2+、Cr3+、Cd2+、Ni2+、Co2+、Pb2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+和Hg2+；I-、Cl-、Br-、CO3 2-、HCO3 -、SO4 2-、NO2-、AcO-、H2PO4 -、HPO4 2-、BrO3 -、NO3 -、SO3 2-、HSO3 2-、F-、SCN-等其他离子的干扰，结构稳定，用于pH值的检验时，不受光影响，可长时间对pH值进行监控，方便快捷。
附图说明
图1是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝2～12)体系中的紫外光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度；
图2是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝6.8～8.1)，在λ＝470～550nm之间的最大吸光度与pH值得线性关系图；
图3是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝2～12)，在λ＝470～550nm之间的最大吸光度与对应pH值的Boltzmann拟合曲线。横坐标为pH值，纵坐标为吸光度；
图4是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝2～6.3，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)下的荧光发射光谱，横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度；
图5是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝3～5.7)，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与pH值得线性关系图；横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度；
图6是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝2～6.3，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与对应pH值的Boltzmann拟合曲线。横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度；
图7是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v±＝1/9，pH＝5.6～12，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)下的荧光发射光谱，横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度；
图8是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝6.7～8.0)，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与pH值得线性关系图，横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度；
图9是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝5.6～12，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与对应pH值的Boltzmann拟合曲线；横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度；
图10是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)，在pH＝9.0和pH＝2之间的荧光可逆光谱图，横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度。
图11是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝2.0，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)，阳离子对二羟基咪唑-荧光素pH荧光探针干扰的荧光发射光谱图，横坐标为阳离子，纵坐标为荧光强度。
图12是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝9.0，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)，阴离子对二羟基咪唑-荧光素pH荧光探针干扰的荧光发射光谱图，横坐标为阴离子，纵坐标为荧光强度。
图13是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm)，在pH＝9.0，pH＝2.0两个不同pH条件下的时间稳定荧光光谱图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式为：
具体实施方式二：具体实施方式一所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：
一、中间体化合物I的合成：
将菲醌、间硝基苯甲醛、苯胺、乙酸铵按照1:(1.0～2.0):(1.0～2.0):(2～5)物质的量的比加入到反应器中，再加入冰乙酸作为溶剂，升温至80～130℃并搅拌4～12h后，冷却至室温，向反应器中加入水，再调pH值至8～10，抽滤，收集黄色固体，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥后得到中间体化合物I 2-(3-硝基苯基)菲并咪唑；
二、中间体化合物II的合成：
称取中间体化合物I、雷尼镍和质量百分浓度为75％～80％的水合肼溶液，其中中间体化合物I的物质的量与雷尼镍的质量的比为1mmol：(0.04～0.11)g；中间体化合物与水合肼的摩尔比为1：(1～1.5)；将l中间体化合物I和雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在25～30℃的温度条件下搅拌，并滴加质量百分浓度为80％的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50～80℃，反应5～10h，冷却至室温，抽滤，并用乙酸乙酯洗涤，收集滤液，浓缩，得到中间体化合物II 2-(3-氨基苯基)菲并咪唑；
三、中间体化合物III的合成：
称取荧光素、质量百分浓度为20～30％的甲醇溶液、质量百分浓度为40％～60％的氢氧化钠溶液和氯仿；其中荧光素的质量与质量百分浓度为10％～20％的甲醇溶液的体积的比为1g：(1～3)ml，荧光素的质量与质量百分浓度为40％～60％的氢氧化钠溶液的体积的比为1g：(5～10)ml，荧光素的质量与氯仿的体积的比为1g：(2.5～5.5)ml；将荧光素加入到反应器中，加入甲醇溶液搅拌均匀，再加入氢氧化钠溶液搅拌均匀，冷至50～60℃，滴加氯仿，搅拌3～12h，停止反应，冷却至25～30℃；调至pH值为4～6，抽滤，收集褐色固体，干燥，柱分离后，得到中间体化合物III荧光素单醛；
四、二羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的合成：
按照1:(1～4.5)的物质的量比称取中间体化合物II和中间体化合物III，加入到反应器中，再加入酸性介质为溶剂，25～30℃下搅拌反应4～8h，停止反应，加水淬灭，再用碱性溶液调pH值至6～10，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，得到含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中的反应温度为95～100℃，反应时间为10～12h。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤一中调节pH值至7～9。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤一中调节pH值的溶液为质量分数为30％～40％氢氧化钠溶液、质量分数为50％～60％的碳酸钠溶液、质量分数为50％～70％的碳酸氢钠溶液、质量分数为40％～55％的碳酸钾溶液、质量分数为48％～80％的碳酸氢钾溶液或者质量分数为30％～40％的氢氧化钾溶液。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是步骤二中反应温度为70～80℃，反应时间为8～9h。其它与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是步骤三中pH值为8～10。其它与具体实施方式二至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是步骤三中调节pH值的溶液为质量分数为50％～70％醋酸溶液。其它与具体实施方式二至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是步骤四中调节pH值的溶液为质量分数为50％～70％醋酸溶液、质量分数为98％的浓硫酸、质量分数为36～37％的浓盐酸、质量分数为50～70％冰乙酸、质量分数为40～50％磷酸、质量分数为30～60％的甲酸或质量分数为10～30％的酸性离子液体。其它与具体实施方式二至八之一相同。
用以下实例验证本发明的有益效果：
试验1：本试验的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：
一、中间体化合物I的合成：
将1mmol菲醌、1.5mmol间硝基苯甲醛、1.5mmol苯胺、2.5mmol乙酸铵加入到四口瓶中，再加入40ml冰乙酸，升温至100℃并搅拌12h后，冷却至室温，向反应器中加入20ml水，再用质量分数为40％氢氧化钠溶液调pH值至8～10，抽滤，收集黄色固体，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥，得到中间体化合物I，中间体化合物I为土黄色固体；
本步骤得到的中间体化合物I的产率为95％，熔点：262～265℃。用红外光谱、核磁氢谱和核磁碳谱表征该中间体化合物I，得到的结果如下：
IR(KBr,cm–1):3401,3200,1675,1617,1531,1347,754,723；1H NMR(600MHz,DMSO):δH 13.808(H,s,J＝13.808Hz),9.156(H,t,J＝9.156Hz)，8.90(2H,q,J＝8.90Hz)，8.755(H,q,J＝8.755Hz),8.619(H,d,J＝8.619Hz),8.546(H,d,J＝8.546Hz),8.322(H,t,J＝8.322Hz),7.896(H,t,J＝7.896Hz),7.797(H,t,J＝7.797Hz),7.742(H,t,J＝7.742Hz),7.670(2H,m,J＝7.670Hz)；13C NMR(150MHz,DMSO):δC 178.88,148.36,146.71,135.99,135.34,132.06,131.79,130.58,129.24,129.03,127.23,127.09,125.71,125.39,124.35,124.10,123.71,123.45.
从表征结果知该中间体化合物I的结构式为：其化学名称为2-(3-硝基苯基)菲并咪唑；
二、中间体化合物II的合成：
称取2.0mmol中间体化合物I和0.1g雷尼镍加入到反应器中，再加入40ml乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在30℃下搅拌，滴加10.0mL质量百分浓度为80％的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至70℃，反应10h，冷却至室温，抽滤，并用乙酸乙酯洗涤，收集滤液，浓缩，得到中间体化合物II，中间体化合物II为棕色固体；
本步骤得到的中间体化合物I的产率为91％，熔点：239～241℃。用红外光谱、核磁氢谱和核磁碳谱表征该中间体化合物I，得到的结果如下：
IR(KBr)(νmax,cm–1):3362，1608，1594，1461，1234，935，760，723；1H NMR(600MHz,DMSO):δH 13.194(H,s,J＝13.194Hz),8.872(2H,d,J＝8.872Hz),8.585(H,s,J＝8.585Hz),8.080(H,d,J＝8.080Hz),7.733(2H,t,J＝7.733Hz),7.632(2H,t,J＝7.632Hz),7.291(H,s,J＝7.291Hz),7.161(H,t,J＝7.161Hz),6.892(H,d,J＝6.892Hz),6.717(H,t,J＝6.717Hz),4.344(2H,s,J＝4.344Hz)；13C NMR(150MHz,DMSO):δC 170.22,149.92,149.03,136.74,130.86,129.19,127.43,127.35,127.30,126.99,126.96,126.89,125.04,123.61,122.39,121.88,121.68,59.64.
从表征结果知该中间体化合物II的结构式为：其化学名称为2-(3-氨基苯基)菲并咪唑；
三、中间体化合物III的合成：
将3.0g荧光素加入到反应器中，加入5ml甲醇溶液，加入20ml 50％的氢氧化钠溶液，冷至550℃，缓慢滴加12ml氯仿，搅拌10h，停止反应，冷至25℃。用质量分数为60％的醋酸溶液调pH值至5，抽滤，收集褐色固体，干燥，再柱分离，得到中间体化合物III，中间体化合物III为浅黄色固体，本步骤得到的中间体化合物III的产率为28％；
用红外光谱、核磁氢谱进行表征，得到的结果如下：
IR(KBr)(νmax,cm–1):2928,2853,1727；1H NMR(200MHz,DMSO):δH 11.88(H,s),10.66(H,s),10.27(H,s),8.02(H,d,J＝6.6Hz),7.86–7.69(2H,m),7.32(H,d,J＝6.6Hz),6.96(H,d,J＝8.8Hz),6.85(H,s),6.71(H,d,J＝8.8Hz),6.61(H,s).
从表征结果知该中间体化合物III的结构式为：其化学名称为荧光素单醛；
四、含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的合成：
称取0.3g中间体化合物II和0.36g中间体化合物III，加入到四口瓶中，再加入10ml质量分数为70％的冰乙酸为溶剂，在30℃搅拌反应6h，停止反应，加水淬灭，再用质量分数为40％氢氧化钠溶液调pH值至6，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，用乙酸乙酯重结晶，得到含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针，该pH荧光探针为褐色固体，本步骤中，该pH荧光探针的产率为96％。
测试知本试验合成的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的熔点为303～305℃，质量百分纯度为97％。用红外光谱及核磁共振谱进行表征，得到的结果如下：
IR(KBr)(νmax,cm–1):3432,1757,1637,1603,1466,1391,1353,797,757,693；1HNMR(600MHz,DMSO):δH 14.869(H,s,J＝14.869Hz),13.595(H,s,J＝13.595Hz),10.217(H,s,J＝10.217Hz),9.690(H,s,J＝9.690Hz),8.893(2H,t,J＝8.893Hz),8.643(2H,d,J＝8.643Hz),8.411(H,s,J＝8.411Hz),8.360(H,s,J＝8.360Hz),8.05(H,d,J＝8.05Hz),7.860(H,t,J＝7.860Hz),7.76(5H,q,J＝7.76Hz),7.67(2H,s,J＝7.67Hz),7.36(H,d,J＝7.36Hz),7.032(H,s,J＝7.032Hz)6.857(H,d,J＝6.857Hz)6.789(H,d,J＝6.789Hz)6.699(H,q,J＝6.699Hz)6.584(H,s,J＝6.584Hz)；13C NMR(150MHz,DMSO):δC 168.54,163.87,159.47,158.52,152.17,151.1,150.87,148.31,147.53,135.68,133.30,131.59,130.25,128.86,127.72,127.07,125.97,125.37,124.99,124.68,123.94,123.67,122.27,121.89,121.25,119.75,113.74,113.24,109.30,108.58,106.59,102.84,102.00,82.34.
从以上的表征结果可知，含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式为：
将本试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针进行光谱性能测试。
将1mol本试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针分别加入到1mLpH＝2～12的DMF/HEPES缓冲溶液(DMF/HEPES缓冲溶液中DMF与HEPES的体积比为1/9)中，测试不同pH条件下混合液的紫外光谱图，以波长为横坐标、以吸光度为纵坐标做图如图1所示，从图1可以看出，含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在整个pH范围内在470～550nm处有吸收，pH较低时的最大吸收波长为480nm，随着pH增加，吸光度有所增强，最大吸收波长红移到488nm。
pH＝6.8～8.1的条件下测试的在λ＝470～550nm之间的最大吸光度值与pH值的线性关系曲线图如图2所示，图2中横坐标为pH值，纵坐标为吸光度，该线性曲线的方程为：y＝0.1563x-0.7928，R2＝0.9809。
图3是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH＝2～12的DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9)中，在λ＝470～550nm之间的最大吸光度值与对应pH值的Boltzmann拟合曲线。横坐标为pH值，纵坐标为吸光度。从图3可以看出，当A/Amax＝0.5时，根据公式pKa＝pH±lg((Amax-A)/(A-Amin))，计算出pKa＝6.80±0.11。
图4是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH＝2～6.3的DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9)中，在λex＝488nm、狭缝宽度为2nm的条件下的荧光发射光谱，图4中横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。从图4可以看出，在520nm处有发射峰，荧光强度随pH值增大而增大。
图5是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH＝3～5.7的DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9)中，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与pH值得线性关系图，图5中横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。此线性方程为：y＝129.3794x–404.3453，R2＝0.9435。
图6是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH＝2～6.3的DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9)中，在λex＝488nm，狭缝宽度为2nm的条件，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与对应pH值的Boltzmann拟合曲线。图6中横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。根据公式pKa＝pH±lg((Imax-I)/(I-Imin))，计算出pKa＝4.50±0.06。
图7是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH＝5.6～12的DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9)中，在λex＝488nm、狭缝宽度为2nm条件下的荧光发射光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。从图7可以看出，在525nm处的发射峰的强度随着pH的增大而增大。
图8是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH＝6.7～8.0的DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9)中，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与pH值得线性关系图,横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。从图8可知，荧光强度与pH呈线性关系，此线性方程为：y＝378.8452x-2182.0218，R2＝0.9895。
图9是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在pH＝5.6～12的DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9)中，在λex＝488nm、狭缝宽度为2nm条件下，在λ＝470～650nm之间的最大荧光强度与对应pH值的Boltzmann拟合曲线。图9中横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。根据公式pKa＝pH±lg((Imax-I)/(I-Imin))，计算出pKa＝7.0±0.57。
图10是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm，在pH＝9.0和pH＝2之间的荧光可逆光谱图，横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度。由此可知，该含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的稳定性好，可重复测试。
图11是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝2.0，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm，阳离子对含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针干扰的荧光发射光谱图，横坐标为阳离子，纵坐标为荧光强度。
图12是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，pH＝9.0，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm，阴离子对含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素干扰的荧光发射光谱图，横坐标为阴离子，纵坐标为荧光强度。
图13是试验1制备的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝1/9，λex＝488nm，狭缝宽度为2nm，在pH＝9.0，pH＝2.0两个不同pH条件下的时间稳定荧光光谱图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。从图13可以看出，无论pH是大还是小，含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针加入到溶液中后，从0至18h进行检测，测量值均稳定，说明该二羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的稳定性好。
试验2：本试验与试验1不同的是步骤四中的操作用以下步骤代替：称取0.3g中间体化合物II和0.72g中间体化合物III，加入到三口瓶中，再30mL的质量百分浓度为50％的硫酸溶液作为溶剂，在室温搅拌反应10h，停止反应，加水淬灭，再用质量分数为30％氢氧化钠溶液调pH值至8，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，滤饼用乙酸乙酯重结晶，收集褐色固体，得到含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针。其他步骤与参数与试验1相同。
本试验2的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的产率为75％。
试验3：本试验与试验1不同的是步骤四中的操作用以下步骤代替：称取0.3g中间体化合物II和0.90g中间体化合物III，加入到三口瓶中，再加入50mL的甲酸作为溶剂，在25℃搅拌反应8h，停止反应，加水淬灭，再用质量分数为20％氢氧化钠溶液调pH值至7，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，滤饼用乙酸乙酯重结晶，收集褐色固体，得到含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针。其他步骤与参数与试验1相同。
本试验3的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的产率为50％。
试验4：本试验与试验1不同的是步骤四中的操作用以下步骤代替：称取0.3g中间体化合物II和1.02g中间体化合物III，加入到三口瓶中，再加入50mL的质量百分浓度为37％的浓盐酸作为溶剂，在35℃搅拌反应5h，停止反应，加水淬灭，再用质量分数为20％氢氧化钠溶液调pH值至9，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，滤饼用乙酸乙酯重结晶，收集褐色固体，得到含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针，其他步骤与参数与试验1相同。
本试验4的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的产率为55％。

Claims (9)

1.含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针，其特征在于其结构式为：
2.权利要求1所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、中间体化合物I的合成：
将菲醌、间硝基苯甲醛、苯胺、乙酸铵按照1:(1.0～2.0):(1.0～2.0):(2～5)物质的量的比加入到反应器中，再加入冰乙酸作为溶剂，升温至80～130℃并搅拌4～12h后，冷却至室温，向反应器中加入水，再调pH值至8～10，抽滤，收集黄色固体，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥后得到中间体化合物I，其化学名称为2-(3-硝基苯基)菲并咪唑；
二、中间体化合物II的合成：
称取中间体化合物I、雷尼镍和质量百分浓度为75％～80％的水合肼溶液，其中中间体化合物I的物质的量与雷尼镍的质量的比为1mmol：(0.04～0.11)g；中间体化合物与水合肼的摩尔比为1：(1～1.5)；将l中间体化合物I和雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在25～30℃的温度条件下搅拌，并滴加质量百分浓度为80％的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50～80℃，反应5～10h，冷却至室温，抽滤，并用乙酸乙酯洗涤，收集滤液，浓缩，得到中间体化合物II，其化学名称为2-(3-氨基苯基)菲并咪唑；
三、中间体化合物III的合成：
称取荧光素、质量百分浓度为20～30％的甲醇溶液、质量百分浓度为40％～60％的氢氧化钠溶液和氯仿；其中荧光素的质量与质量百分浓度为10％～20％的甲醇溶液的体积的比为1g：(1～3)ml，荧光素的质量与质量百分浓度为40％～60％的氢氧化钠溶液的体积的比为1g：(5～10)ml，荧光素的质量与氯仿的体积的比为1g：(2.5～5.5)ml；将荧光素加入到反应器中，加入甲醇溶液搅拌均匀，再加入氢氧化钠溶液搅拌均匀，冷至50～60℃，滴加氯仿，搅拌3～12h，停止反应，冷却至25～30℃；调至pH值为4～6，抽滤，收集褐色固体，干燥，柱分离后，得到中间体化合物III荧光素单醛；
四、含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的合成：
按照1:(1～4.5)的物质的量比称取中间体化合物II和中间体化合物III，加入到反应器中，再加入酸性介质为溶剂，25～30℃下搅拌反应4～8h，停止反应，加水淬灭，再用碱性溶液调pH值至6～10，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，得到含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针。
3.根据权利要求2所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于步骤一中的反应温度为95～100℃，反应时间为10～12h。
4.根据权利要求2或3所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于步骤一中调节pH值至7～9。
5.根据权利要求2或3所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于步骤一中调节pH值的溶液为质量分数为30％～40％氢氧化钠溶液、质量分数为50％～60％的碳酸钠溶液、质量分数为50％～70％的碳酸氢钠溶液、质量分数为40％～55％的碳酸钾溶液、质量分数为48％～80％的碳酸氢钾溶液或者质量分数为30％～40％的氢氧化钾溶液。
6.根据权利要求2或3所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于步骤二中反应温度为70～80℃，反应时间为8～9h。
7.根据权利要求2或3所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于步骤三中pH值为8～10。
8.根据权利要求2或3所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于步骤三中调节pH值的溶液为质量分数为50％～70％醋酸溶液。
9.根据权利要求2或3所述的含有两个羟基的菲并咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，其特征在于步骤四中调节pH值的溶液为质量分数为50％～70％醋酸溶液、质量分数为98％的浓硫酸、质量分数为36～37％的浓盐酸、质量分数为50～70％冰乙酸、质量分数为40～50％磷酸、质量分数为30～60％的甲酸或质量分数为10～30％的酸性离子液体。
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