CN108359444A - 一种检测Fe3+并能利用Fe3+检测Ca2+的荧光探针及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

一种用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针及其制备和使用方法，本发明涉及检测Fe³⁺和Ca²⁺的荧光探针及其制备和使用方法。本发明是要解决现有的Fe³⁺荧光探针材料成本较高、易受到其他金属离子干扰、同时检测两种金属离子时荧光现象的区别不明显和不能用于连续检测的技术题。本发明的荧光探针的结构式为：该荧光探针是用2‑(3‑氨基苯基)菲并咪唑和糠醛反应得到。用荧光光谱仪测试荧光探针溶液、可能含有Fe³⁺的样品溶液，如果荧光强度提高则样品中含有Fe³⁺；再将可能含有Ca²⁺的样品溶液加入到含有Fe³⁺的样品溶液中，再测试荧光强度，如果比含有Fe³⁺的样品溶液的强度降低，则证明样品中含有Ca²⁺。本发明的荧光探针可用于Fe³⁺和Ca²⁺检测领域。

Description

一种检测Fe3+并能利用Fe3+检测Ca2+的荧光探针及其制备和使 用方法

技术领域

本发明涉及检测Fe³⁺和Ca²⁺的荧光探针及其制备和使用方法。

背景技术

铁是人体中最重要的微量元素之一，人体内铁缺乏会引起多种疾病，但是过量的铁也会存在潜在的危害；钙对人体所有细胞功能的发挥起着重要的生理调节作用，钙在人体内含量不足或是过剩都会影响人体生长发育和健康。因此对Fe³⁺和Ca²⁺进行定性和定量检测具有非常重要的意义。近年来，采用荧光探针对Fe³⁺进行定量和定性检测的研究方法受到了很多研究者的关注。2013年，《传感器和执行器B：化学》(Sensors and Actuators B:Chemical)2011年160卷第1期的1106-1111页的《通过双模的键合方式形成的多功能识别Cu²⁺和Fe³⁺的荧光探针》公开了一种芳胺类席夫碱化合物，该化合物通过荧光变化对Fe³⁺和Cu²⁺实现识别检测功能，但是当Fe³⁺和Cu²⁺同时存在时，无法通过荧光光谱方法明显区别Fe³⁺和Cu²⁺。除了理论研究外，也有文献报道了采用荧光探针对实际水样中Fe³⁺进行检测的方法。文献《微生物学报》(Mircrochimica Acta)的2017年第184卷第12期的4695-4707页《一种简单的萘胺荧光探针在混合水溶液中选择性识别Hg²⁺、Fe²⁺和Fe³⁺:生物细胞及逻辑门方面的应用》公开了一种纳米金材料通过荧光光谱对Fe³⁺的检测，探针对Fe³⁺检测限为450nM，该检测限低于美国环境保护学会公布的饮用水中的Fe³⁺检测限，并通过荧光光谱法定量检测了实际水样中的中的Fe³⁺浓度，但是该纳米金材料成本较高，且并没有报道纳米金材料的回收或再利用。此外，公开号为CN107312022A的中国专利公开了一种用于Fe³⁺检测的荧光素罗丹明B双Schiff碱紫外分子探针及其合成和使用方法，该探针是采用紫外光谱的变化实现对Fe³⁺检测，由于紫外光谱的灵敏性较低，使得这类紫外探针的实际应用受到了限制。目前，Ca²⁺荧光探针的种类较少。文献《高等学校化学学报》2008年29卷第10期的文章《一种新型荧光素类Ca²⁺荧光探针的合成》报道了一种Ca²⁺荧光探针，但该探针识别Ca²⁺时对其他金属离子的抗干扰能力不强，且合成步骤复杂，产率较低。

根据目前的文献报道，Fe³⁺荧光探针主要存在以下三个缺陷：

1.虽然Fe³⁺荧光探针的种类较多，但是多数探针同时识别多种金属离子，选择性较差；

2.荧光探针同时检测Fe³⁺和其他金属离子时，荧光现象的区别不明显；

3.荧光探针只能单一检测Fe³⁺，不能用于连续检测Ca²⁺；

4.大部分Fe³⁺荧光探针的成本较高，在实际应用中受到限制；

5.目前Ca²⁺荧光探针的种类和数量均较少，且对其他金属离子的抗干扰能力弱。

发明内容

本发明是要解决现有的Fe³⁺荧光探针材料成本较高，易受到其他金属离子干扰，同时检测两种金属离子时荧光现象的区别不明显，而且不能用于连续检测其他金属离子的技术问题，而提供一种检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针及其制备和使用方法。

本发明的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的结构式为：

上述的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法是采用2-(3-氨基苯基)菲并咪唑和糠醛反应得到，反应式如下：

具体的合成方法为：

按照2-(3-氨基苯基)菲并咪唑和糠醛的物质的量比为1:(1～3)的比例，将2-(3-氨基苯基)菲并咪唑和糠醛加入到醇类溶剂中，搅拌反应1～4h，反应结束后有固体析出；抽滤，再将滤饼用醇类溶剂洗涤干净，收集滤饼并干燥，得到粗产物；粗产物用有机溶剂重结晶，得到用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针。

利用上述的荧光探针检测Fe³⁺的方法，按以下步骤进行：

一、将用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针溶解于混合溶剂中，得到荧光探针溶液；其中混合溶剂是N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液按体积比为9：(1～5)的混合液；HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，荧光探针溶液中荧光探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取荧光探针溶液，向其中加入含有金属离子的待测样品1，混合均匀，得到样品溶液1；

三、用荧光光谱仪测试荧光探针溶液在发射波长为400nm处的发射强度为B₀；再测试样品溶液1在发射波长为400nm处的发射强度为B₁；如果B₁≥9B₀，则判定测试的待测样品1中含有Fe³⁺。

利用上述的荧光探针检测Ca²⁺的方法，按以下步骤进行：

一、将用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针溶解于混合溶剂中，得到荧光探针溶液；其中混合溶剂是N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液按体积比为9：(1～5)的混合液；HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，荧光探针溶液中荧光探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取荧光探针溶液，向其中加入含有Fe³⁺离子溶液，混合均匀，得到Fe³⁺溶液；用荧光光谱仪测试Fe³⁺溶液在发射波长为400nm处的发射强度为B₂；

三、向Fe³⁺溶液中加入含有金属离子的待测样品2，混合均匀，得到样品溶液2；用荧光光谱仪测试样品溶液2在发射波长为400nm处的发射强度为B₃；如果B₃≤B₂/18，则判定待测样品2中含有Ca²⁺。

本发明的这种荧光探针可实现在水环境体系中对Fe³⁺和Ca²⁺的检测，不受水溶液中其他金属离子的干扰，具有较强的抗干扰能力。该荧光探针在pH值为3～11范围内均可实现对Fe³⁺和Ca²⁺的检测，如果在检测时先检测出Fe³⁺，表现为待测溶液中含有Fe³⁺时荧光强度增强，再向荧光增强的测试样品中加入第二种测试样品，若荧光强度明显下降，说明第二种测试样品中含有Ca²⁺，就实现了Fe³⁺和Ca²⁺的连续检测。该荧光探针检测Fe³⁺和Ca²⁺的方法简单，响应明显、迅速，具有连续检测水体系环境中的Fe³⁺和Ca²⁺的能力。

该荧光探针的合成方法简单，成本低，步骤简单，反应条件温和，产率高达70～95％。

附图说明

图1是实施例1中在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中，实施例1制备的荧光探针及其与10μmol/L的不同阳离子(Fe³⁺、Al³⁺、Cr³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、K⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺或Ni²⁺)共存时的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

图2是实施例1中在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中，实施例1制备的荧光探针检测Fe³⁺后的抗金属阳离子干扰(Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺Mg²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、K⁺、Cr³⁺、Co²⁺或Cd²⁺)的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

图3是实施例1中在DMF/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中，实施例1制备的荧光探针在检测Fe³⁺后，连续检测Ca²⁺的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的结构式为：

具体实施方式二：具体实施方式一的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：

按照2-(3-氨基苯基)菲并咪唑和糠醛的物质的量比为1:(1～3)的比例，将2-(3-氨基苯基)菲并咪唑和糠醛加入到醇类溶剂中，搅拌反应1～4h，反应结束后有固体析出；抽滤，再将滤饼用醇类溶剂洗涤干净，收集滤饼并干燥，得到粗产物；粗产物用有机溶剂重结晶，得到用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇；其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是洗涤滤饼的醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇；其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是粗产物重结晶溶剂为乙酸乙酯、乙酸乙酯和石油醚的混合物、乙酸乙酯和正己烷的混合物或乙酸乙酯与二氯甲烷的混合物；其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是重结晶溶剂乙酸乙酯和石油醚的混合物中乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：(1～5)；重结晶溶剂乙酸乙酯和正己烷的混合物中乙酸乙酯与正己烷的体积比为1：(1～5)；重结晶溶剂乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物中乙酸乙酯和二氯甲烷的的体积比为1：(1～5)。其它与具体实施方式五相同。

具体实施方式七：具体实施方式一所述的荧光探针检测Fe³⁺的方法，按以下步骤进行：

一、将用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针溶解于混合溶剂中，得到荧光探针溶液；其中混合溶剂是N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液按体积比为9：(1～5)的混合液；HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，荧光探针溶液中荧光探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取荧光探针溶液，向其中加入含有金属离子的待测样品1，混合均匀，得到样品溶液1；

三、用荧光光谱仪测试荧光探针溶液在发射波长为400nm处的发射强度为B₀；再测试样品溶液1在发射波长为400nm处的发射强度为B₁；如果B₁≥9B₀，则判定待测样品1中含有Fe³⁺。

具体实施方式八：利用具体实施方式一所述的荧光探针检测Ca²⁺的方法，按以下步骤进行：

一、将用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针溶解于混合溶剂中，得到荧光探针溶液；其中混合溶剂是N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液按体积比为9：(1～5)的混合液；HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，荧光探针溶液中荧光探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取荧光探针溶液，向其中加入Fe³⁺离子，混合均匀，得到Fe³⁺溶液；用荧光光谱仪测试Fe³⁺溶液在发射波长为400nm处的发射强度为B₂；

三、向Fe³⁺溶液中加入含有金属离子的待测样品2，混合均匀，得到样品溶液2；用荧光光谱仪测试样品溶液2在发射波长为400nm处的发射强度为B₃；如果B₃≤B₂/18，则判定待测样品2中含有Ca²⁺。

用以下实例验证本发明的有益效果：

实施例1：本实施例的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备按以下方法进行：

分别将2-(3-氨基苯基)菲并咪唑1.55g(5.0mmol)，糠醛0.40mL(5.0mmol)加入到20mL乙醇中，常温搅拌反应2.0h，反应结束后有固体析出；抽滤，滤饼用乙醇洗涤五次，收集滤饼并干燥，得到粗产物；粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针，该荧光探针的产率为90％。熔点为230～231℃。

用红外光谱及核磁共振谱进行表征，得到的结果如下：

IR(KBr,cm^–1):3435,3012,1628,1588,1573,1459,889,753,726.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:6.78(d,J＝7.20Hz,H,ArH),7.27(d,J＝3.00Hz,H,ArH),7.40(d,J＝7.80Hz,H,ArH),7.62～7.78(m,3H,ArH),7.72～7.78(m,2H,ArH),8.21(d,J＝7.20Hz,2H,ArH),8.03(s,H,N＝CH),8.21(d,J＝7.20Hz,1H,ArH),8.57(d,J＝7.80Hz,1H,ArH),8.61(d,J＝7.80Hz,1H,ArH),8.63(s,1H,ArH),8.86(d,J＝8.40Hz,1H,ArH),8.89(d,J＝8.40Hz,1H,ArH),13.50(s,1H,ArH).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:152.4,152.4,148.5,149.2,147.3,137.5,131.9,130.5,128.2,128.2,128.0,127.7,127.6,127.4,125.9,125.7,124.7,124.3,122.9,122.5,122.4,121.9,119.3,118.0,113.2.

从以上的表征结果可知，用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的结构式为：

将本实施例制备的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针进行光谱性能测试，步骤如下：

一、储备液的配置

以DMF为溶剂，将用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针配制成浓度为1.0×10^–4mol/L的探针储备液，备用；

以pH＝7.4的HEPES为溶剂，用金属氯化盐和硝酸盐配制成浓度为0.10mol/L的金属阳离子储备液，备用；

HEPES缓冲溶液的配置：秤取0.60g的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸加入250mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，配成0.01mol/L的溶液并摇匀，静止3h后，用氢氧化钠溶液调pH值，配成pH值为7.4缓冲溶液。摇匀，备用。

二、光谱性能测试

将本实施例制备的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针及其与不同金属离子的荧光光谱测定方法如下：在DMF/HEPES缓冲溶液的体积比为9:1的体系中(pH＝7.4)，分别向探针溶液中加入浓度为0.10mol/L的Fe³⁺、Al³⁺、Cr³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、K⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺或Ni²⁺待测金属阳离子，探针与待测金属阳离子的物质的量比为1:10，恒温2h后，以325nm为激发波长，在激发狭缝宽度为15nm的情况下，并分别测定荧光探针和探针加入金属离子后荧光发射光谱，结果如图1所示。从图1中可知，探针的荧光发射波长为400nm，荧光强度为25a.u.。加入不同阳离子后(Zn²⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、K⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺或Ni²⁺)，探针的荧光强度改变不大，强度均在25a.u.左右。加入Al³⁺、Cr³⁺后荧光强度有所增加，强度达到110、95a.u.，而加入Fe³⁺时，荧光强度明显增强，增强到285a.u.，增强程度为探针荧光强度的11.4倍。因此，从荧光发射光谱可以初步推测，探针化合物对Fe³⁺具有选择识别检测的特性。

本实施例制备的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针在Fe³⁺检测时抗金属离子干扰能力的测试方法如下：在DMF/HEPES缓冲溶液的体积比为9:1的体系中(pH＝7.4)，分别向浓度为1.0×10^-5mol/L的探针溶液中加入浓度为0.10mol/L的Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、K⁺、Cr³⁺、Co²⁺和Cd²⁺离子溶液充分混合后静置5min，再分别加入0.10mol/L的Fe³⁺后混合均匀。此时，探针、其他金属离子、Fe³⁺三者的物质的量比为1:10:10。恒温2h后，在激发波长为325nm，激发狭缝宽度为15nm的情况下，对其进行荧光发射光谱的测试，结果如图2所示。在其他阳离子(Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba^{2 +}、Ni²⁺、K⁺、Cr³⁺、Co²⁺和Cd²⁺)存在的情况下，Fe³⁺与其他阳离子共存时，探针与Fe³⁺作用后的荧光强度并不受其他阳离子的影响。荧光强度的增强倍数仍维持在探针强度的11.4倍左右，即探针对Fe³⁺的检测不受其他金属离子的干扰。

本实施例制备的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针在检测Fe³⁺后，再连续检测Ca²⁺的方法如下：取DMF/HEPES的体积比为9:1的体系中(pH＝7.4)，浓度为1.0×10^-5mol/L的探针溶液，向探针溶液中加入浓度为0.10mol/L Fe³⁺溶液，再加入0.10mol/L的Ca²⁺溶液，后混合均匀。此时，探针、Fe³⁺、Ca²⁺三者的物质的量比为1:10:10。恒温2h后，在激发波长为325nm，激发狭缝宽度为15nm的情况下，对其进行荧光发射光谱的测试，结果如图3所示。探针在400nm处的荧光强度为25a.u.，加入Fe³⁺后荧光强度迅速增强到285a.u.，再加入Ca²⁺后，荧光强度迅速下降，Ca²⁺与探针的物质的量为10时，荧光强度下降到12a.u.。这说明该探针具有连续检测Fe³⁺和Ca²⁺的能力。

以上结果说明该探针在实际水样的离子检测中具有重要的应用意义。本实施例制备的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针，在DMF/HEPES的体积比为9:1的体系中(pH＝7.4)，通过荧光增强现象检测Fe³⁺，且其他金属离子共存时，不干扰该探针对检测Fe³⁺的检测；随后加入Ca²⁺，荧光强度又恢复到与探针相当的荧光强度，即通过从探针的低荧光强度，到检测Fe³⁺的高荧光强度，再到检测Ca²⁺的低荧光强度变化实现探针对Fe³⁺和Ca²⁺的连续检测。

实施例2：本实施例与实施例1与不同的是用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法用以下操作代替：

分别将2-(3-氨基苯基)菲并咪唑1.55g(5.0mmol)，糠醛0.80mL(10.0mmol)加入到20mL甲醇中，常温搅拌反应4.0h，反应结束后有固体析出。抽滤，滤饼用甲醇洗涤5次，收集滤饼并干燥得到粗产物。粗产物用乙酸乙酯与石油醚的体积比为1：1的混合物重结晶，得到用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针，该荧光探针的产率为88％。

实施例3：本实施例与实施例1与不同的是用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法用以下操作代替：

分别将2-(3-氨基苯基)菲并咪唑1.55g(5.0mmol)，糠醛1.20mL(15.0mmol)加入到20mL异丙醇中，常温搅拌反应3.0h，反应结束后有固体析出。抽滤，滤饼用乙醇多次洗涤，收集滤饼并干燥得到粗产物。粗产物用乙酸乙酯与环己烷的体积比为1：2的混合物重结晶，得到用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针，该荧光探针的产率为82％。

实施例4：本实施例与实施例1与不同的是用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法用以下操作代替：

分别将2-(3-氨基苯基)菲并咪唑1.55g(5.0mmol)，糠醛0.6mL(7.5mmol)加入到20mL丁醇中，常温搅拌反应1.0h，反应结束后有固体析出。抽滤，滤饼用甲醇多次洗涤，收集滤饼并干燥得到粗产物。粗产物用乙酸乙酯与二氯甲烷的体积比为1：3的混合物重结晶，得到用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针，该荧光探针的产率为70％。

Claims (7)

1.一种用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式为：

2.权利要求1所述的一种用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

按照2-(3-氨基苯基)菲并咪唑和糠醛的物质的量比为1:(1～3)的比例，将2-(3-氨基苯基)菲并咪唑和糠醛加入到醇类溶剂中，搅拌反应1～4h，反应结束后有固体析出；抽滤，再将滤饼用醇类溶剂洗涤干净，收集滤饼并干燥，得到粗产物；粗产物用有机溶剂重结晶，得到用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法，其特征在于醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。

4.根据权利要求2或3所述的一种用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法，其特征在于洗涤滤饼的醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。

5.根据权利要求2或3所述的一种用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针的制备方法，其特征在于粗产物重结晶溶剂为乙酸乙酯、乙酸乙酯和石油醚的混合物、乙酸乙酯和正己烷的混合物，或乙酸乙酯与二氯甲烷的混合物。

6.利用权利要求1所述的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针检测Fe³⁺的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、将用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针溶解于混合溶剂中，得到荧光探针溶液；其中混合溶剂是N,N-二甲基甲酰胺与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液按体积比为9：(1～5)的混合液；HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，荧光探针溶液中荧光探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取荧光探针溶液，向其中加入含有金属离子的待测样品1，混合均匀，得到样品溶液1；

三、用荧光光谱仪测试荧光探针溶液在发射波长为400nm处的发射强度为B₀；再测试样品溶液1在发射波长为400nm处的发射强度为B₁；如果B₁≥9B₀，则判定待测样品1中含有Fe³⁺。

7.利用权利要求1所述的用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针检测Ca²⁺的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、将用于检测Fe³⁺并能利用Fe³⁺检测Ca²⁺的荧光探针溶解于混合溶剂中，得到荧光探针溶液；其中混合溶剂是N,N-二甲基甲酰胺与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液按体积比为9：(1～5)的混合液；HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，荧光探针溶液中荧光探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取荧光探针溶液，向其中加入Fe³⁺离子，混合均匀，得到Fe³⁺溶液；用荧光光谱仪测试Fe³⁺溶液在发射波长为400nm处的发射强度为B₂；

三、向Fe³⁺溶液中加入含有金属离子的待测样品2，混合均匀，得到样品溶液2；用荧光光谱仪测试样品溶液2在发射波长为400nm处的发射强度为B₃；如果B₃≤B₂/18，则判定待测样品2中含有Ca²⁺。