CN106905235A - 过氧亚硝酸根离子检测探针、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种过氧亚硝酸根离子检测探针，所述过氧亚硝酸根离子检测探针AH‑1，分子式为C20H15NO2。本发明还公开了所述过氧亚硝酸根离子检测探针的制备方法及其应用。本发明提供的过氧亚硝酸根离子检测探针的分子结构中包含一个9,10‑二氢吖啶(DHAC)响应单元，探针本身无荧光，当与过氧亚硝酸根离子反应后，可以生成具有荧光的产物，且该检测过程具有反应迅速、灵敏，专一性好的特点。同时，该探针合成简单，易于修饰，具有很好的生物相容性，可用于生物体系中内源型过氧亚硝酸根离子的检测。

Description

过氧亚硝酸根离子检测探针、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于离子探针技术领域，具体涉及一种可用于生物体系中内源型过氧亚硝酸根离子检测探针、制备方法及其应用。
背景技术
过氧亚硝酸根离子(ONOO-)是人体内一种具有极高反应活性的强氧化性物质，线粒体是产生该物质的主要细胞器。它由体内的一氧化氮(NO)和超氧阴离子(·O2 -)反应生成，该反应速度快，且不需要酶参与。过氧亚硝酸根离子可以和多种生物分子反应并参与很多生理过程，因此，过氧亚硝酸根离子与众多疾病相关，如休克、动脉粥样硬化、缺血-再灌注损伤、老年痴呆、免疫系统病等。但是近年来一些研究表明，过氧亚硝酸根离子在免疫及神经信号传导等方面也会产生积极作用。因此，生物体内过氧亚硝酸根离子的检测及生物成像对生理学研究有重要意义。
但是，由于过氧亚硝酸根离子活性高、半衰期短、代谢产物复杂，因此其检测具有一定难度。目前大多数过氧亚硝酸根离子检测的荧光探针都存在反应速度较慢、灵敏度较差、选择性较差等缺点。因此，制备新型高效过氧亚硝酸根离子检测探针，尤其是开发新的响应单元具有重要意义。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，以9,10-二氢吖啶(DHAC)为响应开关可作为过氧亚硝酸根离子检测探针，在体外或细胞内可快速、专一地检测过氧亚硝酸根离子。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种过氧亚硝酸根离子检测探针，其能够在体外或细胞内检测过氧亚硝酸根离子，具有很好的专一性和灵敏度。
本发明还有一个目的是提供过氧亚硝酸根离子检测探针的合成方法，以及该过氧亚硝酸根离子检测探针体外或细胞内检测过氧亚硝酸根离子的具体方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1，所述过氧亚硝酸根离子检测探针的结构式如下：
本发明的目的还可以进一步由过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1的制备方法来实现，该方法的合成路线如下：
所述方法具体步骤包括：
步骤i、冰水浴下，称取邻碘苯甲酸和浓硫酸于圆底烧瓶中，将过硫酸钾分批加入所述圆底烧瓶中，反应30分钟后，加入苯，室温下剧烈搅拌5小时后，将所述圆底烧瓶中混合物倒在碎冰上，用氢氧化钠溶液调节pH大于10后，二氯甲烷萃取，分离有机相，经洗涤、干燥后，减压蒸馏除去溶剂得到化合物1；
步骤ii、称取所述步骤i得到的化合物1、2-氨基二苯甲酮以及催化剂于两口瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺使之溶解，在氩气气氛下加热反应5小时后，减压蒸馏除去溶剂，向残留物中加入冰醋酸和浓硫酸，加热反应1小时后，将所述两口瓶中混合物倒入冰水中，抽滤并向滤液中加入碱中和酸，抽滤，得到的滤渣通过柱层析分离得到化合物A-1；
步骤iii、称取所述步骤ii得到的化合物A-1于无水乙醇中，加入还原剂，在氩气气氛下室温反应1小时后，加入盐酸淬灭反应，再加入碱去除残余的酸，将反应体系倒入水中，抽滤，滤渣重结晶后得到过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1。
优选的是，其中，在所述步骤i中，所述氢氧化钠溶液的浓度为4～8M。
优选的是，其中，在所述步骤ii中，所述催化剂为醋酸铜，碱为吡啶，氩气气氛下加热温度为90～140℃，加入冰醋酸和浓硫酸后，加热温度为90～110℃。
优选的是，其中，在所述步骤ii中，氩气气氛下加热温度为120℃，加入冰醋酸和浓硫酸后，加热温度为100℃。
优选的是，其中，在所述步骤iii中，所述盐酸的浓度为2M，碱为吡啶，重结晶所用的溶剂为丙酮/正己烷混合溶剂体系。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，还提供了所述过氧亚硝酸根离子检测探针在中性或酸性水溶液中过氧亚硝酸根离子的荧光检测中的应用，其中，当过氧亚硝酸根浓度为探针浓度0～1当量时，体系荧光强度与过氧亚硝根离子浓度成线性关系。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，还提供了所述过氧亚硝酸根离子检测探针在活细胞中过氧亚硝酸根离子的检测中的应用。
优选的是，其中，所述活细胞为RAW264.7细胞株。
本发明至少包括以下有益效果：
1、通过三步反应合成一种过氧亚硝酸根离子检测针AH-1，该反应操作简单，且可以根据具体需求预先对各单体模块进行修饰，最后组合得到一系列具有不同性能探针分子，如提高探针靶向性、改变荧光发射波长等，合成方法可拓展性强；
2、过氧亚硝酸根离子检测针AH-1对过氧亚硝酸根离子的响应具有很好的专一性；
3、过氧亚硝酸根离子检测针AH-1对过氧亚硝酸根离子的响应具有很好的灵敏度；
4、过氧亚硝酸根离子检测针AH-1对过氧亚硝酸根离子的响应速度极快；
5、过氧亚硝酸根离子检测针AH-1及其代谢产物A-1毒性很小，具有很好的生物相容性，因而具有较大的实际应用价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施中探针AH-1及其代谢产物A-1的紫外、荧光光谱图；
图2为本发明其中一个实施例中探针在1当量过氧亚硝酸根离子作用下，荧光发射光谱496nm处强度随时间变化曲线示意图；
图3为本发明其中一个实施例中探针与不同当量过氧亚硝酸根离子充分反应后，荧光发射光谱496nm处强度随时间变化曲线示意图；
图4为本发明其中一个实施例中探针与不同当量过氧亚硝酸根离子充分反应后的荧光发射光谱示意图；
图5为本发明其中一个实施例中探针与1当量不同活性氧化物(ROS)反应后，荧光发射光谱496nm处的强度示意图；
图6为本发明其中一个实施例中不同pH条件下，AH-1、A-1以及AH-1与1当量过氧亚硝酸根离子作用后荧光发射光谱496nm处的强度示意图；
图7为本发明其中一个实施例中探针AH-1及其代谢产物A-1的细胞毒性图；
图8为本发明实施中探针AH-1对细胞内过氧亚硝酸根离子检测的效果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实例1>
一种过氧亚硝酸根离子检测探针，所述过氧亚硝酸根离子检测探针的结构式如下：
上述过氧亚硝酸根离子检测探针的制备方的合成路线如下：
所述制备方法的具体步骤包括：
步骤i冰水浴下，将2-碘苯甲酸(12.4g,50mmol)溶于50mL 98％硫酸中。将过硫酸钾(27.1g,100mmol)分批加到上述体系中，然后继续搅拌30分钟；加入苯(17.8mL,200mmol)；室温搅拌5小时，然后将反应物倒在200g碎冰上，用5M NaOH调节pH>10，然后用二氯甲烷萃取；有机相用300mL二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂，得到化合物1为13.0g白色固体，产率80％；
步骤ii将化合物1(10.7g,33mmol)，2-氨基二苯甲酮(5.9g,30mmol)和醋酸铜(0.6g,3mmol)加到30mL DMF中，氮气保护下加热到120℃，然后继续搅拌5小时；减压蒸馏除去溶剂，残留物溶于30mL冰醋酸和10mL98％硫酸的混合溶剂中，加热至100℃，继续搅拌1小时；冷却，将反应物倒入200mL冰水中；抽滤，向滤液中加入30mL吡啶，抽滤，滤渣以石油醚：乙酸乙酯＝3:1为洗脱剂，通过硅胶柱纯化，得到化合物A-1为1.6g黄色固体，产率19％；
步骤iii将化合物A-1(598mg,2mmol)溶于10mL乙醇中，加入硼氢化钠(152mg,4mmol)；氮气保护下，室温搅拌1小时；向反应体系中加入0.5mL 2M HCl淬灭反应，再加入0.5mL吡啶除去残余的盐酸，然后将反应物倒入50mL水中；抽滤，滤渣用丙酮/正己烷重结晶，得到化合物AH-1为572mg淡黄色固体，产率95％；
化合物1的结构式及表征如下：
Mp.229～230℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(d,J＝6.4Hz,1H),8.00(d,J＝7.0Hz,2H),7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.57(dt,J＝14.8,7.5Hz,3H),7.37(d,J＝7.1Hz,1H),6.74(d,J＝8.3Hz,1H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ165.84,137.26,134.49,133.52,132.19,131.57,130.31,127.38,116.86,115.97；ESI-MS:m/z C13H10IO2[M+H]+,calcd.324.98,found 324.98.
化合物A-1的结构式及表征如下：
Mp.183～184℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.77(dd,J＝7.0,1.5Hz,1H),8.42–8.35(m,1H),8.11–8.02(m,1H),7.95(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.82–7.67(m,6H),7.60–7.51(m,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.57,151.15,145.40,145.24,136.50,134.24,133.27,132.36,130.23,129.35,128.89,127.58,127.53,127.00,126.18,124.76,124.74,123.83；ESI-HRMS:m/zC20H14NO2[M+H]+,calcd.300.1019,found 300.1021.
化合物AH-1的结构式及表征如下：
Mp.236～238℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.17(s,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),7.38(d,J＝7.4Hz,1H),7.28–7.06(m,7H),7.01(d,J＝8.1Hz,1H),6.85(dt,J＝12.5,7.5Hz,2H),5.41(s,1H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.99,147.64,141.69,137.59,134.69,129.92,129.16,128.72,127.65,127.10,126.37,125.02,123.24,121.61,119.16,115.18,111.49,46.25；ESI-HRMS:m/zC20H16NO2[M+H]+,calcd.302.1175,found 302.1179.
<实例2>
与实施例1的不同之处是，在制备方法步骤ii中，氩气气氛下加热温度为90℃，加入冰醋酸和浓硫酸后，加热温度为90℃，其余与实施例1相同，在此不再赘述。
<实例3>
与实施例1的不同之处是，在制备方法步骤ii中，氩气气氛下加热温度为140℃，加入冰醋酸和浓硫酸后，加热温度为110℃，其余与实施例1相同，在此不再赘述。
<实例4>
过氧亚硝酸根离子储备液的制备：
将50mL碱性过氧化氢溶液(pH≈12)与等摩尔亚硝酸异戊酯混合，冰浴下搅拌4小时，然后将反应液用正己烷萃取2次，去除有机相，水相中加入二氧化锰除去残余的过氧化氢，抽滤，得到的滤液即为过氧亚硝酸根浓溶液，其浓度利用其在302nm处的吸光度与摩尔吸光系数(ε302＝1670M-1cm-1)计算。浓溶液用10mM氢氧化钠溶液稀释至过氧亚硝酸根浓度为20mM，在-20℃冰箱中保存备用。
<实例5>
由实施例1中过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1及其代谢产物A-1的紫外和荧光光谱测定：
分别配制化合物AH-1和A-1的DMSO溶液(2mM)。用PBS缓冲溶液(pH 7.4,50mM)稀释至10μM，分别测定其紫外光谱。再将化合物AH-1和A-1稀释至2μM，分别测定其荧光光谱，如图1所示。以358nm为激发波长，化合物A-1的最大发射波长为496nm。而探针在此波长光束激发下几乎没有荧光发射，说明探针AH-1符合“点亮型”探针特点。
<实例6>
由实施例1中过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1在体外环境对过氧亚硝酸根离子的检测：
向AH-1的PBS溶液(2μM)中加入1当量过氧亚硝酸根离子，荧光动力学测试发现496nm处荧光强度迅速增强，在约几秒钟后荧光不再增强，如图2所示。这说明探针AH-1对过氧亚硝酸根离子响应速度很快，可以在几秒钟内完成。
向AH-1的PBS溶液(2μM)中加入不同浓度过氧亚硝酸根离子溶液(0～4μM)，体系荧光光谱如图3所示。可以观察到，随着过氧亚硝酸根离子浓度增加，体系荧光逐渐增强。体系荧光发射光谱在496nm处荧光强度随过氧亚硝酸根离子浓度变化的曲线如图4所示。从图中可以看出，过氧亚硝酸根离子浓度在0～2μM(0～1当量)变化时，该浓度与体系荧光强度呈良好的线性关系(R2＝0.999)。由此拟合直线的斜率，通过公式3s/k可以计算出探针对过氧亚硝酸根离子的检出限约为16nM，说明探针AH-1对过氧亚硝酸根离子的检测具有极高的灵敏度。
<实例7>
由实施例1中过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1在体外环境对不同活性氧化物(ROS)的选择性实验：
向AH-1的PBS溶液(2μM)中加入不同活性氧化物(第10组为过氧亚硝酸根，2μM,1当量；2～9为加入其他活性氧化物的对照组，20μM,10当量；第1组为空白对照组)，作用30分钟后，各实验组在496nm处荧光强度如图5所示。说明探针AH-1对过氧亚硝酸根离子具有很好的选择性。
<实例8>
实施例1中过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1在不同pH条件下对过氧亚硝酸根离子的检测：
不同pH条件下，分别测定1)探针AH-1，2)代谢产物A-1以及3)探针AH-1与1当量过氧亚硝酸根离子反应后的溶液荧光强度，各实验组在496nm处荧光强度随pH变化曲线如图6所示，说明探针在生理pH条件下有较好的适用性，尤其是在酸性条件下具有很好的适用性，这可以赋予探针检测癌细胞内过氧亚硝酸根离子的能力。
<实例9>
实施例1中过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1及其代谢产物A-1的细胞毒性分析：
为了测定型过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1及其代谢产物A-1的生物相容性，我们利用Raw264.7小鼠巨噬细胞，通过MTT法测定其细胞毒性。细胞在每孔104数量级的96孔板中进行种植培养。生长环境为含有5％二氧化碳的空气气氛，温度为37℃。在对数级增长阶段进行收割，然后将细胞分组，分别用2μM,10μM,20μM,40μM浓度的AH-1及A-1与细胞作用，培养12小时后，加入MTT的PBS溶液(20μL,5mg/mL)，继续培养4小时。除去残留的培养基，向每组中加入100μL DMSO，通过酶标仪在490nm处对每组细胞进行检测。
各实验组的细胞毒性分析见图7。可见，即使在较高浓度下，细胞存活性依然很高，可以达到80％以上，说明探针AH-1及其代谢产物A-1细胞毒性均很低，具有很好的生物相容性。
<实例10>
实施例1中过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1对细胞内过氧亚硝酸根离子的检测：
为了测定新型过氧亚硝酸根离子检测针AH-1对细胞内过氧亚硝酸根离子的检测，选取生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7进行细胞实验。细胞在含有5％二氧化碳的空气气氛，温度为37℃的环境下培养24h，然后分为以下四组：
1)对照组(A-1+DOPE)，实验结果如图8A；
2)对照组(AH-1+DOPE)，实验结果如图8B；
3)加入过氧亚硝酸根离子供体SIN-1(1mM)作用30分钟，作为外源型过氧亚硝酸根离子，实验结果如图8C；
4)加入脂多糖(LPS，1μg/mL)和γ-干扰素(IFN-γ，50ng/mL)作用4小时，刺激产生内源型过氧亚硝酸根离子，实验结果如图8D；
5)加入脂多糖(LPS，1μg/mL)和γ-干扰素(IFN-γ，50ng/mL)，同时加入氨基胍(AG，1mM)作用4小时，阻断内源型过氧亚硝酸根离子产生，实验结果如图8E；
6)加入双氧水(50μL)作用30分钟，实验结果如图8F；
7)加入次氯酸钠(50μL)作用30分钟，实验结果如图8G；
8)加入一氧化氮储备液(50μL)作用30分钟，实验结果如图8H；
9)加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA，10nM)作用30分钟，刺激产生内源型羟基自由基，实验结果如图8I；
然后向上述各实验组中分别加入探针AH-1(5μM)和等当量的DOPE，继续作用15分钟。无论细胞中有内源型或外源型过氧亚硝酸根离子，都可以在绿色通道下观察到较强的荧光。而当细胞内无外界刺激产生过氧亚硝酸根离子，或者产生过氧亚硝酸根离子的过程被阻断时，只能观察到微弱的荧光。作为对照组加入其它内源型或外源型氧化物，如双氧水、次氯酸钠、一氧化氮和羟基自由基时，也不能在绿色通道下观察到荧光，如图8所示。说明该新型过氧亚硝酸根离子检测针AH-1可用于检测细胞内过氧亚硝酸根离子，同时仍具有很好的选择性。
综上所述，本发明提供了一种过氧亚硝酸根离子检测针，其合成方法简单，且该方法拓展性强，同时本发明也提供了该探针检测体外或细胞内过氧亚硝酸根离子的具体方法，且通过系列实验证明该探针对过氧亚硝酸根离子的响应迅速，具有极好的灵敏度和选择性，并且可在较宽的pH范围内使用。同时，该探针在生物体内过氧亚硝酸根离子检测领域也有很好的应用前景。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种过氧亚硝酸根离子检测探针，所述过氧亚硝酸根离子检测探针的结构式如下：
2.一种制备权利要求1所述的过氧亚硝酸根离子检测探针的方法，其合成路线如下：
所述方法具体步骤包括：
步骤i、冰水浴下，称取邻碘苯甲酸和浓硫酸于圆底烧瓶中，将过硫酸钾分批加入所述圆底烧瓶中，反应30分钟后，加入苯，室温下剧烈搅拌5小时后，将所述圆底烧瓶中混合物倒在碎冰上，用氢氧化钠溶液调节pH大于10后，二氯甲烷萃取，分离有机相，经洗涤、干燥后，减压蒸馏除去溶剂得到化合物1；
步骤ii、称取所述步骤i得到的化合物1、2-氨基二苯甲酮以及催化剂于两口瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺使之溶解，在氩气气氛下加热反应5小时后，减压蒸馏除去溶剂，向残留物中加入冰醋酸和浓硫酸，加热反应1小时后，将所述两口瓶中混合物倒入冰水中，抽滤并向滤液中加入碱中和酸，抽滤，得到的滤渣通过柱层析分离得到化合物A-1；
步骤iii、称取所述步骤ii得到的化合物A-1于无水乙醇中，加入还原剂，在氩气气氛下室温反应1小时后，加入盐酸淬灭反应，再加入碱去除残余的酸，将反应体系倒入水中，抽滤，滤渣重结晶后得到过氧亚硝酸根离子检测探针AH-1。
3.如权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤i中，所述氢氧化钠溶液的浓度为4～8M。
4.如权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤ii中，所述催化剂为醋酸铜，碱为吡啶，氩气气氛下加热温度为90～140℃，加入冰醋酸和浓硫酸后，加热温度为90～110℃。
5.如权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤ii中，氩气气氛下加热温度为120℃，加入冰醋酸和浓硫酸后，加热温度为100℃。
6.如权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤iii中，所述盐酸的浓度为2M，碱为吡啶，重结晶所用的溶剂为丙酮/正己烷混合溶剂体系。
7.权利要求1所述的过氧亚硝酸根离子检测探针在中性或酸性水溶液中过氧亚硝酸根离子的荧光检测中的应用。
8.如权利要求1所述的过氧亚硝酸根离子检测探针在活细胞中过氧亚硝酸根离子的检测中的应用。
9.如权利要求8所述的过氧亚硝酸根离子检测探针在活细胞中过氧亚硝酸根离子的检测中的应用，其中，所述活细胞为RAW264.7细胞株。
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