CN106905159A - 一个羟基丙酸化合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个羟基丙酸化合物及其制备方法和医药用途。具体而言，本发明涉及了从药用昆虫喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera Fairmaire)中分离得到的(S)‑2‑羟基丙酸‑(3,4‑二羟基苯基)乙酯、该化合物的提取分离制备方法，以及该化合物在制备抗氧化剂中的医药用途。该化合物具有显著清除DPPH(1,1‑二苯基‑2‑苦基肼)自由基的生物活性，其清除DPPH的IC₅₀值为9.99±1.61微克/毫升，与阳性对照维生素C相当(IC₅₀值为6.92±0.89微克/毫升)。本发明的式(I)化合物具有开发成为创新型抗氧化剂的新颖性及巨大潜力，可以预期发展成为防治与自由基相关的生理改变或疾病的抗氧化剂。

Description

一个羟基丙酸化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域。具体而言，本发明涉及一个从药用昆虫喙尾琵琶甲中分离得到的羟基丙酸化合物及其制备方法和医药用途。该化合物具有清除DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基活性，可以预期发展成为防治与自由基相关的生理改变或疾病的抗氧化剂。

背景技术

自由基是人体进行生命活动时所产生的活性分子，正常情况下，人体的抗氧化防御系统能清除自由基，使其产生和清除保持平衡。自由基的产生和清除失衡时，就会引起机体损伤、诱发各种疾病、加速衰老。自由基可以引起多种人类疾病：脑组织受自由基氧化损伤可导致阿尔兹海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、中风、衰、老年斑等。同时自由基还与病毒感染、肿瘤生成以及癌症转移等都有相当密切的关系。此外，自由基在炎症发生和发展过程中起了重要的作用。医学研究指出：高血糖状态下产生大量的ROS，促进了糖尿病血管并发症，从而使致残率和致死率逐年上升。因此，研究和发展抗氧化剂是近年来一个热门的方向，对于老龄化、高压力人群增多的社会形态，抗氧化药物可以深入至保肝、防治老年性痴呆、预防心血管疾病、抗炎、抗病毒等多种药物用途。

1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)自由基是一种合成的、具有单电子、稳定的、以氮为中心的顺磁化合物。当具有自由基清除功效的抗氧化剂存在时，DPPH自由基接受一个电子或氢原子，形成稳定的DPPH-H化合物，使其醇溶液从深紫色变为黄色，变色程度与其接受的电子数量(即自由基清除、抗氧化活性)成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。由于DPPH自由基结构简单，反应容易控制，已广泛应用于动植物提取物或者单一化合物的抗氧化特性评价。

喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera Fairmaire)俗称臭壳子、小黑虫、臭屁虫、高脚虫、高脚臭虫、打屁虫，臭虫等，成虫能分泌具有药用价值的防御液(即臭屁)。喙尾琵琶甲是云南彝族长期广泛使用的昆虫药物(彝族药名音译为“寒斋”)，用于热证发烧、饮食积滞、小儿疳积、夜惊、乳癖、乳痰、疮痒肿毒、湿疹、皮肤瘙痒等。据调查，彝族民间医生在治疗肿瘤、心血管等疑难病症的处方中，80％以上都含有该昆虫药。该昆虫除了药用外，云南大部分地区还作为食用佳肴，可在农贸市场和药材市场购买到。因此，喙尾琵琶甲是一种极具开发和利用价值的民族民间药用昆虫。

与其民间应用不相匹配的是：目前对喙尾琵琶甲的药学和临床应用方面的研究报道非常少。除本专利发明人前期对其粗提物的抗肿瘤、抗菌作用进行了初步研究，尚未见其它关于喙尾琵琶甲提取物及其用途的报道。而本发明人团队根据前期研究发现喙尾琵琶甲的氯仿和乙酸乙酯部位具有一定的抗氧化活性(时珍国医国药，2013年第24卷第7期，1566-1567页)，进一步对喙尾琵琶甲进行了生物追踪的化学分离及结构鉴定，从而得到了比喙尾琵琶甲氯仿和乙酸乙酯部位具有更高效抗氧化的活性且结构新颖的羟基丙酸化合物。据此完成本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一个具有清除DPPH自由基活性的羟基丙酸化合物或其可药用盐，为进一步开发成为全新的抗氧化剂提供物质基础。具体而言，本发明提供了式(I)所示的羟基丙酸化合物：

式(I)化合物的名称为：(S)-2-羟基丙酸-(3,4-二羟基苯基)乙酯。

本发明的另一目的是提供了式(I)化合物的制备方法及其清除自由基的抗氧化用途；

本发明的又一目的是提供了将式(I)化合物用于制备护肝药、抗老年性痴呆药物、防治心血管及脑血管病变药物、抗衰老药物、治疗糖尿病并发症药物及与上述疾病或生理改变有关的医药或保健品用途；

本发明的再一目的是提供了一种用于清除自由基、抗氧化的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)所示结构的羟基丙酸或其可药用盐、药用载体和可药用辅料。

本发明通过从药用昆虫喙尾琵琶甲药材中提取得到式(I)化合物。具体而言，该化合物的制备方法包括下列步骤：

(1)经粉碎的喙尾琵琶甲虫体，用75％-100％醇溶剂浸泡提取3次，每次浸泡12-48小时；合并提取液，减压浓缩得粗浸膏；其中，醇溶剂中的醇是指甲醇、乙醇中的一种或两种，优选乙醇；减压浓缩时的温度不超过60℃；

(2)将步骤(1)中得到的粗浸膏混悬于水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，浓缩回收溶剂；

(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析分离，以石油醚-丙酮系统梯度洗脱，得FrC1～FrC11流分；其中石油醚-丙酮系统梯度洗脱是指石油醚︰丙酮(V︰V)＝10︰0→0︰10；

(4)取步骤(3)得到的FrC3流分，先经硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱；再经凝胶柱层析，甲醇洗脱；最后经十八烷基硅烷(octadecyl silane，ODS)反相柱层析，采用甲醇-水梯度洗脱；即得本发明所述羟基丙酸化合物(I)；其中氯仿-甲醇系统梯度洗脱是指氯仿︰甲醇(V︰V)＝100︰1→3︰1，甲醇-水梯度洗脱是指甲醇︰水(V︰V)＝1︰9→8︰2。

本发明中的喙尾琵琶甲是指鞘翅目拟步甲科琵琶甲属昆虫喙尾琵琶甲Blapsrynchopetera Fairmaire的全虫。

本发明中制备得到的式(I)化合物用制药领域中的常规方法，结合中、西药制剂工程中常规的药用载体和可药用辅料，可以制成各种药物组合物，这些药物组合物可以用于预防或/和治疗老年性痴呆、心血管病变、脑血管病变、肝病变、早衰、糖尿病并发症等与人体自由基破坏细胞功能有关的生理改变或疾病。上述药物组合物可以采用片剂、颗粒剂、胶囊、注射剂、外用搽剂、软膏剂等制剂形式，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明从药用昆虫喙尾琵琶甲中分离提纯得到式(I)化合物具有重要的生物活性，即其具有明显的清除氧自由基作用。其清除DPPH的IC₅₀值为9.99±1.61微克/毫升(μg/mL)，与阳性对照维生素C相当(Vit C清除DPPH的IC₅₀值为6.92±0.89μg/mL)，明显优于喙尾琵琶甲抗氧化有效部位(喙尾琵琶甲氯仿、乙酸乙酯部位的DPPH清除作用的IC₅₀值分别为23.35μg/mL和85.81μg/mL)。以上说明本发明所提供的从喙尾琵琶甲有效部位进一步提纯得到的式(I)化合物与现有技术相比，具有开发成为创新型抗氧化剂的新颖性及巨大潜力，据此完成本发明。

本发明的有益之处在于：本发明从药用昆虫喙尾琵琶甲中提取分离制备得到事(I)所示的羟基丙酸化合物，其原料来源方便易得、制备步骤简便、利于产业化。式(I)化合物具有显著的抗氧化活性，对于开发市场广大的预防或/和治疗老年性痴呆、心血管病变、脑血管病变、肝病变、早衰、糖尿病并发症等与人体自由基破坏细胞功能有关的生理改变或疾病之药物、日化用品、医疗器械提供了新的物质基础，具有潜在的社会效益和经济效益。

具体实施方案

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(I)化合物的制备实施例及其清除DPPH自由基的药理实验结果，说明其应用于制备抗氧化剂中的新用途。若无特别说明，本发明的百分比指的是重量百分比。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：式(I)化后物的制备与结构鉴定

1.1实验仪器与材料

NMR谱在Bruker AV-400型核磁共振波谱仪测定(δ为ppm,TMS为内标,J为Hz)；MS谱在Agilent G3250AA LC/MSD TOF型电喷雾飞行时间质谱仪测定；旋转蒸发仪采用德国Heidolph；循环冷凝泵采用日本EYELA；分析天平采用奥豪斯仪器(上海)有限公司制造的先行者。柱层析用葡聚糖凝胶(Pharmadex LH-20)购自于安发玛西亚生物技术(中国)有限公司；ODS反相材料购自Merck公司；柱层硅胶、薄层层析硅胶板为青岛海洋化工厂生产。层析用洗脱溶剂分别为经重蒸过的工业纯溶剂或化学纯溶剂；展开剂所用溶剂为分析纯；核磁共振谱测试试剂CDCl₃、CD₃OD、DMSO-d₆等均为美国剑桥同位素公司(CIL)产品，购自上海务胜生物科技有限公司；显色剂为：5％H₂SO₄茴香醛溶液和碘显色剂。

1.2药用昆虫药材来源

样品于2008年6月到7月在云南省大理州收集。河北大学任国栋教授鉴定为喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera Fairmaire)，样品标本(标本号：2008071001)保存于大理大学药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心药用昆虫标本室。

1.3提取和分离

将鲜活喙尾琵琶甲开水烫死、风干，粉碎。取上述喙尾琵琶甲干粉5公斤，采用95％乙醇冷浸提取三次，每次24小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得粗浸膏。

将上述粗浸膏加入适量水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。取乙酸乙酯部位200克经硅胶柱层析分离，以石油醚︰丙酮(V︰V＝10︰0→0︰10)梯度洗脱得到FrC1～FrC11流分。取FrC3流分再反复经硅胶柱层析，采用氯仿︰甲醇(V︰V＝100︰1→3︰1)梯度洗脱；再经凝胶柱层析(甲醇洗脱)和ODS柱层析，采用甲醇︰水(V︰V＝1︰9→8︰2)梯度洗脱；得到式(I)化合物(约50毫克)。

1.4结构鉴定

式(I)化合物：浅黄色液体；-13.75(c 0.24,CH₃OH)；HR-ESIMS:m/z:249.0738(calcd：249.0739，[M+Na]⁺)，分子式：C₁₁H₁₄O₅；¹H NMR(400MHz,氘代丙酮CD₃COCD₃)和¹³C NMR(100MHz,CD₃COCD₃)的核磁共振数据见表1；IR(KBr)v:3410.0(br),2955.0,1735.9,1607.2,1590.5,1552.8,1490.2,1455.9,1381.5,1250.3,1180.5,1165.4,1032.8,972.8,817.6,765.3cm^-1。

表1 式(I)化合物的NMR数据(CD₃COCD₃)

其中，偶合常数J用括号中数字表示(赫兹Hz为单位)，s为单峰，d为双重峰，t为三重峰，dd为双双重峰，dt为双三重峰，m为多重峰。

NMR结果显示其含有一个1,3,4-三取代苯环[δ_H 6.76(d,J＝2.0Hz),6.76(d,J＝8.0Hz),6.59(dd,J＝8.0,2.0Hz)；δ_C 129.5s,116.0d,145.0s,143.7s,115.2d,120.2d]；¹³CNMR数据提示苯环上有邻二羟基取代。¹H-¹H COSY中H-7(δ_H 2.80)与H-8(δ_H 4.21,4.30)的相关结合NMR数据[δ_H 4.21(dd,J＝7.0,11.6Hz),4.30(dd,J＝7.0,11.6Hz),2.80(2H,t,J＝7.0Hz)；δ_C 34.2t,65.3t]，表明该化合物含有一个-CH₂CH₂O-结构单元。HMBC谱中H-8与C-1(δ_C129.5s)，H-7与C-1、C-2(δ_C 116.0d)和C-6(δ_C 120.2d)的相关表明1,3,4-三取代苯环与-CH₂CH₂O-通过C₍₁₎-C₍₇₎键相连，即形成一个苯乙基片段。NMR分析还显示该化合物含有一个α-羟基丙酰基片段[δ_H 4.23(q,J＝7.0Hz),1.31(3H,d,J＝7.0Hz)；δ_C 174.7s,66.6d,19.9q]，¹H-¹H COSY中H-2′(δ_H 2.80)与H-3′(δ_H 4.21,4.30)的相关，HMBC谱中H-3′与C-1′和C-2′的相关支持以上结果。HMBC谱中H-8与C-1′(δ_C 174.7)的重要相关提示α-羟基丙酰片段与苯乙基片段通过酯键连接，至此确定该化合物的平面结构为2-羟基丙酸-(3,4-二羟基苯基)乙酯。

式(I)化合物的绝对构型通过比较电子圆二色谱(Electronic CircularDichroism,ECD)实验值与ECD的计算值来确定。其中，ECD的计算值是根据含时密度泛函理论(Time Dependent Density Function Theory,TDDFT)，采用B3LYP/6-31G(d)函数/基组对计算优势构象的激发能和旋转强度，并根据计算值绘制了理论ECD谱图，结果表明S构型的理论ECD谱图与实验ECD谱图一致。因此，式(I)化合物中手性碳C-2′的构型确定为S型。至此，确定了式(I)化合物的绝对构型，命名为(S)-2-羟基丙酸-(3,4-二羟基苯基)乙酯；

实施例2：式(I)化合物清除1,1-二苯基-二苦基肼(DPPH)自由基的能力检测

2.1实验原理与实验目的

DPPH是一种比较稳定的脂性自由基，其N上有一个游离电子，其乙醇溶液呈紫色。经全波长扫描可知其在517nm处有最大吸收峰。加入抗氧化剂以后，DPPH捕捉一个电子与游离电子配对，紫色褪去，变为无色物质，在517nm处吸收峰消失。褪色程度与其接受的电子数成定量关系。即DPPH被氧化还原时吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越强。据此原理，可测定样品提供氢原子、清除自由基、抗氧化的能力。

2.2方法与结果

2.2.1DPPH溶液的配置：精密称取0.0040克的DPPH，用甲醇溶解，并定量转入50毫升(mL)容量瓶中，用甲醇定容、摇匀，得质量浓度为80毫克/升(mg/L)的DPPH储备液，置于冰箱中冷藏备用。

2.2.2清除DPPH·能力的测定：参考Alejandro Tapia等所述方法，检测式(I)化合物的抗氧化能力。取各种不同浓度的待测样品溶液2毫升(mL)，加入DPPH溶液2mL，混匀，室温下暗室放置45分钟，分光光度计517nm波长处测定吸光度(Ai)；取2mL的DPPH溶液，加入2mL甲醇，混匀，在517nm下测吸光度(A0)；取2mL待测化合物溶液，加入2mL甲醇，在517nm下测吸光度(Aj)。其中，式(I)化合物的检测浓度梯度为：256，128，64，32，16，8，4μg/mL；维生素C(Vit C)为阳性对照，其检测浓度梯度为：12，10，8，6，4μg/mL。

2.2.3自由基清除率(K)计算公式：K＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100％。

2.2.4实验结果：清除50％自由基时的待测化合物浓度为IC₅₀值，以待测化合物浓度(μg/mL)为横坐标，DPPH自由基清除率K(％)为纵坐标，绘制样品的清除率曲线。在一定质量浓度范围内计算线性回归方程，并根据回归方程计算IC₅₀值。所得值为三次结果的平均值±标准误，见表2。

表2 式(I)化合物清除DPPH自由基活性

2.2实验结论

实验结果说明：本发明的式(I)化合物对DPPH自由基有确切的清除活性，其对DPPH自由基清除能力与维生素C相当。说明式(I)所示的从药用昆虫喙尾琵琶甲中提取得到的该羟基丙酸是一个具有清除DPPH自由基显著效果的化合物，具有进一步开发成为抗氧化、抵抗自由基引起的损害之药物的潜力。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (8)

1.具有式(I)所示结构的羟基丙酸化合物或其可药用盐：

其中，式(I)化合物的名称为：(S)-2-羟基丙酸-(3,4-二羟基苯基)乙酯。

2.一种权利要求1所示式(I)化合物的制备方法，其特征是所述制备方法包括以下步骤：

(1)经粉碎的喙尾琵琶甲虫体，用75％-100％醇溶剂浸泡提取3次，每次浸泡12-48小时；合并提取液，减压浓缩得粗浸膏；其中，醇溶剂中的醇是指甲醇、乙醇中的一种或两种；

(2)将步骤(1)中得到的粗浸膏混悬于水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，浓缩回收溶剂；

(3)将步骤(2)得到的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析分离，以石油醚-丙酮系统梯度洗脱，得FrC1～FrC11流分；

(4)取步骤(3)得到的FrC3流分，先经硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱；再经凝胶柱层析，甲醇洗脱；最后经十八烷基硅烷反相柱层析，采用甲醇-水梯度洗脱；即得。

3.根据权利要求2的制备方法，其特征为：喙尾琵琶甲虫体是指鞘翅目拟步甲科琵琶甲属昆虫喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera Fairmaire的全虫。

4.根据权利要求2的制备方法，其特征为：步骤(1)中的醇是指乙醇、减压浓缩时的温度不超过60℃；步骤(3)中的石油醚-丙酮系统梯度洗脱是指石油醚︰丙酮按体积比10︰0、9︰1、8︰2、7︰3、6︰4、5︰5、4︰6、3︰7、2︰8、1︰9、0︰10的梯度进行洗脱；步骤(4)中氯仿-甲醇系统梯度洗脱是指氯仿︰甲醇按体积比100︰1、50︰1、25︰1、10︰1、5︰1、3︰1的梯度进行洗脱；甲醇-水梯度洗脱是指甲醇︰水按体积比1︰9、2︰8、3︰7、4︰6、5︰5、6︰4、7︰3、8︰2的梯度进行洗脱。

5.根据权利要求1的式(I)所示结构的羟基丙酸化合物或其可药用盐用于制备预防或治疗由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病的药物的用途。

6.根据权利要求5的用途，其中由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病是指肝脏损伤、老年性痴呆、心脑血管病变、衰老、糖尿病并发症。

7.一种用于预防或治疗由氧自由基引起或与氧自由基有关的生理改变或疾病的药物组合物，其含有作为活性成分的治疗有效量的权利要求1所述之式(I)化合物或其可药用盐、可药用载体和可药用辅料。

8.根据权利要求7的药物组合物，其是片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂或外用制剂。