CN110420205B - 3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用 - Google Patents

3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用 Download PDF

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Abstract

3‑羟基‑3’,4’‑二羟基‑丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用，3‑羟基‑3’,4’‑二羟基‑丁酸苯乙酯对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用；3‑羟基‑3’,4’‑二羟基‑丁酸苯乙酯降低主动脉内皮细胞内的IL‑6的mRNA水平含量；所述的3‑羟基‑3’,4’‑二羟基‑丁酸苯乙酯对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体有保护作用；所述的3‑羟基‑3’,4’‑二羟基‑丁酸苯乙酯增加线粒体复合物I蛋白的表达；所述的3‑羟基‑3’,4’‑二羟基‑丁酸苯乙酯在制备防治心血管疾病的药物中的应用，本发明通过抗炎和保护线粒体功能来预防动脉粥样硬化的发生和发展。

Description

3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细 胞功能药物中的应用
技术领域
本发明属于医药学技术领域，特别涉及3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用。
背景技术
据2011年世界卫生组织发布的关于心血管疾病的预防与控制的全球数据显示，心血管疾病导致的死亡占全球死亡人数的31％，仅次于其它非传染性疾病的总数。且预计2008年到2030年心血管疾病导致的死亡率明显高于其它疾病，处于领先地位。心血管疾病主要包括心脑血管疾病，如心肌梗死和脑梗死等。而动脉粥样硬化是心血管疾病的病理基础。
动脉粥样硬化的发病机制非常复杂，发生于血管壁中，是一种慢性炎症反应、形成斑块、且伴随有血管内皮细胞损伤。导致动脉粥样硬化的因素主要有高盐、高脂、高能量、吸烟等不健康饮食以及代谢型危险因素，包括三高及肥胖等疾病。
目前动脉粥样硬化有药物和手术等治疗方式，但该类型疾病隐匿性高、致死和致残率都较高，因此提早预防显得尤为重要，有研究报道，天然活性成分如绿原酸、芎芍及木酚素等具有抗动脉粥样硬化的功能，且以此为原料的功能性食品相继问世。挖掘更多效能更好的抗动脉粥样硬化等心血管疾病的新药物具有重要的意义和前景。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用，3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯可明显抑制饱和脂肪酸造成的人主动脉内皮细胞炎症反应及增加血管内皮细胞线粒体复合物生成，通过抗炎和保护线粒体功能来预防动脉粥样硬化的发生和发展。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用，其化学式为：
Figure GDA0003800240930000021
所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用。
所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯降低主动脉内皮细胞内的IL-6的mRNA水平含量。
所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体有保护作用。
所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯增加线粒体复合物I蛋白的表达。
所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备防治心血管疾病的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯HB-HT能够增加人主动脉内皮细胞的细胞活性，本发明首次公开指出HB-HT在血管内皮损伤和炎症反应的动脉粥样硬化等血管疾病发生的过程中，HB-HT可明显抑制饱和脂肪酸造成的人主动脉内皮细胞炎症反应及增加血管内皮细胞线粒体复合物的生成，通过抗炎和保护线粒体功能来预防动脉粥样硬化的发生和发展。
HB-HT能够有效降低饱和脂肪酸造成的人主动脉内皮炎性反应，如白介素-6(IL-6)的mRNA水平含量；HB-HT能够有效保护饱和脂肪酸对人主动脉内皮线粒体功能的损伤，如可增加线粒体复合物I蛋白的表达等；其对于预防血管疾病发生和进展中具有很好的应用前景。
附图说明
图1是HB-HT对人主动脉内皮细胞活性的影响和保护作用，其中：横坐标为该化合物的作用浓度，纵坐标为细胞活性。
图2是HB-HT对棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞炎症反应的抑制作用，其中：横坐标为该化合物的作用浓度，纵坐标为IL-6的mRNA水平含量。
图3A～图3B是HB-HT可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体复合物I表达的降低，其中：图3A为Western blot结果图；图3B为Western blot统计图，横坐标为蛋白名称，纵坐标为相对蛋白表达水平含量。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1.实验材料
本发明涉及的化合物为：3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯(HB-HT)，其结构如下所示：
Figure GDA0003800240930000031
TRIzol试剂从Invitrogen公司购买；RNA逆转录试剂盒，SYBR荧光染料从大连宝生物公司购买。RNA引物序列从西安擎科泽西生物有限公司订购合成。
2.实验细胞培养及模型建立
人主动脉内皮细胞(Human aortic endothelial cells,HAEC)从上海拜力生物科技有限公司购买，棕榈酸购买于sigma公司。细胞培养于含有95％空气和5％CO2的37℃恒温、湿润、无菌培养箱中。实验分为三组，分别为：(1)control组；(2)500μM棕榈酸处理组；(3)HB-HT保护组。
3.实验方法
(1)MTT检测
用不同浓度的HB-HT作用于HAEC，细胞培养箱培养24h，后用500μM的棕榈酸作用24h后，用PBS清洗细胞一遍，加入0.5mg/ml的MTT，在含有95％空气和CO2的37℃培养箱中孵育4h后，用PBS清洗三遍，再加入DMSO溶解，并在490nm的波长下检测其吸光值。
(2)白介素-6的mRNA含量检测
采用逆转录RNA-实时荧光定量PCR的方法进行检测。具体方法如下：
1)RNA提取
12孔细胞培养板，每孔加入500μL的TRIzol试剂，室温，摇床5min，加入200μl氯仿(1/5总体积)抽提蛋白，剧烈混匀15s，室温放置15min后，12,000g,4℃,离心10分钟。将上层水相转移至另一EP管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃放置1h后，12,000g,4℃,离心10min，弃上清。加入1mL预冷的75％乙醇，颠倒混匀，12,000g,4℃，离心10min。弃上清，超净工作台放置30min，使乙醇挥发完全挥发掉，溶于10μl DEPC水中。用紫外分光光度计检测测定其浓度，用于反转录。
2)RNA反转录
转录体积为20μl，取出2μg RNA，加入随机引物0.5μg。加入4μl的5X Master Mix，用DEPC水补充至20μl体积，37℃孵育60min，80℃作用15s。置于-20℃备用。
3)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
用SYBR Green法进行，反应体系包括1μl cDNA，5μl 2×
Figure GDA0003800240930000041
Premix Ex TaqTMII，0.5μl上下游引物混合液(10μM)，加灭菌水至10μl。反应条件依照说明书，95℃解链10min，进行40个循环PCR(每个循环包括95℃30s，55℃30s，72℃20s)，最后观测融解曲线(95℃15s，60℃15s，95℃15s)。β-actin作为内参，实验所用的引物序列为：
IL-6:
forward：5’-TTTTGTACTCATCTGCACAGC-3’
reverse：5’-GGATTCAATGAGGAGACTTGC-3’
β-actin:
forward:5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3'
reverse:5'-AGATGGGCACAGTGTGGGT-3’
(3)蛋白检测
1)蛋白提取
6孔细胞培养板，每孔加入150μL的IP裂解液，用细胞刮刮取细胞，振荡15s，冰浴10min，如此反复三次，保证冰浴时间至少在30min以上，4℃，12000rcf离心10min，取上清，用BCA方法进行蛋白定量，调平，加入5X loading buffer和巯基乙醇，煮沸10min，使蛋白变性，-80℃保存，待用。
2)Western blot
利用10％的丙烯酰胺凝胶进行跑胶，蛋白上样量为10μg，利用PVDF膜转印，后封闭，孵育一抗，4℃过夜，清洗一抗，孵育二抗，室温1h，清洗二抗，进行化学发光。
4.统计分析
结果以Mean±S.E.M形式表示，数据分析使用One Way-ANOVA分析方法，显著统计学意义为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
5、HB-HT可增加人主动脉内皮细胞的活性和增加棕榈酸抑制的细胞活性
MTT检测HB-HT作用于人内皮细胞(HAEC)24h，后500μM棕榈酸处理24h，图1显示HB-HT呈浓度依赖性的增加人主动脉内皮细胞活性的作用，且可呈浓度依赖性的增加棕榈酸抑制的细胞活性。
6、HB-HT对棕榈酸诱导人血主动脉内皮细胞炎症反应的抑制作用
HB-HT先作用于人内皮细胞24h后再加500μM棕榈酸作用24h，图2显示HT-HB提取物对可以显著抑制棕榈酸损伤人血管内皮细胞产生的炎症反应，500μM的棕榈酸使人主动脉内皮细胞产生炎症反应，如细胞炎症因子白介素IL-6均较无棕榈酸处理组有明显升高，在mRNA水平上，IL-6升高了约10倍，模型组炎症水平增高明显，当HB-HT的作用浓度为100μM时产生了明显的抑制炎症反应的效果，提示HB-HT的抗炎作用及抗动脉粥样硬化效果。
7、HB-HT可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体复合物I的降低
线粒体呼吸链酶称线粒体呼吸链复合物、线粒体呼吸链复合酶，线粒体呼吸链位于线粒体内膜由5个复合物组别：NADH(称复合物I)、琥珀酸氧化原酶(称复合物II)、细胞色素C氧化原酶(复合物III)、细胞色素C氧化酶(称复合物IV)ATP合酶(称复合物V)线粒体复合物，线粒体复合物与电子传递和能量产生紧密相关，复合物表达量的下降说明细胞线粒体功能下降。图3A～图3B显示棕榈酸可降低人主动脉内皮细胞线粒体复合物I,II蛋白的表达，而HB-HT可明显增加线粒体复合物I的表达，从而增加线粒体功能。
通过以上实验结果证明HB-HT能够有效抑制高脂诱导的人主动脉内皮细胞的炎症反应和线粒体损伤，从而改善人主动脉内皮细胞功能。可进行以下应用：
HB-HT在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用。
进一步的，所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用的药物。
所述的药物是降低主动脉内皮细胞内的IL-6的mRNA水平含量。
进一步的，所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体有保护作用的药物。
所述的药物是增加线粒体复合物I的表达的药物。
由于内皮细胞功能受损是动脉粥样硬化的初期表征及发生、发展的基础和原因，动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应，炎症反应的发生是该病发生的重要原因之一，且线粒体损伤会造成内皮细胞能量不足和功能下降，被报道将可能也是动脉粥样硬化发生的重要原因之一，HB-HT在以上内皮细胞损伤实验中表现出很好的保护内皮细胞炎症、线粒体损伤的特性。由此，HB-HT在预防高脂引起内皮损伤的动脉粥样硬化等心血管疾病有很好的应用前景，为防治膳食结构失衡所致内皮损伤导致的动脉粥样硬化等心血管疾病系列问题开辟新的医药途径。
可进行以下应用：
HB-HT在制备防治心血管疾病的药物中的应用。
所述的药物是治疗动脉粥样硬化的药物。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用，其特征在于，3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的化学式为：
Figure FDA0003800240920000011
所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯对棕榈酸诱导的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用；
所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯对棕榈酸诱导的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体有保护作用。
2.根据权利要求1所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用，其特征在于，所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯降低主动脉内皮细胞内的IL-6的mRNA水平含量。
3.根据权利要求1所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯在制备改善主动脉内皮细胞功能药物中的应用，其特征在于，所述的3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯增加线粒体复合物I蛋白的表达。
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