CN109010329A - 羟基酪醇醋酸酯在改善血管内皮功能障碍疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了羟基酪醇醋酸酯在改善血管内皮功能障碍疾病中的应用,属于医药卫生技术领域,本发明以血管内皮SIRT6特异性敲除的纯合型(SIRT6endo‑/‑)小鼠和同窝阴性(SIRT6endo+/+)小鼠为研究对象,通过腹腔注射泊洛沙姆407(0.5g/kg/2day)一个月诱导建立高脂血症炎症小鼠模型,研究发现羟基酪醇醋酸酯具有降低血脂及血管炎症的作用,且是通过SIRT6介导的PKM2发挥抗血管内皮炎症作用的。在细胞水平,以人脐静脉内皮细胞为对象,发现羟基酪醇醋酸酯具有抗血管内皮细胞氧化应激和炎症的作用,并进一步通过TNFR1中和抗体、腺病毒高表达SIRT6或siRNA沉默SIRT6等技术,发现羟基酪醇醋酸酯通过TNFR1‑SIRT6‑PKM2信号通路发挥抗血管内皮细胞炎症作用。
Description
技术领域
本发明属于医药卫生技术领域,涉及羟基酪醇醋酸酯在改善血管内皮功能障碍疾病中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病已经成为导致人类死亡的主要原因之一。动脉粥样硬化是一个多因素、多阶段的病理过程,发病机制复杂,至今尚未完全阐明。氧化损伤-炎性反应学说是目前较公认的解释动脉粥样硬化发病机理的重要学说,该学说认为血管内皮细胞氧化应激损伤是动脉粥样硬化发生的始发环节,而炎症反应是促进动脉粥样硬化病理进程的重要因素。内皮细胞通过促进血管舒张、抑制平滑肌增生以及抑制血管内皮炎症等一系列血管保护作用来调控血管内稳态的维持。减轻血管炎症和改善内皮功能紊乱对于对于降低心血管疾病风险极其重要。
目前临床上能改善血管内皮功能的药物均会导致患者产生一定的药物不良反应,如他汀类药物长期使用会引起肌痛等不良反应使患者难以长期耐受,双胍类药物会引起胃肠障碍或偶尔引起乳酸性酸中毒,噻唑烷衍生物会引起体液贮留或体重增加、肝功能障碍等严重副作用。因此,寻求安全而有效的血管内皮功能紊乱的治疗药物十分有必要。
羟基酪醇醋酸酯(Hydroxytyrosol acetate,HT-AC)化学名乙酸-2-(3,4-二羟基苯基)乙酯,是橄榄油中除羟基酪醇(Hydroxytyrosol,HT)外的另一种天然多酚类化合物。羟基酪醇因其特殊的生物和药理活性,用途十分广泛。目前国外已有含有羟基酪醇的保健产品进入市场。而大量研究报道,与羟基酪醇相比,羟基酪醇醋酸酯有更好的抗血小板聚集和抗氧化活性。此外,羟基酪醇醋酸酯比羟基酪醇有更好的稳定性,且作为一种天然多酚类化合物,毒副作用小。
Sirtuins(SIRT1~SIRT7)蛋白家族是一类NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶和(或)ADP核糖基转移酶,在细胞分化、衰老、凋亡、生理节律、代谢调控、转录调节、信号转导、氧化应激等多种重要的生物学过程中发挥重要作用。有报道SIRT6可通过增加血管内皮细胞促炎因子IL-1β,IL-6,IL-8和细胞外基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)的表达,从而促进动脉粥样硬化发生、发展。越来越多的证据表明,SIRT6通过抑制促炎细胞因子的释放,在调节炎症相关疾病方面起着重要作用。最近有研究表明,通过SIRT6介导的自噬,羟基酪醇抑制骨关节炎中软骨细胞的炎症反应。
PKM2是丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)的一种亚型,是糖酵解过程中最后一步反应的限速酶,它能使磷酸烯醇式丙酮酸脱羧生成丙酮酸并产生ATP。近年来研究发现,原本定位在细胞质中的PKM2除了在能量代谢中发挥酶催化作用外,还可以通过多种途径进入细胞核,进而广泛参与转录调控、蛋白修饰等过程。已有研究报道,在巨噬细胞中,LPS诱导PKM2进入细胞核中与HIF-1α形成转录复合物,然后直接与IL-1β启动子结合并激活IL-1β的转录。此外,有研究证明,SIRT6可直接去乙酰化PKM2从而抑制PKM2的核定位和致癌作用。
虽然现有技术已报道羟基酪醇醋酸酯具有多种生物活性,但至今还未报道过羟基酪醇醋酸酯能够减轻血管内皮炎症或改善血管内皮功能及其作用机制。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供羟基酪醇醋酸酯在改善血管内皮功能障碍疾病中的应用。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了羟基酪醇醋酸酯在制备治疗血管内皮功能障碍疾病的药物中的应用。
优选地,所述的药物是通过SIRT6介导的PKM2发挥抗血管内皮炎症作用的药物。
进一步优选地,所述的药物为增加主动脉中SIRT6蛋白和mRNA表达、同时减少主动脉中PKM2蛋白表达的药物。
优选地,所述的药物为能够降低血脂的药物。
优选地,所述的药物为能够降低血清中炎症因子TNF-α和IL-1β浓度的药物。
优选地,所述的药物为能够降低主动脉中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达的药物。
本发明还公开了羟基酪醇醋酸酯在制备改善血管内皮功能的药物中的应用。
优选地,所述的药物为具有抗血管内皮细胞氧化应激和炎症作用的药物。
优选地,所述的药物为改善血管内皮通透性的药物。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明以血管内皮SIRT6特异性敲除的纯合型(SIRT6endo-/-)小鼠和同窝阴性(SIRT6endo+/+)小鼠为研究对象,通过腹腔注射泊洛沙姆407(0.5g/kg/2day)一个月诱导建立高脂血症炎症小鼠模型,研究发现羟基酪醇醋酸酯具有降低血脂及血管炎症的作用,且是通过SIRT6介导的PKM2发挥抗血管内皮炎症作用的。在细胞水平,以人脐静脉内皮细胞为对象,发现羟基酪醇醋酸酯具有抗血管内皮细胞氧化应激和炎症的作用,并进一步通过TNFR1中和抗体、腺病毒高表达SIRT6或siRNA沉默SIRT6等技术,发现羟基酪醇醋酸酯通过TNFR1-SIRT6-PKM2信号通路发挥抗血管内皮细胞炎症作用。本发明经过体内外药理实验证实,羟基酪醇醋酸酯具有以下药理活性:(1)抗血管内皮细胞氧化应激的作用;(2)抗血管内皮细胞炎症的作用;(3)能改善血管内皮细胞的通透性。
本发明发现羟基酪醇醋酸酯有良好的治疗血管炎症和/或改善血管内皮功能的作用,可用于防治心血管疾病,具有较大的临床应用价值。
附图说明
图1为羟基酪醇醋酸酯的合成路线图;
图2为HT和HT-AC对高脂血症炎症小鼠血清中血脂(TC、TG、LDL-c和HDL-c)的影响;其中,(a)为TC;(b)为TG;(c)为LDL-c;(d)为HDL-c;
图3为HT和HT-AC对高脂血症炎症小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-1β的影响;其中,(a)为TNF-α;(b)为IL-1β;
图4为HT和HT-AC对高脂血症炎症小鼠主动脉中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1mRNA表达的影响;其中,(a)为TNF-αmRNA;(b)为IL-1βmRNA;(c)为IL-6mRNA;(d)为MCP-1mRNA;
图5为HT和HT-AC对高脂血症炎症小鼠血管内皮通透性的影响;(a)为影响结果照片;(b)为统计结果图;
图6为HT-AC对高脂血症炎症小鼠主动脉中SIRT6和PKM2表达的影响;其中,(a)为SIRT6蛋白水平;(b)为SIRT6mRNA水平;(c)为PKM2蛋白表达水平;
图7为HT-AC对SIRT6endo-/-高脂血症炎症小鼠主动脉中SIRT6、PKM2表达的影响;其中,(a)为SIRT6蛋白水平;(b)为SIRT6mRNA水平;(c)为PKM2蛋白表达水平;(d)为PKM2免疫组化图;
图8为HT-AC对SIRT6endo-/-高脂血症炎症小鼠主动脉中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1mRNA表达的影响;其中,(a)为TNF-α;(b)为IL-1β;(c)为IL-6;(d)为MCP-1;
图9为HT-AC对SIRT6endo-/-高脂血症炎症小鼠血管内皮通透性的影响;其中,(a)为影响结果照片;(b)为统计结果图;
图10为MTT法检测HT和HT-AC对HUVECs细胞活力的影响;其中,(a)为HT;(b)为HT-AC;
图11为HT和HT-AC对TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应的影响;其中,(a)为对IL-1βmRNA表达水平影响;(b)为对IL-6mRNA表达水平影响;(c)对MCP-1mRNA表达水平影响;
图12为HT和HT-AC对TNF-α刺激的HUVECs的氧化应激的影响;其中,(a)为SOD;(b)为MDA;(c)为氧化应激结果照片;
图13为HT-AC对TNF-α刺激的HUVECs的TNFR1、TNFR2、SIRT6、PKM2表达的影响;(a)为TNFR1蛋白;(b)为TNFR1mRNA;(c)为TNFR2蛋白;(d)为TNFR2mRNA;(e)为SIRT6蛋白;(f)为STRT6免疫荧光图;(g)为STRT6mRNA;(h)为PKM2蛋白;(i)为PKM2免疫荧光图;(j)为PKM2电泳结果;
图14为HT-AC通过TNFR1调控TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应以及SIRT6和PKM2的表达;其中,(a)为IL-1βmRNA;(b)为IL-6mRNA;(c)为MCP-1mRNA;(d)为SIRT6蛋白;(e)为SIRT6mRNA;(f)为PKM2蛋白;
图15为HT-AC通过TNFR1介导的SIRT6调控TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应以及PKM2的表达;其中,(a)为SIRT6蛋白;(b)为IL-1βmRNA;(c)为IL-6mRNA;(d)为MCP-1mRNA;(e)为PKM2蛋白;(f)为PKM2免疫荧光图;(g)为SIRT6蛋白;(h)为IL-1βmRNA,Ad-SIRT6;(i)为IL-6mRNA,Ad-SIRT6;(j)为MCP-1mRNA,Ad-SIRT6;(k)为PKM2蛋白,Ad-SIRT6;(l)为PKM2蛋白,Ad-SIRT6免疫荧光图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
实施例1 HT-AC的合成
参见图1,为本发明合成羟基酪醇醋酸酯的工艺路线图,图中,a为BnBr,K2CO3,acetone,57℃,24h;b为CH3COOH,EDCI,DMAP,DMF;c为H2/Pd-C,CH3CH2OH。具体合成步骤如下:
1)2-(3,4-二苄氧基苯基)乙醇的合成
将3,4-二羟基苯甲醇溶解于50mL干燥的丙酮中,加入溴化苄和碳酸钾,在氮气保护下,57℃搅拌回流24h。待反应完全后,停止搅拌,冷却至室温后减压除去丙酮溶剂,用乙酸乙酯(20mL×2)萃取,饱和碳酸氢钠洗至中性,饱和NaCl溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离(洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯,体积比4:1),得2-(3,4-二苄氧基苯基)乙醇。
2)乙酸-2-(3,4-二苄氧基苯基)乙酯的合成
将2-(3,4-二苄氧基苯基)乙醇溶解于25mL干燥的DMF中,依次加入乙酸、EDCI、DMAP,在氮气保护下,室温搅拌12h。待反应完全后,停止搅拌,加入H2O(20mL),用乙酸乙酯(20mL×2)萃取,饱和NaCl溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得黄色油状物。直接投入下一步反应。
3)乙酸-2-(3,4-二羟基苯基)乙酯的合成
将乙酸-2-(3,4-二苄氧基苯基)乙酯溶解于30mL无水乙醇中,加入10%钯碳催化剂,在氢气作用下,室温搅拌5h。待反应完全后,停止搅拌,减压除去乙醇溶剂,加入H2O(20mL),用乙酸乙酯(20mL×2)萃取,饱和NaCl溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离(洗脱剂为氯仿-甲醇,体积比60:1),得2-(3,4-二苄氧基苯基)乙醇。
上述方法是以天然多酚类化合物羟基酪醇为母核,合成了羟基酪醇醋酸酯,提高了羟基酪醇的稳定性。通过3步有机合成即可得,具有原料易得,反应条件温和,反应过程操作简单,所用试剂便宜的优点。
实施例2 HT和HT-AC对高脂血症炎症小鼠血清中血脂和炎症因子TNF-α和IL-1β的影响实验
小鼠腹腔注射泊洛沙姆407(0.5g/kg/day)1个月构建高脂血症炎症小鼠模型,同时每天灌胃HT和HT-AC(5、10、20mg/kg/day)1个月。
小鼠眼眶取血约1.5mL,3500rpm离心10min,收集上清液,置于-20℃保存。采用胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)和高密度脂蛋白(HDL-c)测定试剂盒,分别检测TC、TG、LDL-c和HDL-c的含量;采用ELLSA试剂盒检测小鼠血清中TNF-α和IL-1β的浓度。结果参见图2、图3,从图2中可以出,HT和HT-AC能够降低小鼠血清中TC、TG和LDL-c的含量,升高HDL-c的含量。从图3中可以看出,HT和HT-AC能降低血清中炎症因子TNF-α和IL-1β的浓度。
实施例3 HT和HT-AC对高脂血症炎症小鼠血管炎症的影响实验
1、动物组织RNA提取步骤如下:
(1)称取50-100mg左右胸主动脉血管组织置于液氮预冷的研钵中,迅速加入适量液氮并同时不断研磨,组织研磨至粉末迅速转入无菌无酶的Ep管中,加入1mL的Trizol液进行裂解;
(2)室温放置5min后吹打转入1.5mLEP管中。
(3)13000rpm转速4℃离心5min,上清液转入新的1.5mLEP管中。
(4)加入氯仿200μL,剧烈晃动15s后室温静置5min。
(5)13000rpm转速4℃离心15min,从离心机中小心取出EP管,此时匀浆分为3层,上层为无色上清液(含RNA),中层为白色蛋白层,下层为有机相。
(6)吸取上清于另一EP管中。
(7)加入500μL异丙醇,上下颠倒充分混匀后静置10min。
(8)13000rpm转速4℃离心10min,EP管底部出现RNA沉淀。
(9)小心弃掉上清后,加入1mL75%乙醇洗涤EP管壁。
(10)7500rpm转速4℃离心5min,弃掉上清,保留沉淀。
(11)打开EP管盖,室温干燥RNA沉淀5min,沉淀干燥后,加入30μLDEPC水。
2、RNA浓度测定:
取RNA样品2μL使用NanDrop软件测定OD值,OD260/280值在1.80~2.00之间符合样品纯度要求。
3、反转录:
按照试剂盒说明书要求进行反转录反应,10μL体系。
(1)预冷的EP管中加入如下所示试剂(操作应在冰上操作):
总RNA 0.5μg
5×Prime Script RT Master Mix 2μl
DEPC水 to 10μL
(2)混匀后低速离心,进行反转录反应。在PCR仪中37℃ 15min,85℃ 5s,4℃降温后,将cDNA保存于-20℃冰箱。
4、引物的设计与合成
引物由生工生物工程有限公司合成,如下表1所示:
表1
5、实时定量PCR扩增反应
25μL体系如下表2:
表2
扩增程序如下表3:
表3
以小鼠GAPDH作为内参照,PCR仪扩增后,根据所给出的熔解曲线、扩增曲线以及靶基因的相对表达量,采用2-△△Ct进行分析。
实验结果如图4所示,从图中可以看出,与对照组相比,P-407组显著增加了TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达,而HT和HT-AC降低了主动脉中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达。
实施例4 HT和HT-AC对高脂血症炎症小鼠血管内皮通透性的影响实验
采用Evans Blue法检测小鼠肺血管内皮通透性,基本步骤如下:
(1)尾静脉注射1%的伊文思蓝(Evans Blue),剂量为25mg/kg体重
(2)2h后处死,于右心室注入6~10mL PBS灌流肺血管,至整个肺变白;
(3)取右肺下叶,用滤纸拭去肺组织表面水分,称肺湿重;
(4)加入甲酰胺,剂量为1mL/mg肺湿重;
(5)置于60℃温箱24h,使其充分反应;
(6)以12000g离心30min,取上清液;
(7)配制伊文思蓝标准品:将伊文思蓝溶于甲酰胺中,配制成浓度为10μg/mL、8μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的伊文思蓝标准品;
(8)于96孔板中相应各孔中加入不同浓度的伊文思蓝标准品和样本,空白孔中加入甲酰胺200μL,于分光光度计上测定OD620值;
(9)以伊文思蓝标准品浓度作横坐标,(伊文思蓝标准品OD620-空白孔OD620)值作纵坐标,绘制标准曲线;
(10)根据标准曲线,计算样本肺组织中伊文思蓝浓度
从肺组织提取伊文思蓝染料进行比色,结果参见图5,从图中可以表明,P-407组显著增加了小鼠血管通透性,而HT和HT-AC改善了小鼠血管通透性。
实施例5 HT-AC对高脂血症炎症小鼠主动脉中SIRT6和PKM2表达的影响实验
由于HT-AC比HA有更好的作用效果,故对HT-AC进行进一步的机制研究。
1、Western blotting检测小鼠主动脉中SIRT6和PKM2蛋白表达水平:
(1)动物组织蛋白提取步骤如下:
1)称取30~40mg左右胸主动脉血管组织置于液氮预冷的研钵中,迅速加入适量液氮并同时不断研磨,组织研磨至粉末迅速转入预冷的Ep管中;
2)待液氮挥发完后加入预冷的RIPA裂解液(按1:50比例加入蛋白酶抑制剂Cocktail),反复吹打确保RIPA裂解液能够均匀覆盖组织粉末;
3)冰上裂解25min,使组织充分裂解;
4)收集组织裂解液,4℃,12000rpm离心20min;
5)将组织裂解液上清移至另一新的Eppendorf管中,取适量用于测定蛋白浓度(蛋白定量BCA试剂盒),其余分装后-80℃保存。
(2)蛋白变性:将5×上样缓冲液按4:1的比例加入到蛋白样品中,混匀,沸水中煮5min使之变性
(3)目的蛋白的分离:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离目的蛋白
(4)目的蛋白的检测:采用ECL化学发光法检测目的蛋白
(5)凝胶图像分析:采用Lane 1D生物分析软件对条带的灰度值进行分析,将同一样本的目标蛋白和内参蛋白的的灰度值进行比较相比得到相对灰度值。
参见图6,实验结果表明与对照组相比,P-407组显著降低了SIRT6蛋白表达,增加了PKM2的蛋白表达,而HT-AC显著增加SIRT6蛋白表达,降低PKM2的蛋白表。
2、real time RT-PCR检测小鼠主动脉中SIRT6mRNA表达水平如下表4:
表4
其他步骤同实施例3,实验结果参见图6,结果表明与对照组相比,P-407组显著降低了SIRT6mRNA表达,而HT-AC显著增加SIRT6mRNA表达。
实施例6 HT-AC对SIRT6endo-/-高脂血症炎症小鼠主动脉中SIRT6、PKM2表达的影响实验
利用实验构建并鉴定的SIRT6内皮特异性敲除小鼠进行实验。该小鼠是通过将雌性的SIRT6flox/flox小鼠与雄性的C57BL/6J Tie2-Cre小鼠杂交,获得Tie2-Cre/SIRT6flox/+小鼠;然后再将雄性Tie2-Cre/SIRT6flox/+小鼠与雌性的SIRT6flox/flox小鼠杂交,最终获得纯合型的SIRT6内皮特异性敲除小鼠,即SIRT6endo-/-小鼠。本课题将SIRT6flox/flox小鼠用作野生型对照组(WT)小鼠。
1、Western blotting和real time RT-PCR检测小鼠主动脉中SIRT6和PKM2的表达水平,步骤同实施例5。
结果参见图7,结果表明SIRT6内皮特异性基因敲除导致SIRT6蛋白和mRNA表达下降,PKM2蛋白表达升高。
2、免疫组织化学法检测小鼠主动脉中PKM2蛋白表达水平:
处死各组小鼠时,用眼科剪轻柔地摘取胸主动脉组织。用生理盐水洗去黏附的血液,轻轻吸干。先在4%的多聚甲醛中固定48h,然后再用15%的蔗糖溶液脱水24h,最后用30%的蔗糖溶液脱水24h。脱水完成后,用OTC进行组织包埋。用冰冻切片机将包埋好的组织切成7μm厚度均匀的切片,于-80℃冰箱中冰冻保存并进行下一步免疫组织化学染色。
1)冰冻切片室温复温30min;
2)4%的多聚甲醛固定30min;
3)加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+PBS 100ml+30%过氧化氢),室温浸泡30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,PBS清洗5min×3;
4)滴加5%BSA封闭液,室温20min,甩干,不洗;
5)滴入适当稀释的一抗PKM2(1:1000),37℃1h或4℃过夜。PBS清洗5min×3;
6)滴加生物素化山羊抗兔IgG,20-37℃20min,PBS清洗5min×3;
7)滴加试剂SABC,20-37℃20min,PBS清洗5min×3;
8)DAB显色:使用DAB显色试剂盒,取1mL蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应试剂,蒸馏水洗涤;
9)苏木素轻度复染。
结果见图7,实验结果表明与对照组相比,P-407组显著降低了PKM2蛋白表达,而HT-AC显著增加PKM2蛋白表达,SIRT6内皮特异性基因敲除导致PKM2蛋白表达升高。
实施例7 HT-AC对SIRT6endo-/-高脂血症炎症小鼠主动脉中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1mRNA表达的影响实验
步骤同实施例3,结果见图8,结果表明,SIRT6内皮特异性基因敲除导致TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1mRNA表达升高,说明HT-AC是通过SIRT6发挥抗血管内皮炎症作用的。
实施例8 HT-AC对SIRT6endo-/-高脂血症炎症小鼠血管内皮通透性的影响实验
步骤同实施例4,结果见图9,结果表明,SIRT6内皮特异性基因敲除导致HT-AC改善高脂血症炎症小鼠血管内皮通透性的能力下降,说明HT-AC是通过SIRT6发挥改善高脂血症炎症小鼠血管内皮通透性作用的。
实施例9 MTT法检测HT和HT-AC对HUVECs细胞活力的影响实验
1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96孔板中每孔加入100μL,铺板使待测细胞调密度1000-10000/孔;
2、5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底,加入不同浓度的HT和HT-AC(0、12.5、25、50、100、200μM);
3、5%CO2,37℃孵育9h;
4、每孔加入10μL MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h;
5、吸去孔内培养液;
6、每孔加入100μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
如图10所示,结果表明,HT和HT-AC对HUVECs细胞活力无影响。
实施例10 HT和HT-AC对TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应的影响实验
HUVECs种6孔板,饥饿12h,HT和HT-AC(25,50,100μM)预处理1h,TNF-α(10ug/L)刺激8h后提RNA。每孔加入1mL的Trizol液进行裂解,其他步骤同实施例3。其中引物序列如下表5:
表5
结果见图11,结果表明,HT和HT-AC能降低IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达,说明HT和HT-AC具有抗炎活性。
实施例11 HT和HT-AC对TNF-α刺激的HUVECs的氧化应激的影响实验
HUVECs种6孔板,饥饿12h,HT和HT-AC(25,50,100μM)预处理1h,TNF-α(10ug/L)刺激8h后,收集上清液检测细胞培养液中SOD活性和MDA含量,6孔板中继续加入稀释好的碧云天ROS检测试剂盒中的试剂DCFH-DA(无血清培养液稀释,稀释比1:1000)1mL,5%CO2,37℃孵育20min。然后用无血清培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞的DCFH-DA。最后通过荧光显微镜进行拍照。
结果见图12,结果表明,与对照组相比,TNF-α组显著降低SOD活性、升高MDA含量和ROS水平,与TNF-α组,HT和HT-AC给药组显著升高SOD活性,TNF-α组MDA含量和ROS水平,说明HT和HT-AC具有抗氧化应激的活性。
实施例12 HT-AC对TNF-α刺激的HUVECs的TNFR1、TNFR2、SIRT6、PKM2表达的影响实验
HUVECs种6孔板,饥饿12h,HT-AC(25,50,100μM)预处理1h,TNF-α(10ug/L)刺激8h后提细胞总蛋白和RNA,以及通过细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒分别提取细胞核和细胞质蛋白,通过Western blotting、real time RT-PCR检测HUVECs中TNFR1、TNFR2、SIRT6和PKM2的表达水平,步骤同实施例5,其中引物序列如下表6:
表6
结果见图13,表明HT-AC能降低TNFR1和PKM2的表达,升高SIRT6的表达,对TNFR1无影响。
此外,通过免疫荧光检测HT-AC对TNF-α刺激的HUVECs的SIRT6和PKM2表达的影响,步骤如下:
(1)HUVECs种细胞爬片,饥饿12h,HT-AC(50μM)预处理1h,TNF-α(10ug/L)刺激8h后取出细胞爬片;
(2)PBS冲洗细胞3次,每次5min;
(3)染核:10%多聚甲醛室温固定30min;
(4)PBS冲洗细胞3次,每次5min;
(5)破膜:0.3%TritonX-100室温破膜30min;
(6)PBS冲洗细胞3次,每次5min;
(7)封闭:10%武汉博士德正常山羊血清室温封闭1h;
(8)甩干血清,不必清洗细胞;
(9)一抗孵育:抗SIRT6和PKM2抗体(1:50,用PBS稀释),室温1h后4℃过夜;
(10)PBS冲洗细胞3次,每次5min;
(11)二抗孵育:加入FITC标记的羊抗兔IgG抗体(1:50,用PBS稀释),室温避光孵育2h后PBS冲洗细胞3次,每次5min;
(12)染核:加入DAPI(1:1000),室温孵育5min,PBS冲洗细胞3次,每次5min;
(13)封片:用抗荧光猝灭剂进行封片,激光共聚焦显微镜拍照。
结果参见图13,从图中可以表明,HT-AC能降低PKM2的表达,升高SIRT6的表达。
实施例13 HT-AC通过TNFR1调控TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应以及SIRT6和PKM2的表达实验
HUVECs种6孔板,饥饿12h,TNFR1中和抗体共孵育30min,HT-AC(50μM)处理1h,TNF-α(10ug/L)再刺激8h后提细胞蛋白和RNA,通过Western blotting、real time RT-PCR检测SIRT6、PKM2、IL-1β、IL-6和MCP-1的表达,步骤同实施例5。
结果见图14,结果表明,TNFR1中和抗体导致SIRT6蛋白和mRNA表达下降,PKM2的蛋白表达、IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达显著升高,说明HT-AC通过TNFR1调控TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应以及SIRT6和PKM2的表达。
实施例14 HT-AC通过TNFR1介导的SIRT6调控TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应以及PKM2的表达实验
1、构建SIRT6沉默或高表达的HUVECs
(1)细胞准备:将状态良好的目的细胞接种到6孔板,使细胞浓度为1.0×105cells/mL,接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。
(2)病毒感染构建SIRT6高表达的HUVECs:感染实验分为三组,空白对照组不添加腺病毒载体,实验组添加SIRT6腺病毒载体,空载组添加等滴度同体积的对照病毒载体,6h后换液,48h后可进行实验。
(3)SIRT6siRNA转染构建SIRT6沉默的HUVECs:沉默实验分为三组,空白对照组不添加siRNA,实验组添加SIRT6siRNA,空载组添加等滴度同体积的NC siRNA。6h后换液,48h后可进行实验。
2、SIRT6沉默或高表达的HUVECs,饥饿12h,HT-AC(50μM)预处理1h,TNF-α(10ug/L)再刺激8h后提细胞蛋白和RNA,通过Western blotting、real time RT-PCR检测SIRT6、PKM2、IL-1β、IL-6和MCP-1的表达,步骤同实施例5。结果见图15,结果表明,SIRT6沉默导致SIRT6蛋白表达下降,PKM2的蛋白表达、IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达显著升高,SIRT6高表达导致SIRT6蛋白表达升高,PKM2的蛋白表达、IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达显著下降,说明HT-AC通过TNFR1介导的SIRT6调控TNF-α刺激的HUVECs的炎症反应以及PKM2的表达。
3、SIRT6沉默或高表达的HUVECs,饥饿12h,HT-AC(50μM)预处理1h,TNF-α(10ug/L)再刺激8h后进行免疫荧光观察PKM2的表达和定位,步骤同实施例12。结果表明,SIRT6沉默导致PKM2的核蛋白表达升高,SIRT6高表达导致PKM2的核蛋白表达下降。
综上,在体内水平,SIRT6内皮特异性敲除小鼠血清中的NO含量及总NOS酶活性显著降低;主动脉中eNOS蛋白表达下调;血管内皮依赖性的舒张功能障碍;血管内皮的渗透性增加,屏障功能受损。证明内皮细胞中SIRT6基因的特异性缺失会导致小鼠发生严重的内皮功能障碍。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (9)
1.羟基酪醇醋酸酯在制备治疗血管内皮功能障碍疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物是通过SIRT6介导的PKM2发挥抗血管内皮炎症作用的药物。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的药物为增加主动脉中SIRT6蛋白和mRNA表达、同时减少主动脉中PKM2蛋白表达的药物。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物为能够降低血脂的药物。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物为能够降低血清中炎症因子TNF-α和IL-1β浓度的药物。
6.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物为能够降低主动脉中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达的药物。
7.羟基酪醇醋酸酯在制备改善血管内皮功能的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的药物为具有抗血管内皮细胞氧化应激和炎症作用的药物。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的药物为改善血管内皮通透性的药物。
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