CN106890332A - 光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统 - Google Patents

光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，包括如下步骤：1)取金纳米笼与高温配体混合，搅拌孵育后，离心，得到高温配体修饰的金纳米笼；其中，高温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为39～50℃；2)取步骤1)得到的高温配体修饰的金纳米笼，分散于硫酸铵溶液中，搅拌，离心后，固体以阿霉素的水溶液分散，避光静置，得到载药金纳米笼；3)取步骤2)得到的载药金纳米笼与低温配体混合，搅拌孵育后，离心，得到光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统；其中，低温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为26～35℃。

Description

光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统
技术领域
本发明属于制药领域，涉及一种具有光热转换效应的金纳米笼，是可以负载化疗药物的新型纳米给药系统，涉及该金纳米笼的制备方法和药物负载方法，以及在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
目前，癌症仍是威胁人类生命和健康的主要疾病之一，全世界癌症发病率呈急剧上升趋势。癌症的治疗一直以来都是国内外研究的难点，临床治疗癌症的方法包括外科手术、放射治疗、热疗和药物化疗。热疗由于具有显著改善药物抗肿瘤效果受到人们广泛关注。通过将肿瘤组织加热到39～42℃，热疗发挥了细胞凋亡、转膜电导改变、Na/K-ATP酶活化以及谷胱甘肽的代谢等多重药物增敏作用。近二十年来随着纳米材料快速的发展，多种热转换纳米材料(如金纳米材料、磁性纳米粒、碳纳米管等)通过选择性地蓄积于肿瘤组织内，可有效地加热那些与关键组织“混居”的恶性肿瘤。特别是与磁性纳米粒磁热疗需要庞大昂贵的交变磁场设备、磁热转换效率低不同，基于金纳米结构的近红外光热治疗(Near-Infrared Region Photothermal Therapy,NIR-PTT)由于具有高效光热转换效率、深部组织穿透能力和良好的生物相容性近年来得到了快速的发展。
光热治疗的好坏直接取决于光热转换材料的选择。荧光染料分子如靛青绿(ICG)首先应用于光热治疗研究，但是因其低的光热转化能力以及小分子易于分布于全身而缺乏特异性等缺点未能广泛应用。近年来一些具有优异光热转换效应的贵金属纳米材料得到快速发展，金纳米棒、金纳米壳，以及金纳米笼。这其中金纳米笼因其稳定的光热转换能力与独特的中空结构受到了广泛研究。
然而单一的热疗并不能起到良好的肿瘤抑制效果，因为热能在肿瘤部位不均匀的传递导致抑瘤不完全。另一方面，化疗因其没有靶向性而引起的副作用限制了它的发展。最近十年内，越来越多的研究结果表明，在肿瘤治疗中，使用热疗和化疗相结合的方法比单一接受化疗或热疗效果更好，无瘤期更长。例如XiaogangQu等人通过领苯二酚键将透明质酸修饰到金纳米笼表面，并利用金笼内部中空的结构负载抗肿瘤药物阿霉素，在近红外光照射下，同时具备化疗和热疗的双重功效，较单一治疗手段呈现更强的抗肿瘤功效。上述技术的药物负载量较低，虽说文章中没有标明，其次，其表面修饰的透明质酸没有刺激响应性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种可进行光热转换的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统，在金纳米笼表面修饰有智能响应型聚合物，并利用硫酸铵远程药物负载技术将阿霉素(Dox)高效负载到金纳米笼内。在近红外光照射下，金纳米笼将光转换成热能，导致温度急剧升高，使得修饰于表面的聚合物收缩，分子布朗运动加快，实现药物在热疗温度下的脉冲释药，从而达到化疗与热疗的协同作用。在小鼠皮下瘤模型上，通过瘤内注射的原位凝胶给药体系，实现光热治疗与化疗的联合治疗。
本发明所提供的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统包含可进行光热转换的金纳米笼，智能响应型聚合物和抗肿瘤药物。(1)金纳米笼为立方体纳米粒，表面带有孔洞，内部中空；(2)粒径为30～200nm，优选40～60nm，孔洞的尺寸1-5nm；(3)在近红外光区(波长700～900nm)有特征峰吸收，最大的吸收峰范围700～1100nm，优选780～810nm(金纳米笼是由银立方通过电化学置换得来，即：不断腐蚀银立方的同时，金元素沉积在银颗粒表面，因金离子是三价的，所以沉积一个金原子要替换三个银原子，所以纳米粒会被掏空。随着掏空程度的逐渐增大，其吸收光谱也逐渐变大，红移到近红外区域，因为近红外区域的光在组织中的穿透性最好，因此可以透过一定程度的组织被纳米粒吸收，因此根据以上关系将金纳米笼的吸收峰调至800nm左右)；(4)表面修饰的聚合物为N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)与丙烯酸(AA)的无规共聚物和嵌段聚合物；(5)药物是以硫酸铵远程药物负载技术封装于金纳米笼内，载药量1～10％，优选8％。
本发明提供的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，包括如下步骤：
1)取金纳米笼与高温配体混合，搅拌孵育后，离心，得到高温配体修饰的金纳米笼；其中，高温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为39～50℃；
2)取步骤1)得到的高温配体修饰的金纳米笼，分散于硫酸铵溶液中，搅拌，离心后，固体以阿霉素的水溶液分散，避光静置，得到载药金纳米笼；
3)取步骤2)得到的载药金纳米笼与低温配体混合，搅拌孵育后，离心，得到光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统；其中，低温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为26～35℃。
优选地，所述光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统中高温配体的比例不少于6wt％，优选为6～11wt％，更优选为9wt％。金纳米笼具有孔洞，药物负载进去后需要其他物质堵住孔洞，我们就采用表面聚合物修饰的方法将金纳米笼孔洞堵住，聚合物具有温敏性，在较低的温度时它处于舒张状态，金笼孔洞被堵住，药物不能释放出来，当激光照射金笼时，温度升高，聚合物收缩，药物释放。6％以上的修饰密度才能具有较好的金笼孔洞“封锁”能力，另外没有选择11％以上的修饰量是为了后期让低温配体具有一定程度的修饰度。
优选地，所述高温配体为N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的无规共聚物；所述低温配体为N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的嵌段聚合物。
优选地，所述高温配体的制备方法包括如下步骤：采用带有二硫键的ATRP引发剂，以N-异丙基丙烯酰胺为温敏单体，丙烯酸酯为pH敏感单体前物进行无规共聚，其中，N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸酯的摩尔比为400:8，然后通过三氟乙酸水解得到高温配体PNA400-co-8。
优选地，所述高温配体的制备方法包括如下步骤：取N-异丙基丙烯酰胺置于反应管中，加入丙酮、水混溶后，除去溶液中的氧气，接着加入丙烯酸叔丁酯，氯化亚铜，Me6TREN，混匀后，除去溶液中的氧气；放入0℃低温恒温反应浴中恒温10分钟，最后加入带有二硫键的ATRP引发剂进行反应，反应24小时，然后通过三氟乙酸水解得到高温配体PNA400-co-8。
优选地，所述低温配体的制备方法包括如下步骤：采用带有二硫键的ATRP引发剂，先进行N-异丙基丙烯酰胺的聚合，待N-异丙基丙烯酰胺聚合完成后，再进行丙烯酸酯的聚合，然后通过三氟乙酸水解得到N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的嵌段聚合物，即为低温配体。
优选地，所述低温配体的制备方法包括如下步骤：
称取N-异丙基丙烯酰胺于反应试管中，加入丙酮与超纯水，全部溶解后，将整个反应试管置于装有液氮的保温瓶中，除去溶液中的氧气，加入氯化亚铜，配体Me6TREN，混匀，除去溶液中的氧气，最后用进样针加入带有二硫键的ATRP引发剂，置于0℃低温恒温反应槽反应，反应后得到聚合物A；取丙烯酸叔丁酯于反应管，经液氮冷冻，真空泵抽真空和氩气填充3个循环后，取无氧的丙烯酸叔丁酯加入聚合物A反应体系中再次反应，制备p(NIPAM-b-tBA)嵌段聚合物；清洗纯化、干燥后，采用三氟乙酸水解，得到p(NIPAM-b-AA)嵌段聚合物，即低温配体。
优选地，所述金纳米笼粒径为30～200nm，其表面孔洞的孔径为1-5nm，所述金纳米笼在近红外光区波长700～900nm有特征峰吸收，最大的吸收峰范围700～1100nm。
更优选地，所述金纳米笼在近红外光区波长700～900nm有特征峰吸收，最大的吸收峰范围在780～810nm。
优选地，所述光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统中阿霉素的含量为1～10wt％。
本发明还提供上述的制备方法制得的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统。
具体地，本发明提供的制备具有热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的方法，包括以下步骤：
步骤一，第一步采用醇还原法制备银纳米立方。
采用乙二醇作为反应溶剂，在150℃高温下搅拌30分钟，利用空气中的氧气将乙二醇氧化成乙二醛，然后由三氟乙酸银提供的银离子再被还原成银原子(式1)，因分子量55,000的聚乙烯吡咯烷酮特性性结合{100}晶面，最终形成银纳米立方，银纳米立方的尺寸可由反应时间进行简单调控，通常反应时间为15到90分钟，优选30到45分钟。
2Ag++HOCH2CHO+H2O→2Ag+HOCH2COOH+2H+(式1)
步骤二，以银纳米立方为模板，采用电化学置换法制备金纳米笼。
因Ag/Ag+(0.80V)电化学势低于Au/AuCl4 -(1.00V)。因此可通过置换反应将金电镀于银立方表面，与此同时将银立方上的银给置换下来(式2)，因一个三价的金离子可以置换3个零价的银原子，所以可以得到表面带有孔洞且内部中空的金纳米笼。
3Ag(s)+AuCl4-(aq)→Au(s)+3Ag+(aq)+4Cl-(aq)(式2)
步骤三，采用原子转移自由基聚合制备具有NIPAM与AA无规共聚物，即高温配体PNA400-co-8。
因聚合物要能与金纳米笼进行结合，因此采用带有二硫键的ATRP引发剂{双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物(BiBOEDS)}，以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为温敏单体，丙烯酸叔丁酯(tBA)为pH敏感单体前物进行无规共聚，然后通过三氟乙酸水解得到高温配体PNA 400-co-8。
步骤四，采用原子转移自由基聚合反应制备NIPAM与丙烯酸的嵌段聚合物，即低温配体PNA 100-b-50。
反应原理同步骤三，但首先进行的是NIPAM的聚合，待NIPAM聚合完成后，再进行tBA的聚合，得到NIPAM与tBA的嵌段聚合物，最后通过三氟乙酸水解得到低温配体PNA100-b-50。
步骤五，将温敏聚合物(高温配体)孵育于金纳米笼表面。
将纯化后的10mL 200ug/mL的金纳米笼与0.2g高温配体PNA 400-co-8进行搅拌孵育，因聚合物含有二硫键，因此聚合物会以金硫键的方式结合于金纳米笼表面，此外由于金纳米笼表面孔洞处反映活性高，聚合物优先结合于孔洞处，48小时后，离心纯化金纳米笼。
步骤六，载药，采用硫酸铵远程药物负载技术将Dox负载于步骤五得到的金纳米笼内。
将孵育有温敏聚合物(高温配体)的金纳米笼分散于10mL 100mM的硫酸铵溶液中，搅拌6小时，离心纯化后，用5毫升1mg/mL的阿霉素溶液经行分散，避光静置过夜，最后离心纯化得到负载阿霉素的金纳米笼。
步骤七，将金纳米笼与温敏聚合物(低温配体)进行孵育。
将步骤六得到的负载阿霉素的金纳米笼与0.2g低温配体进行孵育，搅拌72小时，离心纯化以备下一步使用。
本发明作用与效果：
本发明所提供的热疗-化疗协同作用的金纳米笼，因其表面被温敏聚合物覆盖，阻止了药物的泄露，而当在近红外光照射时，金纳米笼吸收光能转换成热能，温度迅速升高，一方面可以利用热能杀死癌细胞，另一方面，温敏聚合物在高温下迅速收缩，金纳米笼孔洞打开，并且高温加快了化疗小分子药物的布朗运动，使得其产生一个药物的脉冲释放，最终达到一个热疗与化疗的协同效应。
另外我们采取的瘤内注射的方式进行治疗，低温聚合物在生理温度下从流动的溶液状变成不能流动的凝胶态，将载药金纳米笼封锁于肿瘤内，一方面降低了对正常组织的毒副作用，另一方面，金纳米笼在较低的激光照射下就可以获得较高的温度，不但可以获得良好的疗效，而且降低了激光对皮肤的灼伤。
其中，筛选的高温配体的温度在40～45℃，那么在生理温度下聚合物处于舒张状态可以堵住金纳米笼表面孔洞，在激光照射升温后再打开孔洞，起到一个很好的开关作用。
附图说明
图1为本发明的具光热化疗抗肿瘤效应的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的作用示意图；
图2为本发明的具光热化疗抗肿瘤效应的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的载药示意图；
图3A为银纳米立方的电镜图；
图3B为金纳米笼的扫描电镜图；
图3C为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的电镜图(TEM&SEM)；
图4A为银纳米立方、金纳米笼和本发明的具光热化疗抗肿瘤效应的温敏金纳米笼水凝胶系统的吸收光谱图；
图4B为银纳米立方、金纳米笼和本发明的具光热化疗抗肿瘤效应的温敏金纳米笼水凝胶系统的粒径分布图；
图4C为银纳米立方、金纳米笼和本发明的具光热化疗抗肿瘤效应的温敏金纳米笼水凝胶系统的电位图；
图5A为不同pH下高温配体的透光率随温度变化曲线；
图5B为不同pH下低温配体的透光率随温度变化曲线；
图6A为金纳米笼的升温曲线图；
图6B为金纳米笼的升温曲线图；
图6C为金纳米笼的光热稳定性评价图
图7为药物释放曲线；
图8A为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的相变曲线；
图8B为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的剪切变稀曲线；
图8C为激光照射前后本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的相变照片；
图8D为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统其粘弹性模量随温度变化曲线。
图9为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的体内光热效果评价；
图10A为瘤体积随时间变化曲线；
图10B为瘤照片；
图10C是小鼠瘤重图
图10D是小鼠体重图。
图11为pNIPAM400-co-tBA6,pNIPAM400-co-tBA8,pNIPAM400-co-tBA10的GPC图谱。
图12为pNIPAM400-co-tBA6,pNIPAM400-co-tBA8,pNIPAM400-co-tBA10的核磁图谱。
图13为p(NIPAM-b-tBA)100-b-100和p(NIPAM-b-tBA)100-b-50的GPC图谱。
图14为p(NIPAM-b-tBA)100-b-100和p(NIPAM-b-tBA)100-b-50的核磁图谱
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明提供了一种光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统，其包含可进行光热转换的金纳米笼，智能响应型聚合物和抗肿瘤药物。(1)金纳米笼为立方体纳米粒，表面带有孔洞，内部中空；(2)粒径为30～200nm，优选40～60nm，孔洞的尺寸1-5nm；(3)在近红外光区(波长700～900nm)有特征峰吸收，最大的吸收峰范围700～1100nm，优选780～810nm；(4)金纳米笼表面修饰的聚合物为NIPAM与AA的无规共聚物和嵌段聚合物；(5)药物是以硫酸铵远程药物负载技术封装于金纳米笼内，载药量1～10％，优选8％。
其制备方法，包括如下步骤：
1)取金纳米笼与高温配体混合，室温搅拌孵育后，离心，得到高温配体修饰的金纳米笼；其中，高温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为39～50℃；(高温配体用于封闭金纳米笼表面孔洞。高温配体在高温下收缩，使得金纳米笼的孔洞打开，从而金纳米笼中的药物得到释放)
2)取步骤1)得到的高温配体修饰的金纳米笼，分散于硫酸铵溶液中，搅拌，离心后，固体以阿霉素的水溶液分散，避光静置，得到载药金纳米笼；
3)取步骤2)得到的载药金纳米笼与低温配体混合，搅拌孵育后，离心，得到光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统；其中，低温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为26～35℃。(低温配体修饰于金纳米笼表面，在体温下低温配体发生相变收缩变疏水，使得金纳米笼在凝胶化时与凝胶具有更好的相容性)
本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统，是对具有中空结构的金纳米笼进行选择性表面修饰，在金纳米笼表面孔洞附近修饰上具有较高相变温度的高温配体，实现所负载药物在热疗温度下的控制释放。而在金纳米笼表面其它区域修饰具有较低相变温度的低温配体，实现该载药系统在体内温度下的溶胶-凝胶相变。表面修饰的高温配体具有温敏相变特性，即在相变温度下为亲水膨胀状态，堵塞金纳米笼表面孔洞，防止药物泄漏；而在相变温度上转变为疏水收缩状态，表面孔洞打开，释放药物。低温配体具有温敏的溶胶-凝胶相变行为，即在相变温度下为流动的溶胶状态，而在相变温度上转变为不流动的凝胶状态。高温配体的相变温度为39～50℃，优选为40～45℃；低温配体的相变温度为26～35℃，优选32～35℃。
本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统可应用于近红外光热治疗，保证药物的可控释放。金纳米笼在激光照射下具有脉冲释药特性，即激光照射时，金纳米笼将光能转换成热能，传递为金笼表面的温敏聚合物，聚合物在高温下变得疏水收缩，金纳米笼表面孔洞打开，于此同时高温使得金纳米笼里面封装的药物的布朗运动加快，表现为光照下药物的快速的脉冲释放，体现为光照与药物释放的同时性，在肿瘤的治疗中具有热疗与化疗协同作用。
高温配体和低温配体所采用的聚合物是由具有二硫键的引发剂引发聚合，聚合物是通过金硫键结合于金纳米笼表面。金纳米笼表面的聚合物是通过金硫键孵育上去的，首先将金纳米笼与高温配体进行孵育，因金纳米笼表面孔洞出的金活性较高，聚合物优先选择结合于孔洞处，再将金纳米笼与低温配体进行孵育，使低温配体结合于金纳米笼表面。
本发明的高温配体所采用的温敏聚合物是由温敏单体是由N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和亲水单体丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)和苯乙酸磺酸钠(Sodium p-styrenesulfonate)等通过原子转移自由基无规共聚而来，通过调控温敏单体与亲水单体之间的比例调控聚合物的相转变温度。
本发明的高温配体所采用的温敏聚合物是由温敏单体是由氮-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和亲水单体丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸(MAA)和苯乙酸磺酸钠(Sodium p-styrenesulfonate)等通过原子转移自由基聚合按嵌段结构制备而来。
本发明采用硫酸铵远程药物负载技术将Dox高效负载到金纳米笼内。首先将金纳米笼分散于100mM的硫酸铵溶液中，搅拌6小时，离心除去游离的硫酸铵，然后用阿霉素溶液分散负载硫酸铵的金纳米笼，避光静置过夜，最后离心洗涤除去游离的阿霉素。
以下以具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例一
银纳米立方的制备方案，往洁净的250mL圆底烧瓶中加入100mL乙二醇(Ethyleneglycol，EG)，于150℃油浴加热，待烧瓶内温度升至150℃，加入1.2mL 3mM硫氢化钠EG溶液，两分钟后，加入3.0μmol/mL盐酸EG溶液10mL,20mg/mL的PVP溶液25毫升，再等待两分钟，加入282mM的三氟乙酸银溶液8mL，随着反应时间的延长，银纳米立方的尺寸不断增长，优选反应时间为45分钟，尺寸大小约为60nm左右(见图3中A图)，最后置于冰水浴中降温终止反应即可
采用丙酮和超纯水分别对银立方溶液进行离心洗涤处理。
实施例二
采用电化学置换法制备金纳米笼，将纯化后的银纳米立方分散于超纯水中，加入PVP至终浓度为1.5mg/mL，于100℃由于恒温10分钟后，采用微量注射泵加入1mM HAuCl4，流速为42mL/h。随着HAuCl4不断加入，溶液颜色不断发生变化，因金离子不断银原子，其结构从实心不断往空心变化，与此同时其最大特征吸收峰不断往近红外区域的长波长变化，待溶液颜色变成蓝色时，定时取样，测定其吸收光谱，优选最大吸收光谱为800nm的金纳米笼，因此时金纳米笼具有良好的空心结构和孔洞特征，另一方面800nm处的近红外激光对组织具有良好的穿透效应。
实施例三
高温配体的制备方法，采用原子转移自由基聚合法制备温敏聚合物，以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为温敏单体，丙烯酸叔丁酯(tBA)为pH敏感单体前物，双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物(BiBOEDS)为引发剂，三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)为配体，氯化亚铜(CuCl)为催化剂，丙酮与水四比一的混合溶液为溶剂进行ATRP反应，NIPAM:tBA:BiBOEDS:Me6TREN:CuCl摩尔比＝400:x:1:2:2。称取5.66g NIPAM(50mmol)置于反应管中，加入8毫升丙酮，2毫升水混溶后，于液氮中冷却，抽真空5分钟后，用氩气填充并于水中融溶，接着加入tBA(108μL(0.75mmol)、145μL(1mmol)、181μL(1.25mmol))，氯化亚铜25毫克，Me6TREN 67μL，混匀后再进行2次冻(液氮冷却)-抽(抽真空)-通气(氩气填充)循环，放入0℃低温恒温反应浴中恒温10分钟，最后用微量进样针加入BiBOEDS 38μL进行反应，反应24小时，最后优选tBA 145μL的配比(制得PNA 400-co-8)，此配比的聚合物相变温度为40℃附近，满足设计要求。
24小时后过氧化铝柱子除去铜离子，旋蒸除去溶剂，然后用乙醚将产物沉淀出，离心去除上清，再次用乙醚沉淀并洗涤两遍，最后离心除去上清，70℃真空干燥过夜。
采用三氟乙酸将tBA水解成AA。称取2g干燥后的聚合物于250毫升圆底烧瓶，加入40毫升二氯甲烷溶解，于30℃油浴恒温10分钟后，加入3毫升三氟乙酸进行水解，水解反应进行24小时，24小时后旋蒸除去溶剂，采用无水乙醚沉淀产物，离心除去上清，并加入适量乙醚后，用玻璃棒将沉淀物捣碎并超声震荡2分钟(将混于产物中的三氟乙酸尽可能的洗出)，再次离心除去上清，重复上述步骤2次，最后将离心获得的产物置于70℃真空干燥箱干燥过夜。根据不同的tBA加入量，分别得到PNA 400-co-6，PNA 400-co-8和PNA 400-co-10。进行GPC和核磁测定：见图11和图12，图11为pNIPAM400-co-tBA6,pNIPAM400-co-tBA8,pNIPAM400-co-tBA10GPC图谱，三种聚合物的分子量相近，其对应的滞留体积也相似，同样他们的分子量分布均一。图12为pNIPAM，pNIPAM400-co-tBA6,pNIPAM400-co-tBA8,pNIPAM400-co-tBA10核磁图谱，随着丙烯酸叔丁酯的增加，其特征峰面积逐渐增大，且与单体设计设计的摩尔比例接近，表明聚合物已成功制备。
实施例四
低温配体的制备，方法同高温配体的制备，不同之处是先进行NIPAM的聚合再进行tBA的聚合。称取NIPAM单体(2.26g，20mmol)于100mL反应试管，加入8mL丙酮与2mL超纯水，搅拌使NIPAM单体全部溶解，将整个反应试管置于装有液氮的1L的保温瓶中，使整个体系冻成固态，再抽真空，接着用高纯氩气填充融溶，氩气填充后加入氯化亚铜(20mg，0.2mmol)，配体Me6TREN(54uL，0.2mmol)，混匀，再次冷冻—抽真空—通氩气溶融两个循环，最后用进样针加入二硫引发剂(BiBOEDS，32uL，0.1mmol)，置于0℃低温恒温反应槽反应24小时。取4毫升tBA于反应管，经液氮冷冻，真空泵抽真空和氩气填充3个循环后，用5mL的进样针取无氧的丙烯酸叔丁酯tBA(3mL，0.1mol)加入polymer A反应体系中再次反应24小时，制备p(NIPAM-b-tBA)嵌段聚合物。24小时后，用等体积的丙酮稀释产物，过三氧化二铝柱子除去铜离子，接着用旋转蒸发仪除去部分有机试剂，再用大量超纯水将产物析出，抽滤混合物并用大量水洗涤产物，最后将得到的产物置于70℃真空干燥箱，干燥24小时后采用三氟乙酸水解得到PNA 100-b-50。进行GPC和核磁测定：见图13和图14，图13为p(NIPAM-b-tBA)100-b-100和p(NIPAM-b-tBA)100-b-50的GPC图谱，都是单峰表明分散性好，分子量分布均一。p(NIPAM-b-tBA)100-b-100分子量较大所以先被流动相洗出，滞留体积较小。图14为p(NIPAM-b-tBA)100-b-100和p(NIPAM-b-tBA)100-b-50的核磁图谱，叔丁基上特征峰c出现在化学位移1.47处，与NIPAM上异丙基上甲基的特征峰1.17处的峰面积之比为3:2，符合单体比例1:1的设计，p(NIPAM-b-tBA)100-b-50同样符合比例设计。
表1为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的表面修饰聚合物的表征数据；
从表1中可以看出，采用原子转移自由基反应制备的聚合物具有良好的单分散性，实际分子量的分布与理论设计值很接近，另外在前3中共聚物中看出可以通过调控丙烯酸AA与NIPAM的摩尔比例调控聚合物的相变温度(摩尔比为400:8，本文筛选了三种比例，400:6,400:8,400:10,400:6的相变温度低于37℃，400:10相变温度高于45℃，只有400:8相变温度为40℃，满足稍高于生理温度这个条件)。低温配体为NIPAM与AA嵌段聚合物，AA的比例几乎不影响NIPAM的相变温度。
图5为两种不同相变温度的配体的透光率随温度变化曲线，因为NIPAM中含有亲水的酰胺键和疏水的异丙基，在低温时，酰胺键与水分子的氢键作用强于异丙基的疏水作用，宏观上表现为透明溶液，随着温度的升高，酰胺键与水分子的氢键作用被破坏，进而异丙基的疏水作用就占据主导位置，宏观上体现为不透明的浊液。从图5的A图看出随着温度的升高，聚合物的透光率逐渐降低，由原来的透明状变成不透明的乳白状，另外由于AA为pH敏感单体，pH的改变直接影响羧基的电离程度，因此调控溶液的pH值也可以调控聚合物的想变温度。B图为嵌段聚合物的透光率随温度变化曲线，因为聚合物是以嵌段的形式存在，那么NIPAM聚合中间就不会参杂亲水单体AA，这样NAPAM的想变温度就不会受到AA的影响，从而也不会受到pH值改变的影响。
实施例五
将聚合物孵育于金纳米笼表面，将纯化后的10mL 200ug/mL的金纳米笼与0.2g高温配体PNA 400-co-8进行搅拌孵育，因聚合物含有二硫键，因此聚合物会以金硫键的方式结合于金纳米笼表面，此外由于金纳米笼表面孔洞处反映活性高，聚合物优先结合于孔洞处，72小时后，离心纯化金纳米笼。
实施例六
金纳米笼的药物负载，采用硫酸铵远程药物负载技术将Dox负载于金纳米笼内。将孵育有高相变温度的温敏聚合物的金纳米笼分散于10mL 100mM的硫酸铵溶液中，搅拌6小时，离心纯化后，用5毫升1mg/mL的阿霉素溶液进行分散，避光静置过夜，得到载药纳米金笼
实施例七
实施例六得到的载药纳米金笼与0.2g低温配体PNA 100-b-50进行孵育，搅拌72小时，离心纯化得到本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统。其中高温配体的含量为9wt％，低温配体的含量为16.8％wt％，载药量为8wt％。
图1为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的作用示意图。
如图1所示，金纳米笼为表面带有孔洞，内部中空的纳米粒，通过金硫键将温敏聚合物修饰于金纳米笼表面，然后利用金纳米笼中空的内部负载硫酸铵，然后再与阿霉素溶液孵育，使得阿霉素以硫酸铵的盐沉淀的形式负载于金纳米笼内部。接着再与低温配体共混孵育后，注射于小鼠肿瘤中，在生理温度下低温配体发生相变行为，变成不能流动的凝胶态，在激光的照射下升温并释放药物，起到热疗-化疗协同治疗的的效果。
图2为金纳米笼药物负载示意图，加热使得金纳米笼表面的聚合物收缩，孔洞打开，硫酸铵溶液进入金纳米笼内部，再经冰水冷却，使得聚合物舒张开，封住孔洞，将硫酸铵包裹于金纳米笼内部，接着在低温下让金纳米笼与阿霉素溶液共孵育，阿霉素分子因与硫酸铵可形成沉淀，因此不断有阿霉素分子穿过聚合物层进入金纳米笼内形成阿霉素硫酸铵盐沉淀，进而起到药物负载效果。
图3A图为银纳米立方的电镜图，从中可以看出银立方在扫描电镜下为实心的三维立方体结构，带有明显的棱边和尖角，在TEM下显示为二维的正方形，尺寸在50nm左右。以之为模板制备的金纳米笼在扫描电镜(图3B)下为表面带有孔洞的立方体结构，而TEM则反映出金纳米笼带有空心的内腔。将聚合物通过金硫修饰到金纳米笼表面后，在电镜下可以看到金纳米笼表面覆盖了一层3-5nm的聚合物层(图3C)，证明聚合物已经成功修饰到金纳米笼表面。
图4A为为三种材料的吸收光谱，银纳米立方的吸收峰，与夏幼南课题组报道(Facile synthesis of Ag nanocubes and Au nanocages)相符。从图中可以看出，金纳米笼和本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统(HL-GNC)已经在图上标注了不同材料的吸收峰在近红外区域具有很强的吸收，且HL-GNCs的吸收光谱略有红移，这主要是因为聚合物层修饰上后尺寸略有增加；图4B为三种材料的粒径数据，从中看以看出银纳米立方和金纳米笼的粒径很相似，因为金纳米笼是以银纳米立方为模板，通过电化学置换反应制备而来。另外由于其表面吸附有聚乙烯吡咯烷酮，可以形成水化层，因此相较于TEM下50-60nm的尺寸，其水化粒径在100nm左右。而当将聚合物修饰到金纳米笼表面时，因其良好的亲水性与致密的修饰程度，相较于金纳米笼其水化粒径增加到115nm。图4C为三种材料的Zeta电位数据，银纳米立方表明吸附有聚乙烯吡咯烷酮，其体现出较低的Zeta电位值(-21mV)，当通过化学置换反应制备金纳米笼后，表面的聚乙烯吡咯烷酮密度减小，Zeta电位绝对值也相应变低(-8mV)，而当p(NIPAM-co-AA)修饰到金纳米笼表面时，因羧基强大的电负性，其Zeta电位有恢复到-24mV。
将金纳米笼稀释成不同的浓度，取1毫升至于2毫升离心管中，用激光照射，照射的同时，实时用近红外成像仪监控溶液温度的变化。
图6A为金纳米笼的升温曲线图，没有载药金纳米笼代表一类在近红外区有可调的吸收光谱的纳米材料，因其具有强烈的局域表面等离子共振特性而被广泛研究，其最有特色的一点是其优异的光热转换效率。当近红外照射到金纳米笼表面时，金原子表面的电子层会跟随着一起震动，当其震动频率与入射光频率一致时会产生强烈的共振效应，表现为强大的吸收和散射特性。从上图我们可以看出，随着照射时间的延长，金纳米笼溶液的温度逐渐升高，并且高浓度的金纳米笼具有更快的升温速率和更高的升温范围，100ug/mL的金纳米笼溶液在0.4W/cm2激光照射下其在十分钟内温度可以升高近23℃，而5ug/mL的金纳米笼溶液只升高了10℃。图6B说明金纳米笼的升温速率与照射激光的功率也相关，同样的浓度，同样的照射时间，高功率的升温快切幅度大，同样是5ug/mL的金纳米笼溶液在1W/cm2的激光照射下温度可以升高近20℃，100ug/mL的金纳米笼溶液温度更是升高了40℃。金纳米笼优异的光热转换效率为此后的体内实验做了良好的铺垫。图6B为金纳米笼光热稳定性评价，在激光照射前后，金纳米笼的形貌没有受到影响，结构没有发生破坏，在TEM下依旧为中空的方形纳米粒。并且连续照射5次，其升温和降温曲线几乎一致，这表明金纳米笼具有稳定的光热转换能力。图6C说明了金纳米笼的光热稳定性，有些光热材料在激光照射下会发生变化，再次用激光照射升温效果变差，金纳米笼一直都很稳定。图6C为升温降温曲线，用激光照射1毫升金纳米笼溶液体系，在照射的同时，用近红外成像仪实时监控金纳米笼溶液温度的变化值，一直照射10分钟，十分钟后撤去激光，看溶液在后10分钟的降温情况，一共做5个循环，证明金纳米笼在激光照射下不会变形，图6C前后两个电镜图为金纳米笼在激光照射前后的电镜图，证明金纳米笼结构的稳定性。
图7为体外药物释放曲线。由于低温配体对药物释放无影响。因此，对实施例六得到的载药金纳米笼进行体外药物释放的实验。
实验过程：取500uL实施例六得到的载药金纳米笼水溶液(浓度为金1mg/mL，溶于水)，置于2毫升EP管中，用1W/cm2的808激光照射5分钟，离心取上清，测定上清液中阿霉素的含量，沉淀用500uL超纯水再次分散。1小时后再次用1W/cm2的808激光照射5分钟，离心取上清，测定上清液中阿霉素的含量，按以上步骤一共重复照射8次，计算阿霉素的累积释放量。
对照组(另取500uL实施例六得到的载药金纳米笼水溶液(浓度为金1mg/mL，溶于水)作为对照组)，离心测定上清阿霉素浓度后，用水再次分散后，置于37℃摇床，待1小时后再次离心测定上清阿霉素的浓度，一共重复测定8次，计算阿霉素的累积释放量。(图7中阶梯型的曲线为实验组，较平的曲线为对照组)。
从图中可以看出，在生理温度下，随着时间的延长，实施例6的载药金纳米笼的金纳米笼内的药物释放很缓慢，因为高温配体此时仍然处于舒张态，堵住孔洞，限制药物的释放，而在激光照射下，金纳米笼吸收光能转换成热能，温度迅速升高，一方面可以利用热能杀死癌细胞，另一方面，温敏聚合物在高温下迅速收缩，金纳米笼孔洞打开，并且高温加快了化疗小分子药物的布朗运动，使得其产生一个药物的脉冲释放，撤去激光后药物几乎不释放，再次采用激光照射，药物又会出现脉冲释放行为，这表明我们可以通过控制激光照射来灵活调控药物的释放。
本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的体外溶胶-凝胶相变行为实验。实验方法：将1毫升本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统分散于1毫升水中，置于2毫升的样品瓶中，置于恒温水浴中加热5分钟，待载药系统温度恒定，倒置瓶子，看其是否凝胶化，能够粘于瓶底不流下来)。
图8A为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的相变曲线，在相变温度下，金纳米笼混合液处于一个流动的溶胶态，便于注射；在相变温度之上时，金纳米笼混合液处于一个不能流动的凝胶态，从瓶倒转照片可以看出，在相变温度之上时，金纳米笼混合液变现为不能流动的“固体”，粘附在瓶底，倒转过来后依旧不往下落。图8B为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的剪切变稀曲线，这表明可以通过高速剪切，减低溶液的粘度，在进行瘤内注射时便于更好的操作。图8C为激光照射前后金纳米笼混合液的照片，这表明可以通过激光照射使得金纳米笼混合液的温度快速上升，进而形成凝胶态，增加其弹性强度，降低肿瘤内高的间质压带来的影响。图8D为金纳米笼混合液其粘弹性模量随温度变化曲线，从中可以看出，随着温度的上升，聚合的模量有数量级的增加，并且弹性模量显著大于粘性模量，这表明此时材料呈现为“固体”特性，与瓶倒转实验相符。
图9为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的体内光热行为的近红外图像。取雄性Balb/C雄性小鼠20±2g 20只，于小鼠右后腿皮下注射100uL H22肿瘤细胞，7～10天后待肿瘤长至150～200mm3，随机分成4组，每组5只。采用瘤内注射的方式分布往肿瘤注射50uL生理盐水(图9中的生理盐水+光照组)，50uL 100ug/ml的阿霉素溶液(图9中的阿霉素+光照组)，50uL 1000ug/ml金纳米笼溶液(图9中的金纳米笼+光照组)，50uL光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的水溶液(图9中的载药金笼@聚合物+光照组)，载药系统中金笼的浓度为1000ug/ml，阿霉素的浓度为100ug/ml。采用0.4W/cm2激光照射肿瘤，实时用近红外热成像仪监控肿瘤温度。
在注射生理盐水、游离阿霉素、金纳米笼、本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统后，采用0.4W/cm2激光照射时，只有含有金纳米笼的两组，随着照射时间的延长，瘤内的温度会有显著的上升，最高温可达50℃，这表明金纳米笼具有优异光热转换能力，可以满足动物实验的需求。
实施例八
图10为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的药效研究数据。具体实施方法，取40只Balb/C雄性小鼠，于小鼠右后腿部皮下注射200万H22肿瘤细胞，构建老鼠皮下瘤模型，一周后待肿瘤长至150mm3以上时，取35只肿瘤大小较均匀的小鼠按每组5只随机分成7组：1)生理盐水组；2)阿霉素组；3)阿霉素加光照组；4)金笼@聚合物组(金笼@聚合物是指修饰高温配体的金纳米笼与阿霉素的物理混合物，修饰高温配体的金纳米笼的制备方法见实施例5)；5)金笼@聚合物加光照组；6)载药金笼@聚合物组(即为实施例7制备的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统)；7)载药金笼@聚合物加光照组。分别往荷瘤小鼠瘤内注射50微升药物(生理盐水组注射生理盐水；阿霉素组和阿霉素加光照组注射阿霉素(阿霉素的浓度为100ug/mL)；金笼@聚合物组和金笼@聚合物加光照组注射结合有高温配体的金纳米笼和阿霉素的物理混合物(注射液中金纳米笼的浓度为1mg/mL，阿霉素的浓度为100ug/mL)；载药金笼@聚合物组和载药金笼@聚合物加光照组注射本发明制备的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统(注射液中金纳米笼的浓度为1mg/mL)并根据分组进行对3)、5)、7)组采用功率为0.4W/cm2的激光进行照射，每只老鼠照射5分钟，并且每天对小鼠进行体重、瘤长与瘤宽数据记录，并根据公式：
瘤体积＝瘤长×瘤宽×瘤宽/2，计算肿瘤体积，实验进行两周后，处死老鼠，取老鼠肿瘤称重。
从图10A可以看出，除载药金笼@聚合物加光照组外，其余6组的肿瘤体积都具有增大趋势，相较于单一化疗组载药金笼@聚合物组和单一热疗组金笼@聚合物加光照，第7组载药金笼@聚合物加光照与之相比都具有极显著性差异，体现出协同治疗效果。图10B的肿瘤照片与图10A的结果相映衬，第7组载药金笼@聚合物加光照实验组相较于其他6组具有最小的肿瘤，图10C的瘤重图与图10A,图10B两图数据相映衬，显示出载药金笼@聚合物加光照实验组具有最轻的肿瘤肿瘤。图10D为试验老鼠的体重数据，7组实验老鼠体重无明显改变，证明材料具有良好的生物安全性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取金纳米笼与高温配体混合，搅拌孵育后，离心，得到高温配体修饰的金纳米笼；其中，高温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为39～50℃；
2)取步骤1)得到的高温配体修饰的金纳米笼，分散于硫酸铵溶液中，搅拌，离心后，固体以阿霉素的水溶液分散，避光静置，得到载药金纳米笼；
3)取步骤2)得到的载药金纳米笼与低温配体混合，搅拌孵育后，离心，得到光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统；其中，低温配体为含有二硫键的链状温敏聚合物，其相变温度为26～35℃。
2.根据权利要求1所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，所述光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统中高温配体的比例不少于6wt％，优选为6～11wt％，更优选为9wt％。
3.根据权利要求1所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，所述高温配体为N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的无规共聚物；所述低温配体为N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的嵌段聚合物。
4.根据权利要求3所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，所述高温配体的制备方法包括如下步骤：采用带有二硫键的ATRP引发剂，以N-异丙基丙烯酰胺为温敏单体，丙烯酸酯为pH敏感单体前物进行无规共聚，其中，N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸酯的摩尔比为400:8，然后通过三氟乙酸水解得到高温配体PNA400-co-8。
5.根据权利要求4所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，所述高温配体的制备方法包括如下步骤：取N-异丙基丙烯酰胺置于反应管中，加入丙酮、水混溶后，除去溶液中的氧气，接着加入丙烯酸叔丁酯，氯化亚铜，Me6TREN，混匀后，除去溶液中的氧气；放入0℃低温恒温反应浴中恒温10分钟，最后加入带有二硫键的ATRP引发剂进行反应，反应24小时，然后通过三氟乙酸水解得到高温配体PNA400-co-8。
6.根据权利要求3所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，所述低温配体的制备方法包括如下步骤：采用带有二硫键的ATRP引发剂，先进行N-异丙基丙烯酰胺的聚合，待N-异丙基丙烯酰胺聚合完成后，再进行丙烯酸酯的聚合，然后通过三氟乙酸水解得到N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的嵌段聚合物，即为低温配体。
7.根据权利要求6所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，所述低温配体的制备方法包括如下步骤：
称取N-异丙基丙烯酰胺于反应试管中，加入丙酮与超纯水，全部溶解后，将整个反应试管置于装有液氮的保温瓶中，除去溶液中的氧气，加入氯化亚铜，配体Me6TREN，混匀，除去溶液中的氧气，最后用进样针加入带有二硫键的ATRP引发剂，置于0℃低温恒温反应槽反应，反应后得到聚合物A；取丙烯酸叔丁酯于反应管，经液氮冷冻，真空泵抽真空和氩气填充3个循环后，取无氧的丙烯酸叔丁酯加入聚合物A反应体系中再次反应，制备p(NIPAM-b-tBA)嵌段聚合物；清洗纯化、干燥后，采用三氟乙酸水解，得到p(NIPAM-b-AA)嵌段聚合物，即低温配体。
8.根据权利要求1所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，其特征在于，所述金纳米笼粒径为30～200nm，其表面孔洞的孔径为1-5nm，所述金纳米笼在近红外光区波长700～900nm有特征峰吸收，最大的吸收峰范围700～1100nm。
9.根据权利要求1所述的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统的制备方法，所述光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统中阿霉素的含量为1～10wt％。
10.权利要求1～9任一项所述的制备方法制得的具光热化疗抗肿瘤效应的温敏金纳米笼水凝胶载药系统。
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