CN112338199A - 金纳米笼的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于CAR‑T活体CT成像技术领域,具体公开了金纳米笼的制备方法及其应用。金纳米笼的制备方法为配制CF3COOAg母液;配制聚乙烯吡咯烷酮母液;配制盐酸母液;配制NaHS母液,取NaHS母液,盐酸乙二醇母液,乙烯吡咯烷酮母液,CF3COOAg母液反应;将前述步骤所得反应产物转移至离心管中,加入丙酮溶液洗涤纯化,产物再加水分散,离心去上清,洗涤,得到银纳米立方溶液;采用电化学置换法制备金纳米笼。将金纳米笼在CAR‑T活体CT成像剂中进行应用。本发明具有的有益效果是:不易造成细胞因子风暴;通过电转,可一次性对CAR‑T转染,操作流程简单,CAR‑T通过CT成像,具有高衬度,高特异性优点。
Description
技术领域
本发明属于CAR-T活体CT成像技术领域,尤其涉及成像用金纳米笼的制备及应用方法。
背景技术
CAR-T细胞治疗是通过基因工程技术使T细胞表达某些共刺激分子和靶向结合特异性肿瘤抗原的嵌合受体,从而具备进一步活化并对特定肿瘤细胞进行精准杀伤的能力。CAR-T用量过大,会导致细胞因子风暴产生,用量不足,则对白血病治疗效果不加。因此,有必要采取有效手段,监测CAR-T的体内行为。
目前,常用的CAR-T示踪方法为报告基因转染,专利201710648782.3公开了一种体内示踪和人工示踪CAR-t的标签和应用的方法。该方法需要构建慢病毒质粒,对CAR-T进行二次转染。不适用于其他CAR-T的标记。专利201911324560.1公开了一种靶分子标签,通过氨基标记至CAR-T,随后在体内注入核素标签,核素标签于CAR-T结合,进一步通过PET/CT对CAR-T成像。该方法虽然对CAR-T成像精度较高,但是操作繁琐,需要对CAR-T进行二次标记。并且二标在体内如未完全代谢,有风险形成假阳性结果。又如专利20201012290.8公开了一种双色荧光系统活化CAR-T细胞示踪的方法,该方法通过两次转染慢病毒,使CAR-T细胞表达两种颜色荧光。该方法虽然可以通过两种荧光监测对体内CAR-T示踪,或对活化CAR-T示踪,但是多次转染增加了制备流程,并且该方法选用的蛋白表的荧光的穿透力较差,不能很好地在组织中传播,对深部组织的成像可能出现假阴性,只适合小动物实验或者浅表部位信号的探测,限制了该成像方法的临床转化。
发明内容
针对上述问题,本发明提供金纳米笼的制备方法及其应用,主要解决了现有技术容易造成细胞因子风暴,需要二次转染,穿透力较差,不能适用于不同的CAR-T标记等问题。
为了解决上述问题,本发明采用如下技术方案:
金纳米笼的制备方法,
将CF3COOAg溶于乙二醇,配制CF3COOAg母液;称取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇,配制成聚乙烯吡咯烷酮母液;
移取浓盐酸与乙二醇混合,配制盐酸母液;取NaHS加入到乙二醇中,配制NaHS母液,
在150℃-200℃条件下,取NaHS母液,盐酸乙二醇母液,乙烯吡咯烷酮母液,CF3COOAg母液反应;
将前序步骤所得反应产物转移至离心管中,加入丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加入超纯水超声分散,离心去上清,洗涤,得到银纳米立方溶液;
采用电化学置换法制备金纳米笼。
一种方式,A.将CF3COOAg溶于乙二醇,配制成浓度为10-500mg/mL的CF3COOAg母液;取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇,配制成20mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮母液;
移取浓盐酸与乙二醇混合,配制成2.5mmol/L的盐酸母液;称取NaHS加入到乙二醇中,配制成浓度为1-100mg/mL的NaHS母液,
B.在150℃-200℃条件下,按体积份取NaHS母液0.6份,2min后,盐酸乙二醇母液5.0份,PVP母液12.5份,CF3COOAg母液4.0份加入NaHS母液混合,反应;
C.将步骤B所得反应产物转移至离心管中,加入2~3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加入超纯水超声分散,10000-15000rpm离心去上清,重复洗涤,得到精制的银纳米立方溶液;
D.采用电化学置换法制备金纳米笼,通过控制HAuCl4与SNCs加入的相对量调控GNCs中金银两元素的比例为50%-90%。
前述金纳米笼在CAR-T活体CT成像剂中作为追踪试剂成分的应用。
一种方式,应用方法为,将金纳米笼电转至CAR-T细胞,电转条件为脉冲电压400-520V、脉冲宽度20-25ms、脉冲个数1-5个、脉冲间隔1-10ms。
一种方式,电转后的细胞立即离心,细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板,保留上清液。
本发明的有益效果是:
金纳米笼不易造成细胞因子风暴;通过电转,可一次性对CAR-T转染,操作流程简单;金纳米笼标记追踪CAR-T细胞,穿透力较好,具有高衬度,高特异性等优点。
附图说明
图1为金纳米笼转染CAR-T细胞存活率评价图;
图2为金纳米笼转染CAR-T LDH活性值;
图3为GNCs在micro CT成像效果。
具体实施方式
金纳米笼的制备方法为:
将CF3COOAg溶于乙二醇,配制CF3COOAg母液;称取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇,配制成聚乙烯吡咯烷酮母液;
移取浓盐酸与乙二醇混合,配制盐酸母液;取NaHS加入到乙二醇中,配制NaHS母液,
在150℃-200℃条件下,取NaHS母液,盐酸乙二醇母液,乙烯吡咯烷酮母液,CF3COOAg母液反应;
将前述步骤所得反应产物转移至离心管中,加入丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加水分散,离心去上清,洗涤,得到银纳米立方溶液;
采用电化学置换法制备金纳米笼。
应用方法为,将金纳米笼电转至CAR-T细胞,电转条件为脉冲电压400-520V、脉冲宽度20-25ms、脉冲个数1-5个、脉冲间隔1-10ms。
电转后的细胞立即离心,细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板,保留上清液。
实施例1
1.银纳米立方制备。
A.将CF3COOAg溶于乙二醇,配制成浓度为100mg/mL的CF3COOAg母液;称取300mg聚乙烯吡咯烷酮PVP(Mw=55kDa)溶于15mL乙二醇,配制成20mg/mL的PVP母液;
B.移取37%浓盐酸5μL加入到20mL乙二醇中,配制成2.5mmol/L的盐酸母液;称取NaHS(8.4mg,0.15mmol)加入到乙二醇中,配制成浓度为10mg/mL的NaHS母液;
C.取在150℃件下,混合NaHS母液0.6mL,2min后,盐酸乙二醇母液5.0mL,PVP母液12.5mL,CF3COOAg母液4.0mL反应;
D.将步骤C所得反应产物转移至离心管中,加入2~3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加入超纯水超声分散,10000rpm离心10min去上清,重复洗涤两遍,得到精制的银纳米立方(SNCs)溶液;
E.采用电化学置换法制备金纳米笼(GNCs)。
一种方式,移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL,10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中,加入90mL超纯水、150mgPVP,搅拌溶解,于90℃油浴恒温反应,以10~1000mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液10-1000mL,制备得到金元素含量比重为81.3%,原子比例是70.4%的金纳米笼(GNCs)。
2.金纳米笼电转至CAR-T细胞。
A.设置电转条件:脉冲电压(520V、500V、450V、400V)、脉冲宽度(20ms)、脉冲个数(1个)、脉冲间隔(1ms),对细胞进行电转。
所得的CAR-T存活率为40%-85%,电转率为35%-75%。
B.电转后的细胞立即离心(800rpm,5min),细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板,保留上清液。
一种方式,移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL,10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中,加入90mL超纯水、150mg PVP,搅拌溶解,于90℃油浴恒温反应,以10~1000mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液,制备得到吸收峰不同的GNCs。
如图1所示,利用MTT法测定金纳米笼的体外毒性,金纳米笼在培养基中浓度低于100ug/mL时,细胞活率均大于90%,金纳米笼不具备生物毒性。当金纳米笼浓度大于100ug/mL时,细胞活率大于70%,金纳米笼表现为低毒性。本发明所采用金纳米笼用量小于100ug/mL,具备良好的生物安全性。
如图2所示,当金纳米笼浓度小于0.2mg/mL时,细胞LDH值均小于0.3,明显小于破损细胞LDH值,说明细胞膜未发生破裂,金纳米笼对细胞具有良好的生物安全性。
如图3所示,GNCs在micro CT成像效果。
实施例2
1.银纳米立方制备。
A.将CF3COOAg溶于乙二醇,配制成浓度为10mg/mL的CF3COOAg母液;称取300mg聚乙烯吡咯烷酮PVP(Mw=55kDa)溶于15mL乙二醇,配制成20mg/mL的PVP母液;
B.移取37%浓盐酸5μL加入到20mL乙二醇中,配制成2.5mmol/L的盐酸母液;称取NaHS(8.4mg,0.15mmol)加入到乙二醇中,配制成浓度为1mg/mL的NaHS母液;
C.取在150℃条件下,混合NaHS母液0.6mL,2min后,盐酸乙二醇母液5.0mL,PVP母液12.5mL,CF3COOAg母液4.0mL反应;
D.将步骤C所得反应产物转移至离心管中,加入2~3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加入超纯水超声分散,10000rpm离心10min去上清,重复洗涤两遍,得到精制的银纳米立方(SNCs)溶液;
E.采用电化学置换法制备金纳米笼(GNCs)。
一种方式,移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL,10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中,加入90mL超纯水、150mgPVP,搅拌溶解,于90℃油浴恒温反应,以10mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液1000mL,制备得到金元素含量为90%的金纳米笼(GNCs)。
2.金纳米笼电转至CAR-T细胞。
A.设置电转条件:脉冲电压(520V、500V、450V、400V)、脉冲宽度(20ms)、脉冲个数(5个)、脉冲间隔(10ms),对细胞进行电转。
所得的CAR-T存活率为40%-85%,电转率为35%-75%。
B.电转后的细胞立即离心(800rpm,5min),细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板,保留上清液。
一种方式,移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL,10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中,加入90mL超纯水、150mg PVP,搅拌溶解,于90℃油浴恒温反应,以500mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液,制备得到吸收峰不同的GNCs。
实施例3
1.银纳米立方制备。
A.将CF3COOAg溶于乙二醇,配制成浓度为500mg/mL的CF3COOAg母液;称取300mg聚乙烯吡咯烷酮PVP(Mw=55kDa)溶于15mL乙二醇,配制成20mg/mL的PVP母液;
B.移取37%浓盐酸5μL加入到20mL乙二醇中,配制成2.5mmol/L的盐酸母液;称取NaHS(8.4mg,0.15mmol)加入到乙二醇中,配制成浓度为100mg/mL的NaHS母液;
C.取在180℃条件下,混合NaHS母液0.6mL,2min后,盐酸乙二醇母液5.0mL,PVP母液12.5mL,CF3COOAg母液4.0mL反应;
D.将步骤C所得反应产物转移至离心管中,加入2~3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加入超纯水超声分散,10000rpm离心10min去上清,重复洗涤两遍,得到精制的银纳米立方(SNCs)溶液;
E.采用电化学置换法制备金纳米笼(GNCs)。
一种方式,移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL,10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中,加入90mL超纯水、150mgPVP,搅拌溶解,于90℃油浴恒温反应,以1000mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液1000mL,制备得到金元素含量为50%的金纳米笼(GNCs)。
2.金纳米笼电转至CAR-T细胞。
A.设置电转条件:脉冲电压(520V、500V、450V、400V)、脉冲宽度(20ms)、脉冲个数(3个)、脉冲间隔(5ms),对细胞进行电转。
所得的CAR-T存活率为40%-85%,电转率为35%-75%。
B.电转后的细胞立即离心(800rpm,5min),细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板,保留上清液。
一种方式,移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL,10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中,加入90mL超纯水、150mg PVP,搅拌溶解,于90℃油浴恒温反应,以10mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液,制备得到吸收峰不同的GNCs。
本领域的技术人员可以明确,在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下,可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
Claims (8)
1.金纳米笼的制备方法,其特征在于:
将CF3COOAg溶于乙二醇,配制CF3COOAg母液;称取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇,配制成聚乙烯吡咯烷酮母液;
移取浓盐酸与乙二醇混合,配制盐酸母液;取NaHS加入到乙二醇中,配制NaHS母液,
在150℃-200℃条件下,取NaHS母液,盐酸乙二醇母液,乙烯吡咯烷酮母液,CF3COOAg母液反应;
将前述步骤所得反应产物转移至离心管中,加入丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加水分散,离心去上清,洗涤,得到银纳米立方溶液;
采用电化学置换法制备金纳米笼。
2.根据权利要求1所述的金纳米笼的制备方法,其特征在于:
A.将CF3COOAg溶于乙二醇,配制成CF3COOAg母液;取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇,配制成20mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮母液,
移取浓盐酸与乙二醇混合,配制成2.5mmol/L的盐酸母液;称取NaHS加入到乙二醇中,配制成NaHS母液;
B.在150℃-200℃条件下,按体积份取NaHS母液0.6份,2min后,盐酸乙二醇母液5.0份,PVP母液12.5份,CF3COOAg母液4.0份加入NaHS母液混合,反应;
C.将步骤B所得反应产物转移至离心管中,加入2~3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化,所得产物再加入超纯水超声分散,10000-15000rpm离心去上清,重复洗涤,得到精制的银纳米立方溶液;
D.采用电化学置换法制备金纳米笼。
3.根据权利要求2所述的金纳米笼的制备方法,其特征在于:步骤A中,CF3COOAg母液浓度为10-500mg/mL;
NaHS母液浓度为1-100mg/mL。
4.根据权利要求1所述的金纳米笼的制备方法,其特征在于:制备所得金纳米笼的金元素含量为50%-90%。
5.权利要求1-4所述金纳米笼在CT成像剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述CT成像剂为CAR-T所用成像剂。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:应用方法为,将金纳米笼电转至CAR-T细胞,电转条件为脉冲电压400-520V、脉冲宽度20-25ms、脉冲个数1-5个、脉冲间隔1-10ms。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:电转后的细胞离心处理,细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板,保留上清液。
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2020
- 2020-10-20 CN CN202011127337.0A patent/CN112338199B/zh active Active
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