CN112338199B - 金纳米笼的制备方法及其应用 - Google Patents

金纳米笼的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于CAR‑T活体CT成像技术领域，具体公开了金纳米笼的制备方法及其应用。金纳米笼的制备方法为配制CF3COOAg母液；配制聚乙烯吡咯烷酮母液；配制盐酸母液；配制NaHS母液，取NaHS母液，盐酸乙二醇母液，乙烯吡咯烷酮母液，CF3COOAg母液反应；将前述步骤所得反应产物转移至离心管中，加入丙酮溶液洗涤纯化，产物再加水分散，离心去上清，洗涤，得到银纳米立方溶液；采用电化学置换法制备金纳米笼。将金纳米笼在CAR‑T活体CT成像剂中进行应用。本发明具有的有益效果是：不易造成细胞因子风暴；通过电转，可一次性对CAR‑T转染，操作流程简单，CAR‑T通过CT成像，具有高衬度，高特异性优点。

Description

金纳米笼的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于CAR-T活体CT成像技术领域，尤其涉及成像用金纳米笼的制备及应用方法。
背景技术
CAR-T细胞治疗是通过基因工程技术使T细胞表达某些共刺激分子和靶向结合特异性肿瘤抗原的嵌合受体，从而具备进一步活化并对特定肿瘤细胞进行精准杀伤的能力。CAR-T用量过大，会导致细胞因子风暴产生，用量不足，则对白血病治疗效果不加。因此，有必要采取有效手段，监测CAR-T的体内行为。
目前，常用的CAR-T示踪方法为报告基因转染，专利201710648782.3公开了一种体内示踪和人工示踪CAR-t的标签和应用的方法。该方法需要构建慢病毒质粒，对CAR-T进行二次转染。不适用于其他CAR-T的标记。专利201911324560.1公开了一种靶分子标签，通过氨基标记至CAR-T，随后在体内注入核素标签，核素标签于CAR-T结合，进一步通过PET/CT对CAR-T成像。该方法虽然对CAR-T成像精度较高，但是操作繁琐，需要对CAR-T进行二次标记。并且二标在体内如未完全代谢，有风险形成假阳性结果。又如专利20201012290.8公开了一种双色荧光系统活化CAR-T细胞示踪的方法，该方法通过两次转染慢病毒，使CAR-T细胞表达两种颜色荧光。该方法虽然可以通过两种荧光监测对体内CAR-T示踪，或对活化CAR-T示踪，但是多次转染增加了制备流程，并且该方法选用的蛋白表的荧光的穿透力较差，不能很好地在组织中传播，对深部组织的成像可能出现假阴性，只适合小动物实验或者浅表部位信号的探测，限制了该成像方法的临床转化。
发明内容
针对上述问题，本发明提供金纳米笼的制备方法及其应用，主要解决了现有技术容易造成细胞因子风暴，需要二次转染，穿透力较差，不能适用于不同的CAR-T标记等问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
金纳米笼的制备方法，
将CF3COOAg溶于乙二醇，配制CF3COOAg母液；称取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇，配制成聚乙烯吡咯烷酮母液；
移取浓盐酸与乙二醇混合，配制盐酸母液；取NaHS加入到乙二醇中，配制NaHS母液，
在150℃-200℃条件下，取NaHS母液，盐酸乙二醇母液，乙烯吡咯烷酮母液，CF3COOAg母液反应；
将前序步骤所得反应产物转移至离心管中，加入丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加入超纯水超声分散，离心去上清，洗涤，得到银纳米立方溶液；
采用电化学置换法制备金纳米笼。
一种方式，A.将CF3COOAg溶于乙二醇，配制成浓度为10-500mg/mL的CF3COOAg母液；取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇，配制成20mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮母液；
移取浓盐酸与乙二醇混合，配制成2.5mmol/L的盐酸母液；称取NaHS加入到乙二醇中，配制成浓度为1-100mg/mL的NaHS母液，
B.在150℃-200℃条件下，按体积份取NaHS母液0.6份，2min后，盐酸乙二醇母液5.0份，PVP母液12.5份，CF3COOAg母液4.0份加入NaHS母液混合，反应；
C.将步骤B所得反应产物转移至离心管中，加入2～3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加入超纯水超声分散，10000-15000rpm离心去上清，重复洗涤，得到精制的银纳米立方溶液；
D.采用电化学置换法制备金纳米笼，通过控制HAuCl4与SNCs加入的相对量调控GNCs中金银两元素的比例为50％-90％。
前述金纳米笼在CAR-T活体CT成像剂中作为追踪试剂成分的应用。
一种方式，应用方法为，将金纳米笼电转至CAR-T细胞，电转条件为脉冲电压400-520V、脉冲宽度20-25ms、脉冲个数1-5个、脉冲间隔1-10ms。
一种方式，电转后的细胞立即离心，细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板，保留上清液。
本发明的有益效果是：
金纳米笼不易造成细胞因子风暴；通过电转，可一次性对CAR-T转染，操作流程简单；金纳米笼标记追踪CAR-T细胞，穿透力较好，具有高衬度，高特异性等优点。
附图说明
图1为金纳米笼转染CAR-T细胞存活率评价图；
图2为金纳米笼转染CAR-T LDH活性值；
图3为GNCs在micro CT成像效果。
具体实施方式
金纳米笼的制备方法为：
将CF3COOAg溶于乙二醇，配制CF3COOAg母液；称取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇，配制成聚乙烯吡咯烷酮母液；
移取浓盐酸与乙二醇混合，配制盐酸母液；取NaHS加入到乙二醇中，配制NaHS母液，
在150℃-200℃条件下，取NaHS母液，盐酸乙二醇母液，乙烯吡咯烷酮母液，CF3COOAg母液反应；
将前述步骤所得反应产物转移至离心管中，加入丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加水分散，离心去上清，洗涤，得到银纳米立方溶液；
采用电化学置换法制备金纳米笼。
应用方法为，将金纳米笼电转至CAR-T细胞，电转条件为脉冲电压400-520V、脉冲宽度20-25ms、脉冲个数1-5个、脉冲间隔1-10ms。
电转后的细胞立即离心，细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板，保留上清液。
实施例1
1.银纳米立方制备。
A.将CF3COOAg溶于乙二醇，配制成浓度为100mg/mL的CF3COOAg母液；称取300mg聚乙烯吡咯烷酮PVP(Mw＝55kDa)溶于15mL乙二醇，配制成20mg/mL的PVP母液；
B.移取37％浓盐酸5μL加入到20mL乙二醇中，配制成2.5mmol/L的盐酸母液；称取NaHS(8.4mg，0.15mmol)加入到乙二醇中，配制成浓度为10mg/mL的NaHS母液；
C.取在150℃件下，混合NaHS母液0.6mL，2min后，盐酸乙二醇母液5.0mL，PVP母液12.5mL，CF3COOAg母液4.0mL反应；
D.将步骤C所得反应产物转移至离心管中，加入2～3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加入超纯水超声分散，10000rpm离心10min去上清，重复洗涤两遍，得到精制的银纳米立方(SNCs)溶液；
E.采用电化学置换法制备金纳米笼(GNCs)。
一种方式，移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL，10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中，加入90mL超纯水、150mgPVP，搅拌溶解，于90℃油浴恒温反应，以10～1000mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液10-1000mL，制备得到金元素含量比重为81.3％，原子比例是70.4％的金纳米笼(GNCs)。
2.金纳米笼电转至CAR-T细胞。
A.设置电转条件：脉冲电压(520V、500V、450V、400V)、脉冲宽度(20ms)、脉冲个数(1个)、脉冲间隔(1ms)，对细胞进行电转。
所得的CAR-T存活率为40％-85％，电转率为35％-75％。
B.电转后的细胞立即离心(800rpm，5min)，细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板，保留上清液。
一种方式，移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL，10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中，加入90mL超纯水、150mg PVP，搅拌溶解，于90℃油浴恒温反应，以10～1000mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液，制备得到吸收峰不同的GNCs。
如图1所示，利用MTT法测定金纳米笼的体外毒性，金纳米笼在培养基中浓度低于100ug/mL时，细胞活率均大于90％，金纳米笼不具备生物毒性。当金纳米笼浓度大于100ug/mL时，细胞活率大于70％，金纳米笼表现为低毒性。本发明所采用金纳米笼用量小于100ug/mL，具备良好的生物安全性。
如图2所示，当金纳米笼浓度小于0.2mg/mL时，细胞LDH值均小于0.3，明显小于破损细胞LDH值，说明细胞膜未发生破裂，金纳米笼对细胞具有良好的生物安全性。
如图3所示，GNCs在micro CT成像效果。
实施例2
1.银纳米立方制备。
A.将CF3COOAg溶于乙二醇，配制成浓度为10mg/mL的CF3COOAg母液；称取300mg聚乙烯吡咯烷酮PVP(Mw＝55kDa)溶于15mL乙二醇，配制成20mg/mL的PVP母液；
B.移取37％浓盐酸5μL加入到20mL乙二醇中，配制成2.5mmol/L的盐酸母液；称取NaHS(8.4mg，0.15mmol)加入到乙二醇中，配制成浓度为1mg/mL的NaHS母液；
C.取在150℃条件下，混合NaHS母液0.6mL，2min后，盐酸乙二醇母液5.0mL，PVP母液12.5mL，CF3COOAg母液4.0mL反应；
D.将步骤C所得反应产物转移至离心管中，加入2～3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加入超纯水超声分散，10000rpm离心10min去上清，重复洗涤两遍，得到精制的银纳米立方(SNCs)溶液；
E.采用电化学置换法制备金纳米笼(GNCs)。
一种方式，移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL，10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中，加入90mL超纯水、150mgPVP，搅拌溶解，于90℃油浴恒温反应，以10mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液1000mL，制备得到金元素含量为90％的金纳米笼(GNCs)。
2.金纳米笼电转至CAR-T细胞。
A.设置电转条件：脉冲电压(520V、500V、450V、400V)、脉冲宽度(20ms)、脉冲个数(5个)、脉冲间隔(10ms)，对细胞进行电转。
所得的CAR-T存活率为40％-85％，电转率为35％-75％。
B.电转后的细胞立即离心(800rpm，5min)，细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板，保留上清液。
一种方式，移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL，10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中，加入90mL超纯水、150mg PVP，搅拌溶解，于90℃油浴恒温反应，以500mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液，制备得到吸收峰不同的GNCs。
实施例3
1.银纳米立方制备。
A.将CF3COOAg溶于乙二醇，配制成浓度为500mg/mL的CF3COOAg母液；称取300mg聚乙烯吡咯烷酮PVP(Mw＝55kDa)溶于15mL乙二醇，配制成20mg/mL的PVP母液；
B.移取37％浓盐酸5μL加入到20mL乙二醇中，配制成2.5mmol/L的盐酸母液；称取NaHS(8.4mg，0.15mmol)加入到乙二醇中，配制成浓度为100mg/mL的NaHS母液；
C.取在180℃条件下，混合NaHS母液0.6mL，2min后，盐酸乙二醇母液5.0mL，PVP母液12.5mL，CF3COOAg母液4.0mL反应；
D.将步骤C所得反应产物转移至离心管中，加入2～3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加入超纯水超声分散，10000rpm离心10min去上清，重复洗涤两遍，得到精制的银纳米立方(SNCs)溶液；
E.采用电化学置换法制备金纳米笼(GNCs)。
一种方式，移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL，10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中，加入90mL超纯水、150mgPVP，搅拌溶解，于90℃油浴恒温反应，以1000mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液1000mL，制备得到金元素含量为50％的金纳米笼(GNCs)。
2.金纳米笼电转至CAR-T细胞。
A.设置电转条件：脉冲电压(520V、500V、450V、400V)、脉冲宽度(20ms)、脉冲个数(3个)、脉冲间隔(5ms)，对细胞进行电转。
所得的CAR-T存活率为40％-85％，电转率为35％-75％。
B.电转后的细胞立即离心(800rpm，5min)，细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板，保留上清液。
一种方式，移取纯化的SNCs溶液(0.5mg/mL，10mL)至洁净的250mL玻璃瓶中，加入90mL超纯水、150mg PVP，搅拌溶解，于90℃油浴恒温反应，以10mL/h的流速用微量注射泵加入1.0mmol/L的HAuCl4水溶液，制备得到吸收峰不同的GNCs。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (5)

1.金纳米笼在制备CAR-T成像剂中的应用方法，其特征在于，将金纳米笼电转至CAR-T细胞；其中，
电转条件为：脉冲电压400-520V、脉冲宽度20-25ms、脉冲个数1-5个、脉冲间隔1-10ms；
所述金纳米笼的制备步骤为：
将CF3COOAg溶于乙二醇，配制CF3COOAg母液，
称取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇，配制成聚乙烯吡咯烷酮母液，
移取浓盐酸与乙二醇混合，配制盐酸母液，
取NaHS加入乙二醇中，配制NaHS母液；
在150℃-200℃条件下，取NaHS母液，盐酸乙二醇母液，聚乙烯吡咯烷酮母液，CF3COOAg母液反应；
将前述步骤所得反应产物转移至离心管中，加入丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加水分散，离心去上清，洗涤，得到银纳米立方溶液；
采用电化学置换法制得金纳米笼。
2.根据权利要求1所述的金纳米笼在制备CAR-T成像剂中的应用方法，其特征在于，电转后的细胞离心处理，细胞沉淀用培养基吹打混匀并转移至培养板，保留上清液。
3.根据权利要求1所述的金纳米笼在制备CAR-T成像剂中的应用方法，其特征在于，金纳米笼具体通过下述步骤制备：
A.将CF3COOAg溶于乙二醇，配制成CF3COOAg母液；取聚乙烯吡咯烷酮溶于乙二醇，配制成20 mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮母液，
移取浓盐酸与乙二醇混合，配制成2.5mmol/L的盐酸母液；称取NaHS加入到乙二醇中，配制成NaHS母液；
B.在150℃-200℃条件下，按体积份取NaHS母液0.6份，2 min后，盐酸乙二醇母液5.0份，PVP母液12.5份，CF3COOAg母液4.0份加入NaHS母液混合，反应；
C.将步骤B所得反应产物转移至离心管中，加入2～3倍体积量的丙酮溶液洗涤纯化，所得产物再加入超纯水超声分散，10000-15000 rpm离心去上清，重复洗涤，得到精制的银纳米立方溶液；
D.采用电化学置换法制备金纳米笼。
4.根据权利要求1所述的金纳米笼在制备CAR-T成像剂中的应用方法，其特征在于：步骤A中，CF3COOAg母液浓度为10-500mg/mL；
NaHS母液浓度为1-100mg/mL。
5.根据权利要求1所述的金纳米笼在制备CAR-T成像剂中的应用方法，其特征在于：制备所得金纳米笼的金元素含量为50%-90%。
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