CN108261548A - 一种纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米复合物及其制备方法以及其在制备化疗药物细胞保护剂中的应用，属于生物技术及生物医用材料技术领域。所述纳米复合物包括富含GC碱基对的寡聚核苷酸和金纳米笼，所述寡聚核苷酸其中一条链的3’端通过巯基与金纳米笼连接，所述寡聚核苷酸中GC碱基对含量大于50％。本发明提供的纳米复合物Au‑ODN可以通过胞吞作用进入细胞质，可对进入细胞内的化疗药物进行捕获，抑制药物进入细胞核发挥作用。纳米复合物有70～80％可靶向肝脏组织，只有5％左右会进入癌症组织，因此，本发明的纳米复合物Au‑ODN可用于制备化疗药物细胞保护剂，保护肝脏细胞免受药物毒害，且对化疗药物的抗肿瘤效果没有影响。

Description

一种纳米复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种纳米材料及其制备方法、以及其在制备化疗药物细胞保护剂中的应用。

背景技术

癌症是世界上发病率和死亡率最高的疾病之一。目前国际医学界公认的癌症治疗的方法仍然是传统的化疗和放疗，然而在化疗药物使用的同时，会使机体遭受严重的损伤，如肝、肾衰竭，脱发，消瘦等。

近年来随着科学研究的深入，不断有新药进入市场，2015年上市的抗癌药物(Nivolumab)是基于细胞程序性死亡蛋白PD-1设计的小分子药物，在临床试验中取得显著效果，且没有明显副作用，然而这些药物在研发阶段的高成本的投入，使药物的价格较为昂贵。2017年，美国FDA肿瘤药物专家咨询委员会(ODAC)针对诺华CAR-T疗法CTL-019的评估会议上，最终以投票结果一致推荐批准此疗法上市，使为T细胞免疫疗法癌症治疗成为当前研究热点。

尽管如此，目前癌症的治疗仍然以化疗为主，多数患者在接受化疗治疗时，同样会遭受严重的副作用，尤其肝脏作为人体重要的解毒器官，在化疗时会首先遭受药物毒性侵害。因此，在实际化疗时，肿瘤抑制同时伴随着正常的器官严重损伤，进而会加剧癌症的患者后期的复发和耐药性等棘手问题，最终导致患者死亡。

目前，纳米技术和生物技术交叉学科研究，促成多种基于材料的新型癌症治疗方法，如光热治疗、药物载体等，通过控制载体的尺寸，并在其表面修饰肿瘤特异性识别分子，能提高载体肿瘤部位的药物浓度，提升抑癌效果。然而，采用多种肿瘤靶向策略对纳米材料进行修饰后，仍然有50％甚至更多的药物富集在肝脏中，[Yang Wang,In vivo dual-targeted chemotherapy of drug resistant cancer by rationally designednanocarrier,Biomaterials,2016,75,71-81]，而富集在肝脏中的化疗药物仍会产生明显肝毒性。因此，如果在化疗前对正常细胞或组织优先保护再实施化疗治疗，在保证药物抗癌效果的同时，保护正常细胞或组织免受化疗药物毒性的损伤，将为解决癌症治疗中的降低化疗副作用提供潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞保护剂，能够进入细胞质并能捕获进入细胞的化疗药物，保护正常细胞免受化疗药物毒性损伤。

为实现上述目的，本发明提供了一种纳米复合物，包括富含GC碱基对的寡聚核苷酸和金纳米笼，所述寡聚核苷酸的3’端通过巯基与金纳米笼连接，所述寡聚核苷酸中GC碱基对含量大于50％。

作为优选，所述寡聚核苷酸的核苷酸序列为5’-GCAGCTCGAGCGCTGCGCACGCGT-3’，其互补序列为3’-CGTCGAGCTCGCGACGCGTGCGCA-5’；

或者为5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3’，其互补序列为3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-5’。

所述寡聚核苷酸的一条链的3’端的碱基上修饰巯基(SH)，修饰后的序列为：

5’-GCAGCTCGAGCGCTGCGCACGCGT-SH-3’，

3’-CGTCGAGCTCGCGACGCGTGCGCA-5’；

或者：

5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-SH-3’，

3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-5’。

作为优选，所述金纳米笼的粒径为50～100nm。

本发明还提供了一种制备所述纳米复合物的方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)设计合成双链寡聚核苷酸，其中一条链的3’端进行巯基修饰；

(2)将巯基修饰的寡聚核苷酸加入到金纳米笼溶液中，孵育，形成所述的纳米复合物。

寡聚核苷酸(ODN)通过巯基与金原子的配位，连接到金纳米笼上，制备形成纳米复合物Au-ODN。

作为优选，步骤(2)中，金纳米笼与巯基修饰的寡聚核苷酸的摩尔比为1:200～1:500。

本发明研究表明，1个金纳米笼可以与130～300个ODN分子结合形成纳米复合物Au-ODN，在制备纳米复合物时，应该在相对高的ODN浓度下制备。

作为优选，所述金纳米笼溶液为金纳米笼分散于磷酸缓冲液中制得，其浓度为0.1～0.5mg/mL。

作为优选，步骤(2)中，孵育时间为4～24h，孵育过程中加入氯化钠，使其终浓度达到0.1M，并不间断地颠倒混匀反应体系。孵育过程中添加的钠离子，有助于增加金纳米笼与ODN的结合效率。

本发明制备的纳米复合物Au-ODN具有纳米级尺寸，通过细胞胞吞作用进入胞内，在一定时间内稳定存在，具有类似细胞器的作用。研究证明，静脉注射后，纳米复合物有70～80％可靶向肝脏组织，并能进入肝脏组织细胞中，Au-ODN在肝脏细胞内的浓度(约30nM)高于其临界保护浓度(15nM)；而只有5％左右的纳米复合物会进入癌症组织，肿瘤细胞内Au-ODN浓度为5～6nM。

当前的化疗药物，如顺铂、阿霉素等，其抗癌机理是药物进入细胞核插入到DNA双链中，引起DNA链结构破坏，同时限制DNA复制相关酶类，干扰DNA复制，最终引发癌细胞启动细胞凋亡程序。本发明提供的纳米复合物中具有富含GC碱基的寡聚核苷酸，可特异性对上述化疗药物进行捕获。研究证明，进入细胞内的纳米复合物可以有效捕获药物，抑制药物进入细胞核发挥作用。纳米复合物AU-ODN具有良好的生物安全性，对正常组织没有影响。

基于此，本发明提供了一种纳米复合物在制备化疗药物细胞保护剂中的应用。所述的化疗药物为一类可插入富含GC碱基的DNA中的药物，如顺铂、阿霉素等。

所述化疗药物细胞保护剂的作用原理为：Au-ODN经细胞胞吞进入正常体细胞后，化疗药物如盐酸阿霉素(DOX)进入细胞中时，Au-ODN能够有效捕获进入细胞内的药物，阻断药物进入细胞核，使药物不会对正常细胞产生毒性，对正常细胞起到保护作用。

所述纳米复合物Au-ODN在体内主要分布在肝脏组织细胞中，可对肝脏进行保护，且不影响药物的抗肿瘤效果。作为优选，所述细胞为肝脏组织细胞。

本发明还提供了一种化疗药物细胞保护剂，包括所述的纳米复合物。

所述化疗药物细胞保护剂可以为静脉注射制剂，纳米复合物Au-ODN通过血液循环靶向富集于肝脏细胞。

所述纳米复合物Au-ODN的有效注射浓度可为2～10mg/kg，静脉注射2-8h后，开始施行化疗，进入肝脏组织的Au-ODN能有效捕捉进入肝脏的化疗药物，保护肝脏细胞免受药物毒害；由于纳米复合物Au-ODN在肿瘤内的分布较少，因此并不影响药物的抗癌效果。

另外，由于Au-ODN在不同肿瘤组织细胞内的分布会有所差异，因此我们也提供一种用于消除肿瘤细胞内的Au-ODN对抗癌效果影响的备选方案，即采用近红外光局部处理肿瘤使肿瘤细胞内被Au-ODN结合药物充分释放。

本发明具备的有益效果：

本发明提供的纳米复合物Au-ODN可以通过胞吞作用进入细胞内，并可在细胞质中稳定存在一段时间，寡聚核苷酸段可以对进入细胞内的化疗药物进行捕获，抑制药物进入细胞核发挥作用。纳米复合物有70～80％可靶向肝脏组织，只有5％左右的纳米复合物会进入癌症组织，对化疗药物的抗肿瘤效果没有影响，因此，本发明的纳米复合物Au-ODN可用于制备化疗药物细胞保护剂，保护肝脏细胞免受药物毒害。利用本发明的纳米复合物Au-ODN既可抑制肿瘤组织的生长，又成功保护肝脏组织免受化疗药物毒性损伤，提供了一种全新的对抗化疗毒性的方法，为癌症治疗提供一种新思路。

附图说明

图1为本发明使用制备的Au-ODN的SEM(a)及元素分析(b)和TEM(c)的表征结果。

图2为Au-ODN的STEM(a)及元素分析(b-d)表征结果。

图3为Au-ODN在体外捕获DOX(a)，以及Au-ODN在DNase I中稳定性结果(b)。

图4为Au-ODN进入肝脏正常细胞内数量随时间的结果。

图5为Au-ODN在肝脏正常细胞内捕获化疗药物阿霉素的观察。

图6为使用Au-ODN预处理后的肝脏细胞与各对照组在受到DOX处理24h后的细胞存活率。

图7为使用不同浓度的Au-ODN预处理后的肝脏细胞后，细胞内的Au-ODN浓度及其保护细胞的效果。

图8为Western Blot检测Au-ODN在肝脏正常细胞内保护细胞的机理。

图9为QPCR检测Au-ODN在肝脏正常细胞内保护细胞的机理。

图10为采用808nm近红外光(NIR)处理，消除Au-ODN对癌细胞的保护。其中a为激光共聚焦观察肿瘤细胞内被Au-ODN捕获DOX，经NIR处理后再次释放到细胞核内的结果，绿色荧光为Au-ODN(FAM标记的ODN)，红色荧光为DOX，蓝色荧光为细胞核(Hoechest33342)；图b为不同NIR处理时间，对进入细胞核中DOX的定量结果。

图11为采用808nm近红外光(NIR)处理，CCK8法检测细胞存活率。其中a为在Au-ODN+DOX实验组中，采用NIR处理后癌细胞存活率结果；b为NIR处理对Au-ODN，Au，ODN等实验组采用NIR处理后的影响；c为NIR处理消除Au-ODN对癌细胞的保护作用。结果表明，采用NIR介导后，阿霉素药物再次被释放出来，并能有效杀死癌细胞。

图12为Au-ODN在荷瘤小鼠体内的分布。其中a为Au-ODN肝靶向情况；b为Au-ODN的ICP-MS分析结果；c为肝脏组织切片结果；d为各主要器官内细胞内Au-ODN的浓度。

图13为采用Au-ODN后对肝脏保护的机理分析。其中a为小鼠肿瘤体积变化结果；b为小鼠体重变化；c为激光共聚焦观察DOX在肝脏组织细胞内的定位；d为激光共聚焦观察Au-ODN在肝脏组织细胞内捕获DOX情况；e为不用处理组肝脏的变化；f为肝脏组织切片病理检测结果；g为肝功能相关重要标记物检测结果。

图14为其他处理组对小鼠肿瘤组织的影响。其中a为肿瘤体积变化；b为小鼠体重变化；c为小鼠存活率变化；d为其他器官的组织拍照结果。

图15为不同实验组器官HE染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明使用范围。

实验中使用的DMEM培养基和血清为商品化产品。所用的金纳米笼(购自南京东纳生物科技有限公司)、抗体、荧光染料以及相关试剂均为分析纯以上试剂。

实施例1

一、Au-ODN的构建

本发明设计合成的寡聚核苷酸(ODN)序列购自上海捷瑞生物工程有限公司。采用巯基对ODN一条链的3’端进行修饰，序列如下：5’-GCAGCTCGAGCGCTGCGCACGCGT-SH-3’；其互补序列为：3’-CGTCGAGCTCGCGACGCGTGCGCA-5’。

采用市场上购买的金纳米笼(尺寸，50～100nm)，将其分散在磷酸缓冲液(pH7.0左右)中，浓度为0.1～0.5mg/mL，制得金纳米笼溶液；

向金纳米笼溶液中按照金和双链寡聚核苷酸(ODN)摩尔比为1：200～1：500加入合成的ODN，在巯基的作用下，ODN可以有效的与金纳米笼配位并结合到纳米笼上；加入ODN后，向溶液中加入适量的NaCl溶液，使其终浓度为0.1M；然后在室温下继续反应12h，中间不间断的颠倒混匀。反应结束后，离心去掉未结合的ODN，采用培养基重悬，即可制备成Au-ODN纳米复合物。

结构和元素的分析如图1、图2所示。

实施例2

一、纳米复合物Au-ODN对药物的捕获

化疗药物盐酸阿霉素(DOX)，购自阿拉丁公司。

在磷酸缓冲液中配制含有DOX的溶液，使DOX的浓度在1μM左右，然后配制不同浓度的Au-ODN(0.4～3.8nM)，将DOX加入到Au-ODN溶液中，反应30min，颠倒3～5次混匀。

本发明设计合成Au-ODN，可特异性捕获溶液中的化疗药物阿霉素(DOX)，DOX被Au-ODN捕获后，荧光会被减弱或者淬灭，因此可以通过荧光定量的方法，准确检测Au-OND捕获DOX的能力。结果如图3a所示。

二、Au-ODN在DNase I中稳定性

将Au-ODN重悬于磷酸缓冲液，浓度为1～3nM，然后向溶液中加入DOX，终浓度为0.75～1μM，在此浓度范围下，可以使DOX的荧光有效淬灭。然后向溶液中加入DNase I，使其终浓度为2～10U/μM ODN，37℃，继续反应30min～2h后，检测溶液中DOX的荧光强度。根据DOX的荧光强度，得出在DNase I溶液Au-ODN的稳定性。结果如图3b所示。

实施例3

采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测Au-ODN进入肝正常细胞情况，采用CCK8方法检测在化疗药物处理下，Au-DON对正常肝脏细胞活性的保护作用。具体操作如下：

一、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测

(1)将肝脏正常细胞QSG-7701和L02以1×10⁴个/孔的密度分别接种于12孔板中，培养24h后，向细胞培养板中加入培养基重悬的Au-ODN，浓度为5～20μM，ODN的采用荧光染料FAM进行标记，继续培养0～4h，并采用流式细胞仪实时监测Au-ODN进入肝脏细胞的情况，结果如图4所示。

培养结束，将培养基吸掉，并用磷酸缓冲液对细胞洗涤2～3次，去掉未被细胞摄入的细胞器；向细胞中加入含有化疗药物DOX(10～15μM)的细胞培养基。

(2)处理完成后，继续培养细胞4h，然后对细胞采用多聚甲醛固定，然后将细胞核采用Hoechest33342进行染色，染色完成后分别在激光共聚焦显微镜观察细胞形态随时间的变化，结果参见图5。

二、CCK8

(1)将肝脏正常细胞QSG-7701和L02以1×10⁴个/孔的密度分别接种于96孔板中，培养24h后，向细胞培养板中加入培养基重悬的Au-ODN，浓度为10～30μM，ODN的采用荧光染料FAM进行标记，继续培养2～4h。

(2)培养结束，将培养基吸掉，用磷酸缓冲液对细胞洗涤2～3次，去掉未被细胞摄入的细胞器；向细胞中加入含有化疗药物DOX(10～15μM)的细胞培养基。

(3)处理完成后，继续培养细胞24h，向各孔板中加入20μL CCK8溶液(碧云天)，继续培养2～4h，采用酶标仪孔板测450nm的吸光值。

结果显示，Au-ODN预先处理的细胞，在受到化疗药物攻击后，仍然能保持较高活性，超过85％以上的细胞仍然存活，参见图6。

三、细胞内Au-ODN的浓度与保护效果

将肝脏正常细胞QSG-7701和L02以1×10⁴个/孔的密度分别接种于6孔板中，培养24h后，向细胞培养板中加入培养基重悬的Au-ODN，浓度为5～20μM，继续培养0～4h，并采用ICP测量细胞细胞内金元素含量，并根据Au与ODN的配比计算出Au-ODN在肝脏细胞内的浓度，同时检测不同浓度下对细胞的保护效果，采用CCK8检测获得细胞的存活率。结果如图7所示。

以上结果显示没有使用Au-ODN时，DOX能有效进入细胞核；使用Au-ODN后，DOX被捕获停留在细胞质中无法进入细胞核，说明进入细胞的Au-ODN可以有效捕获药物DOX，抑制药物进入细胞核发挥作用；而单独的药物DOX在处理同样时间时，基本都进入细胞核，因而对正常细胞造成显著毒性(存活率低于20％)，其且当肝细胞内的Au-ODN浓度高于15nM左右时，能有效保护细胞免受DOX的杀伤作用。

实施例4

本发明中采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)和Western blot技术分别在转录水平和翻译水平上鉴定Au-ODN对正常细胞保护的机理。DOX造成正常细胞的毒性主要是通过促进细胞凋亡实现的，因此检测与DOX相关的控制细胞凋亡的蛋白Bcl2和Bax，以及凋亡后期caspase3剪切程度，可用于检测Au-ODN对肝正常细胞的保护机理，具体操作：

一、Western Blot

(1)取Au-ODN预先保护的细胞QSG-7701和L02，然后在DOX处理后12h左右收集细胞，在采用Western blot细胞裂解液(添加蛋白酶抑制剂PMSF)将细胞裂解，得到样品记为Au-ODN-DOX实验组，根据检测蛋白的分子量大小不同，配制浓度不同的聚丙烯酰胺凝胶，本实验中采用12％的分离胶；空白处理，Au，OND，Au-ODN，DOX，Au+DOX，ODN+DOX处理组分别作为实验対照组。

(2)BCA法对细胞总蛋白定量后，每孔加入20μg蛋白进行SDS-PAGE；电泳结束后，将蛋白转移到PVDF膜上。

(3)封闭液封闭1h，加入以适当比例稀释的一抗(1:1000-1:5000)，孵育1-2h，洗涤缓冲液TBST洗3次，每次5-10min，再加入碱性磷酸酶偶联的二抗IgG稀释液，摇床轻摇45min，TBST洗3次，每次5-10min，显色，拍照。结果如图8所示。

二、Q-PCR

(1)在转录水平上通过Q-PCR方法鉴定不同细胞中叶酸受体的表达量：选取细胞QSG-7701及L02。

(2)人Bax(基因序号：NM004324)Q-PCR引物设计为：上游引物5′-CCCTTTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3′，下游引物5′-CTTGAGACACTCGCTCAGCTTCTTG-3′；人Bcl(基因序号BC027258)Q-PCR引物设计为：上游引物5′-CTGCACCTGACGCCCTTCACC-3′，下游引物5′-CACATGACCCCACCGAACTCAAAGA-3′；将细胞GAPDH(NM002046.5)作为内参，其上游引物：5′-CCATGACAACTTTGGTATCGTGGAA-3′，下游引物：5′-GGCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

(3)采用TRIzol法提取细胞的总RNA：将样加入1mL TRIzol，剧烈振荡，然后加入0.2mL氯仿，剧烈的振荡15s，室温放置5min，室温12,000rmp离心10min；

(4)转移不多于80％上层水相至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，冰上放置10min，4℃，12,000rpm离心15min，弃去上清；

(5)加入1mL预冷的75％乙醇，上下混匀，4℃，12,000rpm离心5min，弃去上清，空气干燥；

(6)加入30-50μL RNase-Free水，充分溶解后，加入DNase I进行消化，去除基因组DNA污染，分光光度计测定含量和纯度；

(7)然后采用1st-Strand cDNASynthesis Kit将RNA逆转录为DNA，通过Green荧光标记，进行实时荧光定量PCR测试。结果如图9所示。

以上结果显示，DOX进入肝脏细胞后，与细胞凋亡有关的蛋白Bcl2和Bax的表达量有下调和上调，另外也有caspase3蛋白前体发生剪切形成有活性的caspase3，促进细胞的凋亡。而在Au-ODN保护的肝脏细胞中，对进入细胞内DOX捕获后，能有效保持与细胞凋亡相关蛋白表达量与对照组一致的水平上，说明细胞没有发生凋亡，进一步证实Au-ODN能有效保护细胞免受DOX引起的凋亡；而Au+DOX和ODN+DOX实验组中也呈现出明显细胞凋亡趋势，说明单独ODN和Au并不能保护细胞免受DOX药物杀伤作用。

实施例5

本发明提供了一种采用近红外光(NIR)消除Au-ODN对癌细胞的保护备选方案。由于Au-ODN在体外没有细胞选择性，当Au-ODN进入癌细胞时，同样能对癌细胞具有保护作用。然而，由于金纳米笼具有良好的近红外热效应，可以此为据发明一种近红处理的策略消除肿瘤内Au-ODN的保护作用。

一、近红外处理对Au-OND在癌细胞内影响

(1)将人宫颈癌细胞HeLa和乳腺癌细胞以1×10⁵个/孔的密度分别接种于激光共聚焦专用皿中，培养24h后，向细胞培养板中加入培养基重悬的Au-ODN，孵育浓度为0.1～0.3μM，ODN采用荧光染料FAM进行标记，继续培养基2～4h后，将培养基吸掉，并用磷酸缓冲液对细胞洗涤2～3次，去掉未被细胞摄入的Au-ODN；向细胞中加入含有化疗药物DOX(10～15μM)的细胞培养基。

(2)处理完成后，继续培养细胞4h，然后对细胞进行不同时间的近红外光(NIR，808nm)处理，然后将细胞采用多聚甲醛固定，对细胞核进行Hoechest33342染色，采用激光共聚焦显微镜观察细胞内DOX的分布随NIR处理时间的变化，结果参见图10。

二、近红外处理后癌细胞的存活率

(1)将人宫颈癌细胞HeLa和乳腺癌细胞以1×10⁴个/孔的密度分别接种于96孔板中，培养24h后，向细胞培养板中加入培养基重悬的Au-ODN细胞器，继续培养基2～4h后，将培养基吸掉，并用磷酸缓冲液对细胞洗涤2～3次，去掉未被细胞摄入的细胞器；向细胞中加入含有化疗药物DOX(10～15μM)的细胞培养基，加入药物4～6h以后，采用NIR处理不同时间后，继续培养细胞至24h，并以Au，ODN，Au-ODN，DOX单独处理作为对照。

(2)处理完成后，继续培养细胞24h，然后加入CCK8(20μL，碧云天生物技术公司)到反应体系中，培养2～4h后，使用微孔板分光光度计(Bio-Tek)测量450nm的吸收值，该吸收值与细胞活性成正比，参见图11。

结果显示，没有经过NIR照射的癌细胞中，发现Au-ODN可以有效的捕获药物DOX，并阻止药物进入细胞核；然而随NIR处理时间的延长，DOX可以逐渐从Au-ODN中释放出来，并有效进入细胞核，并可以有效的发挥抗癌作用，与游离的DOX抗癌效果接近，说明NIR处理5～10min即可使DOX从Au-ODN中充分释放。

实施例6

构建HeLa肿瘤动物模型用于检测体内Au-ODN在癌症小鼠体内的分布，操作与检测流程如下：

(1)HeLa细胞株以5×10⁶个/只的量接种到裸鼠(10只裸鼠，雌)皮下作为种鼠耐药模型，10天后待肿瘤体积长到80mm³时，开始试验。

(2)静脉注射500μL、1～5mg/mL的Au-ODN(ODN采用cy5标记)，分别于注射不同时间采用小动物成像仪检测。

(3)静脉注射500μL、1～5mg/mL的Au-ODN(ODN采用FAM标记)，分别于注射不同时间处死小鼠，并采用ICP-MS对小鼠各器官内的金元素进行定量确定，同时将各器官组织细胞采用蛋白酶将其打散成单个细胞后，磷酸缓冲液洗涤3次以上，采用荧光定量方法检测Au-ODN在组织细胞的浓度。

(4)采用TEM观察器官的切片，以确定Au-ODN在体内能被肝脏细胞胞吞。

(5)在静脉注射Au-ODN 2～4h后，静脉注射药物DOX，注射DOX后4～6h，处死小鼠，采用激光共聚焦观察肝脏的切片，以确定Au-ODN在肝脏细胞捕获药物DOX。

如图12(a)所示，Au-ODN随时间逐渐靶向肝脏；图12(b)通过ICP-MS分析得出，超过70％Au-ODN定位在肝脏组织内；图12(c)肝脏组织切片结果表明，Au-ODN可以有效进入肝脏细胞内；图12(d)小鼠器官细胞内的Au-ODN浓度。说明Au-ODN经静脉注射4h后能进入肝脏细胞，且在细胞内的浓度远高于其临界保护浓度。

实施例7

构建HeLa肿瘤小鼠动物模型用于检测在癌症化疗中的Au-ODN对肝脏的保护，操作与检测流程如下：

(1)HeLa细胞株以5×10⁶个/只的量接种到裸鼠(80只裸鼠，雌)皮下作为裸鼠模型，10天后待肿瘤体积长到80mm³时，开始试验。

(2)静脉注射500μL、1mg/mL的Au-ODN，注射后2～4h内注射药物DOX(5mg/Kg)，每两天重复一次。

(3)每日观察小鼠体征，每隔2日记录小鼠体重，测量肿瘤的最长径L和最短径B，利用公式V＝0.5×L×B²计算小鼠肿瘤体积。

(4)为进一步拓展Au-ODN的应用，本发明进一步采用近红外光处理，采用NIR对Au-ODN+DOX组肿瘤进行NIR处理5～10min，进一步消除进入肿瘤的Au-ODN细胞器对药物DOX的捕获，以彻底消除Au-ODN对癌症化疗的影响。

(5)在实验结束时，取小鼠的血液常规和生化进行分析，处死小鼠并解剖出各主要器官和肿瘤，称重，拍照记录，并对各组肿瘤进行HE和TUNEL染色，同时对小鼠主要器官进行HE染色评估该方法的安全性。结果参见图13-15。

结果表明，当DOX药物注射进入小鼠体内后，能够有效进入肝细胞的细胞核，并引起肝脏细胞的凋亡；在Au-ODN保护组的小鼠中，进入肝脏细胞内DOX被Au-ODN捕获，进而保护了肝脏细胞免受化疗药物的毒性攻击。而在肿瘤细胞，由于胞内Au-ODN浓度远远低于其临界保护浓度，因而对DOX的抗癌作用影响非常微弱，且这一微弱的影响可以通过NIR处理进一步消除。其他的肝功能检测和病理分析结果同样说明Au-ODN能有效保护肝脏免受化疗药物的毒害作用，真正起到在化疗中保肝护肝的效果。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种纳米复合物及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagctcgag cgctgcgcac gcgt 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtcgagctc gcgacgcgtg cgca 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggggggggg gggggggggg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccccccccc cccccccccc 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccttttgct tcagggtttc atcca 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttgagacac tcgctcagct tcttg 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcacctga cgcccttcac c 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacatgaccc caccgaactc aaaga 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatgacaac tttggtatcg tggaa 25

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggccatcacg ccacagtttc 20

Claims (10)

1.一种纳米复合物，其特征在于，包括富含GC碱基对的寡聚核苷酸和金纳米笼，所述寡聚核苷酸的3’端通过巯基与金纳米笼连接，所述寡聚核苷酸中GC碱基对含量大于50％。

2.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述寡聚核苷酸的核苷酸序列为：5’-GCAGCTCGAGCGCTGCGCACGCGT-3’，其互补序列为：3’-CGTCGAGCTCGCGACGCGTGCGCA-5’；或者为：5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3’，其互补序列为：3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-5’。

3.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述金纳米笼的粒径为50～100nm。

4.如权利要求1-3任一项所述的纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计合成双链寡聚核苷酸，其中一条链的3’端进行巯基修饰；

(2)将巯基修饰的寡聚核苷酸加入到金纳米笼溶液中，孵育，形成所述的纳米复合物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，金纳米笼与巯基修饰的寡聚核苷酸的摩尔比为1:200～1:500。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述金纳米笼溶液为金纳米笼分散于磷酸缓冲液中制得，其浓度为0.1～0.5mg/mL。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，孵育时间为4～24h，孵育过程中加入氯化钠，使其终浓度达到0.1M，并不间断地颠倒混匀反应体系。

8.如权利要求1-3任一项所述的纳米复合物在制备化疗药物细胞保护剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞为肝脏组织细胞。

10.一种化疗药物细胞保护剂，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的纳米复合物。