CN106885859A - 一种酵母抽提水的质量控制方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母抽提水的质量控制方法及其应用。该质量控制方法包括对酵母抽提水中的谷胱甘肽、总氮含量、氨基酸态氮的含量和氨基酸态氮的转化率、以及天冬氨酸和谷氨酸含量进行测定。控制指标中对酵母抽提水中的总体活性成分含量、代表性活性成分含量、有关物质的含量进行了测定与限定，确保了其产品的有效性与安全性。本发明能在较短时间内快速准确的检测酵母抽提水中活性成分、有关物质的含量，控制其产品的质量。其可在化妆品领域、食品领域或生物医药领域中进行酵母抽提水的质量控制。

Description

一种酵母抽提水的质量控制方法及其应用
技术领域
本发明属于化妆品、生物制品或药品质量控制技术领域，特别涉及一种酵母抽提水的质量控制方法及其应用。
背景技术
酵母是人类利用最早、应用范围最广的微生物。酵母细胞是由约35％～50％的蛋白质、5％～10％的核酸、35％～40％的碳水化合物、2.8％～3.0％的脂质、3％～5％的水分和5.5％～6％的灰分组成，其中碳水化合物包含含有海藻糖、糖原、甘露聚糖、葡聚搪和木聚糖等。近年来随着生物技术的发展，酵母的各种使用价值不断被挖掘出来。酵母除了可以被利用来酿酒、制作面包等发酵食品、作为细胞蛋白资源用来缓解蛋白质食品短缺、制作食品调味剂以及制作保健食品以外，酵母细胞在化妆品行业的开发与应用正日益受到重视。通过几十年的努力，研究者们寻求出了一种新的利用微生物生产发酵的方法。该方法具有生产效率高、不受季节和气候条件的影响、生产的的原料来源广泛等特点。但是，目前酵母发酵的开发与应用主要是用于制作饲料、食品、保健食品及医药制品方面；对于酵母发酵技术用于化妆品行列在我国还处于初级阶段，特别是从酵母菌体细胞中制备的酵母抽提水在化妆品中应用的质量控制及其方法还几乎还是空白。如何快速、准确的控制化妆品用的一种酵母抽提水的质量是目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种酵母抽提水的质量控制方法。该方法能够快速、准确的检测出一种以化妆品用为主要目的的酵母抽提水中活性成分的含量，控制其产品的质量。
本发明的另一目的在于提供所述的酵母抽提水的质量控制方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种酵母抽提水的质量控制方法，是对酵母抽提水中的谷胱甘肽、总氮含量、氨基酸态氮的含量和氨基酸态氮的转化率、以及天冬氨酸和谷氨酸含量进行测定。
所述的酵母抽提水指的是用酵母为原料，在冷冻冰晶化低温超微粉碎破壁后，或经酶解自溶后，再经分离提取后得到的产品；优选为按申请号为201610210255.X、发明名称为“一种酵母水及其制备方法与在化妆品中的应用”的专利申请制备得到的酵母抽提水。该酵母抽提水富含氨基酸、小分子肽、多肽等酵母细胞中的可溶性成分。根据需要可添加适量辅料进行调配，也可在生产后期增加美拉德反应工艺，该酵母抽提水属于化妆品或生物医药用配料。
所述的酵母是化妆品用的酵母、食品用的酵母或生物医药用的酵母。
所述的酶解中的酶为酵母自身的酶或外加食品级酶。
所述的酵母抽提水的质量控制方法，还包括对测定结果的判断标准；该判断标准如下：符合如下指标的酵母水提物为合格产品：谷胱甘肽的重量百分比含量≥0.08％、总氮的重量百分比含量≥1.5％、氨基酸态氮的重量百分比含量≥0.5％、氨基酸态氮转化率为25.0～55.0％、天冬氨酸的重量百分比含量≥0.2％且谷氨酸的重量百分比含量≤5.0％。
所述的谷胱甘肽优选为通过HPLC方法测定，具体步骤优选如下：
(1)供试品溶液的制备：取酵母抽提水样品液，经孔径为0.2～0.48μm的微孔滤膜过滤，取过滤液作为供试品溶液，备用；
(2)对照品溶液的制备：取谷胱甘肽对照品30.73mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入超纯水将谷胱甘肽对照品溶解后再用超纯水稀释至刻度，摇匀；该对照品溶液每1mL含谷胱甘肽对照品3.073mg，即得到浓度为10mmol/L的谷胱甘肽对照品溶液，备用；
(3)系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，以体积比为96.3：3.7的三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，流速为每分钟0.6mL；柱温：25℃；蒸发光散射检测器检测；理论板数按酵母抽提水谷胱甘肽峰计算应不低于1500；
其中三氟乙酸水溶液的制备：取三氟乙酸1mL，置1000mL的量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀；
蒸发光散射检测器检测的检测参数：漂移管温度：90℃；氮气流速：1.5L/min；增益：1；模式：inpactor on；
(4)含量测定：分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，得到谷胱甘肽的含量。
所述的总氮含量优选为通过凯氏定氮法测定，具体步骤优选如下：
(A)样品消化：称取酵母抽提水样品2g，精密称定，小心转移到已干燥的凯氏烧瓶中，加入混合催化剂2.5g，缓缓加入浓硫酸20mL，摇匀，小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热30min，得到消化液；其中混合催化剂为硒粉和硫酸钾按质量0.1:100的比例混合配制得到；浓硫酸是浓度为质量百分比98％的硫酸；
(B)样品蒸馏：待消化液冷却后，缓缓加入水250mL，摇匀，冷却，并加入小瓷片，小瓷片的作用是防止爆沸；连接凯氏烧瓶与蒸馏装置，馏出管的尖端插人盛有25mL硼酸溶液和4滴溴甲酚绿混合指示液的锥形瓶中，馏出管尖端应在液面之下；通过加液漏斗加入70mL氢氧化钠溶液于凯氏烧瓶中，轻轻摇匀，使内容物混匀，然后加热蒸馏；待馏出液达到180mL时，停止蒸馏；其中，硼酸溶液的配制步骤如下：称取硼酸3g，用水溶解，并定容至100mL，得到硼酸溶液；溴甲酚绿混合指示液的配制步骤如下：将1g/L溴甲酚绿乙醇溶液和1g/L甲基红乙醇溶液按体积比10:4混合即得；氢氧化钠溶液的配制步骤如下：称取氢氧化钠400g，溶于1L水中，静置，吸取上层清液于带橡皮塞的瓶内即得；
(C)含量测定：用0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定馏出液，颜色由绿色消失转变为灰红色即为终点，记录消耗盐酸标准滴定溶液的毫升数；按上述操作同时进行空白试验；根据滴定测定结果计算总氮含量；其中，盐酸标准滴定溶液按GB/T601配制与标定。
所述的氨基酸态氮的含量优选为通过甲醛滴定法进行测定，具体步骤优选如下：吸取酵母抽提水样品溶液5.0mL于100mL烧杯中，加入55mL水，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH＝8.20，并保持1min不变，此结果为游离酸度，不予计量体积；慢慢加入浓度为质量百分比36％的甲醛溶液10mL，放置1min后，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH＝9.20，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数；同时做空白试验，记录加入浓度为质量百分比36％的甲醛溶液后，空白试验所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数；根据滴定测定结果计算氨基酸态氮的含量；其中，氢氧化钠标准滴定溶液的浓度为0.05mol/L，按GB/T601配制与标定。
所述的氨基酸态氮的转化率优选为通过如下公式计算得到：
氨基酸态氮的转化率＝氨基酸态氮含量÷总氮含量×100％。
所述的天冬氨酸和谷氨酸的含量优选为通过如下步骤测定得到：
1)标准溶液的制备：
天冬氨酸-谷氨酸标准储备溶液：分别称取天冬氨酸6.66mg、谷氨酸36.78mg于10mL的容量瓶，用盐酸溶液溶解，并稀释至刻度，得到标准储备溶液，即该标准储备溶液含天冬氨酸0.005mol/L、谷氨酸0.025mol/L；
天冬氨酸-谷氨酸标准使用溶液：吸取天冬氨酸、谷氨酸标准储备液1mL，用盐酸溶液稀释至1000ml，得到标准使用溶液；每50μL标准使用溶液含有0.25nmol的天冬氨酸和1.25nmol的谷氨酸，相当于50μL该标准使用溶液含有天冬氨酸33.275ng和谷氨酸183.91ng；
其中盐酸溶液的浓度为0.02mol/L，制备方法为：量取1.8mL浓度为质量百分比37％的浓盐酸，注入1000mL高纯水中，摇匀即得；
2)样品制备
称取酵母抽提水样品2g(精确至0.0001g)，加入40mL盐酸溶液，充分搅拌溶解后，全部转移至100mL容量瓶中，并用盐酸溶液稀释至刻度；取上述溶液1.00mL，用盐酸溶液稀释至100mL，再用滤膜过滤；该溶液为样品待测液；
其中盐酸溶液浓度为0.02mol/L，制备方法为：量取1.8mL浓度为质量百分比37％的浓盐酸，注入1000mL高纯水中，摇匀即得；
3)含量测定
分别取50μL的天冬氨酸-谷氨酸标准使用溶液和样品待测液上机测定；使用离子交换氨基酸分析仪，样品经色谱注分离后与水合茚三酮试剂混合，通过记录仪连续不断地自动测量反应产物570nm的吸光度；获得的色谱图，比较标准使用溶液和样品待测液的保留时间来鉴别谷氨酸所产生的峰；记录样品中天冬氨酸、谷氨酸的峰面积、标准溶液中天冬氨酸、谷氨酸的峰面积，计算样品中天冬氨酸、谷氨酸的含量。
所述的酵母抽提水的质量控制方法在化妆品领域、食品领域或生物医药领域中进行应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明首次公开了一种用于化妆品的破壁酵母抽提水的质量控制方法，能够快速、准确的检测出一种破壁酵母抽提水中活性成分的含量，控制其产品的质量。具体如下：
(1)本发明提供了一种酵母抽提水的质量控制方法，该方法能在较短时间内快速准确的检测一种酵母抽提水中活性成分、有关物质的含量，控制其产品的质量；
(2)该质量控制方法中既有总体活性成分含量的控制，又有代表性活性成分含量的测定与限定；
(3)该控制方法中既有活性成分的含量测定与限定；也有有关物质含量的测定与限定，确保了其产品的有效性与安全性。
附图说明
图1是谷胱甘肽标准品与酵母抽提水样品的HPLC-ELSD色谱图；其中，图(A)为谷胱甘肽标准品，图(B)为酵母抽提水样品。
图2是谷胱甘肽的标准工作曲线图。
图3是标准使用溶液中天冬氨酸和谷氨酸的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实验例1HPLC-ELSD法测定酵母抽提水中谷胱甘肽的含量
1材料与方法
1.1仪器与试药
仪器：Thermo U300高效液相色谱(广州紫安科技有限公司)；Alltech 3300型蒸发光散射检测器(ELSD，广州紫安科技有限公司)；
试药：谷胱甘肽(GSH，中国药品生物制品检定所，纯度≥99.4％)；乙腈(色谱纯，国药集团)；三氟乙酸(TFA，天津大茂)；酵母抽提水(批号161214、161228、170125，广州娇兰化妆品有限公司生产，按按申请号为201610210255.X、发明名称为“一种酵母水及其制备方法与在化妆品中的应用”的专利申请的实施例1制备得到的酵母水B，其中复溶所用的水的用量相当于酵母菌体质量10倍量)。
1.2系统适用性
用十八烷基硅烷键合硅胶做为填充剂，以体积比为96.3：3.7的三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，流速为每分钟0.6ml；柱温：25℃；蒸发光散射检测器检测；理论板数按酵母抽提水谷胱甘肽峰计算≥1500；
其中三氟乙酸水溶液的制备：取三氟乙酸1ml，置1000ml的量瓶中,加超纯水稀释至刻度，摇匀。
ELSD参数：蒸发光散射检测器检测；检测参数：漂移管温度：90℃；氮气流速：1.5L/min；增益：1；模式：inpactor on。
1.3对照品储备溶液的制备
取谷胱甘肽对照品约76.83mg，精密称定，置25ml量瓶中，加超纯水使溶解，并稀释至刻度，摇匀，该对照品溶液每1ml含谷胱甘肽对照品3.073mg，即10mmol/L的谷胱甘肽对照品储备溶液，备用；
1.4供试品溶液的制备
取酵母抽提水样品液，经孔径为0.28μm的微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液，备用；
2结果与讨论
2.1线性关系
取谷胱甘肽对照品储备溶液，分别精确吸取0.5、1.5、2.5、4.0、5.0mL，分别置5mL的量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，分别得1.0、3.0、5.0、8.0、10.0mmol/L浓度的谷胱甘肽对照品溶液；取各对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定并记录色谱图；谷胱甘肽对照品与酵母抽提水样品的色谱图见图1；以进样浓度的自然对数对峰面积的自然对数线性回归，得标准工作曲线：lnA＝1.2208lnQ+13.053，R2＝0.9990。结果见表1与图2。
结果表明谷胱甘肽在1.0～10.0mmol/L浓度范围内具有良好线性关系；又因其标准工作曲线为不过原点的直线，故需用外标两点法测定。
表1谷胱甘肽对照品线性测定数据
2.2精密度试验
精确量取浓度为5.0mmol/L的谷胱甘肽对照品溶液20μl，重复连续进样5次，测定谷胱甘肽的峰面积值，结果对照品色谱中谷胱甘肽的峰面积值的平均值为3381965.7，RSD为0.75％，小于2.0％，精密度良好。
2.3稳定性试验
取供试品溶液，在制备后分别在0、2、4、6、8、10、12小时进样测定供试品中谷胱甘肽的峰面积值，每次进样20μl，测得谷胱甘肽峰面积值的平均值为1927459.4；RSD为3.23％。结果表明本品供试品溶液在制备后12小时内稳定。
2.4重现性试验
同一批样品(批号为161214)，精密称定重量，共取5份，按“1.4供试品溶液的制备”项下方法处理并测定，测得供试品中谷胱甘肽含量的平均值为0.0893％；RSD为1.78％。结果表明，本法测定本品中的重现性良好。
2.5回收率测定
取已知含量的样品(批号为161214)5份，每份分别精密加入谷胱甘肽对照品溶液，按样品含量测定方法测定其谷胱甘肽的含量，计算谷胱甘肽的回收率。测得本品中谷胱甘肽的平均回收率为98.33％，RSD为2.01％。结果表明，本法测定本品中谷胱甘肽的回收率良好。
2.6样品中谷胱甘肽的含量测定
按选定的方法，进样供试品液20μl，测定供试品溶液中谷胱甘肽的峰面积值，外标法计算含量，得谷胱甘肽的含量，测得3批样品的平均含量为0.0902％，结果见表2。三批酵母抽提水中谷胱甘肽平均含量为0.0902％。
表2样品中谷胱甘肽的含量测定结果(n＝3)
实验例2酵母抽提水中总氮含量的测定
1材料与方法
1.1仪器与试药
1.1.1仪器：JKXZ06-20B恒温加热消煮炉(常州诺基仪器有限公司)，KjeltecTM8100凯氏定氮仪(德国，FOSS公司)，CP225D微量分析天平(德国，赛多利斯公司)，DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海和呈仪器制造有限公司)；滴定管:50mL。
1.1.2试药：蒸馏水，硫酸钾，硫酸铜，氯化铵，硼酸，甲基红，溴甲酚绿，乙醇，盐酸，氢氧化钠，硫酸，碳酸钠等试剂均为分析纯。酵母抽提水为广州娇兰化妆品有限公司生产。以下试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
1.1.2.1浓硫酸：98％(w/w)。
1.1.2.2氢氧化钠溶液(400g/L)：称取氢氧化钠400g，溶于1L水中，静置，吸取上层清液于带橡皮塞的瓶内。
1.1.2.3硼酸溶液(30g/L)：称取硼酸3g，用水溶解，并定容至100mL。
1.1.2.4混合催化剂：用硒粉、硫酸钾按质量比0.1:100的比例混合。
1.1.2.5盐酸标准滴定溶液[c(HCl)＝0.1mol/L]，按GB/T601配制与标定。
1.1.2.6溴甲酚绿混合指示液：将溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L)和甲基红乙醇溶液(1g/L)按体积比10:4混合。
1.2方法
1.2.1测定流程
1.2.1.1消解：称取酵母抽提水样品约2g，精密称定，小心转移到已干燥的凯氏烧瓶中，加入混合催化剂2.5g，轻轻摇匀后缓缓加入浓硫酸20mL，在恒温加热消煮炉以300℃消解30min，使其完全炭化。再升高温度到400℃继续消化约60min，待液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热30min。取出消解液，放冷备用。
1.2.1.2蒸馏：待消化液冷却后，缓缓加入水250mL，摇匀，冷却，并加入几块小瓷片。连接凯氏烧瓶与蒸馏装置，馏出管的尖端插人盛有25mL硼酸溶液和含溴甲酚绿甲基红混合指示剂的的锥形瓶中，馏出管尖端应在液面之下。通过加液漏斗加入70mL氢氧化钠溶液于凯氏烧瓶中，轻轻摇匀，使内容物混匀，然后加热蒸馏。待馏出液达到180mL时，停止蒸馏；蒸馏停止后用10ml水淋洗冷凝管外部尖端。
1.2.1.3滴定：接收液用盐酸标准溶液(0.1000mol/L)进行滴定，结果用空白试验校正。每个样品重复测定两次，以均值计算含量。
1.3重复性试验：综合消解、蒸馏、滴定，确定酵母抽提水含氮量的自动凯氏定氮仪测定条件。重复测定样品5份。试验结果见表3，方法重复性良好。
表3酵母抽提水含氮量测定重复性试验考察
1.4回收率试验:按上述的凯氏定氮测定条件，取161214批酵母抽提水5份，每份分别精密加入0.05g氯化铵进行回收率试验。平均回收率为101.3％,RSD为1.97％。
2结果与讨论
2.1样品总氮含量测定结果
样品中总氮含量测定结果见表4，三批酵母抽提水中总氮平均含量为1.65％。
表4酵母抽提水样品中总氮的含量测定结果(n＝3)
2.2结论与讨论
用凯氏定氮法检测其酵母抽提水中总氮，按照本试验建立的氮含量的凯氏定氮法测定条件，方法的重复性、精密度与回收率试验结果良好。表明凯氏定氮法能够用于酵母抽提水中总氮含量测定。通过酵母抽提水中总氮含量测定，将总氮量的控制与氨基酸态氮含量控制相结合，对酵母抽提水的整体质量评价具有重要意义。
实施例3酵母抽提水中氨基酸态氮含量测定及氨基酸态氮转化率测定结果
1材料与方法
1.1仪器与试药
1.1.1仪器：CP225D微量分析天平(德国，赛多利斯公司)；S220PH计(上海，梅特勒-托利多仪器有限公司)；恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)；碱式滴定管；容量瓶；锥形瓶等。
1.1.2试药：蒸馏水，氢氧化钠，甲醛等试剂均为分析纯。酵母抽提水为广州娇兰化妆品有限公司生产。以下试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
1.1.2.1氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)＝0.05mol/L]：按GB/T 601配制与标定。
1.1.2.2甲醛溶液(36wt％)。
1.2方法
1.2.1测定流程
吸取酵母抽提水样品溶液5.0mL于100mL烧杯中，加入55mL蒸馏水充分搅拌均匀，用0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH＝8.20，并保持1min不变，此结果为游离酸度，不予计量体积。再准确加入36％甲醛溶液10mL，搅拌10min后，续用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH＝9.20，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时做空白试验，记录加入36％甲醛溶液后，空白试验所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。根据滴定测定结果计算氨基酸态氮含量，即得。
1.2.2精密度实验
对同一生产批次161214批酵母抽提水样品测定氨基酸态氮含量，平行5次测定考察方法的精密度，结果测得161214批酵母抽提水样品中氨基酸态氮平均含量为0.75％，RSD为1.93％；方法的精密度良好。
1.2.3重复性实验
对同一生产批次161214批酵母抽提水样品测定氨基酸态氮含量，重复5次测定考察方法的重现性，结果测得161214批酵母抽提水样品中氨基酸态氮平均含量为0.75％，RSD为2.33％；方法的重现性良好。
1.2.4回收率实验
对对同一生产批次161214批酵母抽提水样品，分别加入不同浓度的L-谷氨酸标准液，按照1.2.1方法操作，测定回收率，每个浓度平行3次检测，结果测定的回收率在96.31％～100.89％之间，平均回收率为98.92％；表明本实验准确度高，实验方法可行、可靠。
2结果与讨论
2.1样品氨基酸态氮含量测定结果
样品中氨基酸态氮含量测定结果见表5，三批酵母抽提水中氨基酸态氮平均含量为0.72％。
表5酵母抽提水样品中氨基酸态氮的含量测定结果(n＝3)
2.2样品氨基酸态氮转化率测定结果
样品中氨基酸态氮转化率测定结果见表6，三批酵母抽提水中氨基酸态氮平均含量为43.46％。
表6酵母抽提水样品中氨基酸态氮的转化率测定结果(n＝3)
2.3结论与讨论
2.3.1用滴定法检测其酵母抽提水中氨基酸态氮的方法具有较好的重复性，其精密度高，重现性好；可用于酵母抽提水中氨基酸态氮的含量检测；
2.3.2通过滴定法检测其酵母抽提水中氨基酸态氮含量与凯氏定氮法检测其酵母抽提水中总氮含量的比值，可得出酵母抽提水样品中氨基酸态氮转化率；
2.3.3通过酵母抽提水中总氮含量测定，将总氮量的控制与氨基酸态氮含量控制相结合，对酵母抽提水的整体质量评价具有重要意义。
实验例4酵母抽提水中天冬氨酸、谷氨酸的含量测定
1仪器与试药
1.1仪器
日立L-8900型氨基酸自动分析仪(包括EZChrom Elite for Hitachi AAA色谱数据处理系统、L-8900Tab分析系统状态屏、珀尔帖柱温箱、自动进样系统、分光光度计，Hitachi公司)；CP225D电子天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q超纯水机(法国Millipore公司)。
1.2试药
酵母抽提水(批号161214、161228、170125，广州娇兰化妆品有限公司生产)；谷氨酸(中国药品生物制品检定所，批号：140690-201401)；天冬氨酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：140691-201401)；H型氨基酸混合标准样品(浓度2nmol/L，和光纯药工业株式会社)；特级茚三酮试剂反应液(日本和光纯药工业株式会社)；L-8500PH-KIT缓冲液(三菱化学株式会社)；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1标准溶液制备
天冬氨酸-谷氨酸标准储备溶液：分别称取天冬氨酸6.66mg、谷氨酸36.78mg于10mL的容量瓶，用盐酸溶液溶解，并稀释至刻度。该溶液含天冬氨酸0.005mol/L、谷氨酸0.025mol/L。
天冬氨酸-谷氨酸标准使用溶液：吸取天冬氨酸-谷氨酸标准储备液1ml，用盐酸溶液稀释至1000mL。每50μL该溶液含有0.25nmol的天冬氨酸和1.25nmol的谷氨酸，相当于50μL该溶液含有天冬氨酸33.275ng和谷氨酸183.91ng。
其中盐酸溶液浓度为0.02mol/L，制备方法为：量取1.8mL浓盐酸，注入1000mL的高纯水中，摇匀即得。
2.2样品溶液制备
称取样品2g(精确至0.0001g)，加入40mL盐酸溶液，充分搅拌溶解后，全部转移至100mL容量瓶中，并用盐酸溶液稀释至刻度；取上述溶液1.00mL，用盐酸溶液稀释至100mL，再用滤膜过滤。该溶液为样品待测液。
其中盐酸溶液浓度为0.02mol/L，制备方法为：量取1.8ml浓盐酸，注入1000ml的高纯水中，摇匀即得。
2.3含量测定
取制备好的天冬氨酸-谷氨酸标准使用溶液和各样品溶液各50μL，分别注入氨基酸分析仪进行测定，样品经色谱注分离后与水合茚三酮试剂混合。测定条件：HITACHI2622SC-PH离子分离柱，色谱柱尺寸4.6mm ID×60mm，日立专用3μm磺酸型阳离子交换树脂，柱温57℃，反应单元温度135℃；泵Ⅰ(缓冲液)流速0.4mL/min，泵压力0.3～25MPa，泵Ⅱ(反应液)流速0.35mL/min，泵压力0～0.2MPa；检测波长：一通道570nm，二通道440nm；进样体积50μL；分析时间：一通道32min，二通道10min；EZChrom EliteTM色谱处理系统分析软件(Hitachi，2005)。分析方法的重复性变异系数小于0.5％。
获得的色谱图，比较标准使用溶液和样品溶液的保留时间来鉴别谷氨酸所产生的峰。记录样品中天冬氨酸、谷氨酸的峰面积、标准使用溶液中天冬氨酸、谷氨酸的峰面积，计算样品中天冬氨酸、谷氨酸的含量即得。
2.4结果分析
2.4.1标准样品的氨基酸色谱图
标准使用溶液的氨基酸图谱见图3。图3是在一通道570nm检测波长下，分析32min的出峰图，按出峰顺序的标样依次为：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。
2.4.2样品中天冬氨酸、谷氨酸的含量
具体测定的酵母抽提水中天冬氨酸、谷氨酸的含量结果见表7。表7结果显示，在3批样品中，均检测出天冬氨酸与谷氨酸，天冬氨酸(Asp)平均含量为0.27％、谷氨酸的平均含量为1.82％，变异系数0.76。
表7酵母抽提水样品中天冬氨酸、谷氨酸的含量测定结果(n＝3)
2.5讨论
用本质量控制方法测定的三批酵母抽提水中天冬氨酸的重量百分比含量≥0.2％，谷氨酸的重量百分比含量≤5.0％。天冬氨酸可代表酵母抽提水中氨基酸的活性成分；谷氨酸即可代表酵母抽提水中氨基酸的活性成分，同时又被作为有关物质限定成分，保证了酵母抽提水质量控制的总体平衡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：是对酵母抽提水中的谷胱甘肽，总氮含量，氨基酸态氮的含量和氨基酸态氮的转化率，以及天冬氨酸和谷氨酸含量进行测定。
2.根据权利要求1所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：所述的酵母抽提水指的是用酵母为原料，在冷冻冰晶化低温超微粉碎破壁后，或经酶解自溶后，再经分离提取后得到的产品。
3.根据权利要求1所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：还包括对测定结果的判断标准；该判断标准如下：符合如下指标的酵母水提物为合格产品：谷胱甘肽的重量百分比含量≥0.08％、总氮的重量百分比含量≥1.5％、氨基酸态氮的重量百分比含量≥0.5％、氨基酸态氮转化率为25.0～55.0％、天冬氨酸的重量百分比含量≥0.2％且谷氨酸的重量百分比含量≤5.0％。
4.根据权利要求1所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：
所述的谷胱甘肽通过HPLC方法测定；
所述的总氮含量通过凯氏定氮法测定；
所述的氨基酸态氮的含量通过甲醛滴定法进行测定。
5.根据权利要求4所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：所述的HPLC方法的具体步骤如下：
(1)供试品溶液的制备：取酵母抽提水样品液，经孔径为0.2～0.48μm的微孔滤膜过滤，取过滤液作为供试品溶液，备用；
(2)对照品溶液的制备：取谷胱甘肽对照品30.73mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入超纯水将谷胱甘肽对照品溶解后再用超纯水稀释至刻度，摇匀；该对照品溶液每1mL含谷胱甘肽对照品3.073mg，即得到浓度为10mmol/L的谷胱甘肽对照品溶液，备用；
(3)系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，以体积比为96.3：3.7的三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，流速为每分钟0.6mL；柱温：25℃；蒸发光散射检测器检测；理论板数按酵母抽提水谷胱甘肽峰计算应不低于1500；
其中三氟乙酸水溶液的制备：取三氟乙酸1mL，置1000mL的量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀；
蒸发光散射检测器检测的检测参数：漂移管温度：90℃；氮气流速：1.5L/min；增益：1；模式：inpactor on；
(4)含量测定：分别精密吸取对照品溶液5μL、20μL，供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，得到谷胱甘肽的含量。
6.根据权利要求4所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：所述的凯氏定氮法的步骤如下：
(A)样品消化：称取酵母抽提水样品2g，精密称定，小心转移到已干燥的凯氏烧瓶中，加入混合催化剂2.5g，缓缓加入浓硫酸20mL，摇匀，小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热30min，得到消化液；其中混合催化剂为硒粉和硫酸钾按质量0.1:100的比例混合配制得到；浓硫酸是浓度为质量百分比98％的硫酸；
(B)样品蒸馏：待消化液冷却后，缓缓加入水250mL，摇匀，冷却，并加入小瓷片；连接凯氏烧瓶与蒸馏装置，馏出管的尖端插人盛有25mL硼酸溶液和4滴溴甲酚绿混合指示液的锥形瓶中，馏出管尖端应在液面之下；通过加液漏斗加入70mL氢氧化钠溶液于凯氏烧瓶中，轻轻摇匀，使内容物混匀，然后加热蒸馏；待馏出液达到180mL时，停止蒸馏；其中，硼酸溶液的配制步骤如下：称取硼酸3g，用水溶解，并定容至100mL，得到硼酸溶液；溴甲酚绿混合指示液的配制步骤如下：将1g/L溴甲酚绿乙醇溶液和1g/L甲基红乙醇溶液按体积比10:4混合即得；氢氧化钠溶液的配制步骤如下：称取氢氧化钠400g，溶于1L水中，静置，吸取上层清液于带橡皮塞的瓶内即得；
(C)含量测定：用0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定馏出液，颜色由绿色消失转变为灰红色即为终点，记录消耗盐酸标准滴定溶液的毫升数；按上述操作同时进行空白试验；根据滴定测定结果计算总氮含量；其中，盐酸标准滴定溶液按GB/T601配制与标定。
7.根据权利要求4所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：所述的甲醛滴定法的具体步骤如下：吸取酵母抽提水样品溶液5.0mL于100mL烧杯中，加入55mL水，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH＝8.20，并保持1min不变，此结果为游离酸度，不予计量体积；慢慢加入浓度为质量百分比36％的甲醛溶液10mL，放置1min后，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH＝9.20，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数；同时做空白试验，记录加入浓度为质量百分比36％的甲醛溶液后，空白试验所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数；根据滴定测定结果计算氨基酸态氮的含量；其中，氢氧化钠标准滴定溶液的浓度为0.05mol/L，按GB/T601配制与标定。
8.根据权利要求1所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：所述的氨基酸态氮的转化率通过如下公式计算得到：
氨基酸态氮的转化率＝氨基酸态氮含量÷总氮含量×100％。
9.根据权利要求1所述的酵母抽提水的质量控制方法，其特征在于：所述的天冬氨酸和谷氨酸的含量通过如下步骤测定得到：
1)标准溶液的制备：
天冬氨酸-谷氨酸标准储备溶液：分别称取天冬氨酸6.66mg、谷氨酸36.78mg于10mL的容量瓶，用盐酸溶液溶解，并稀释至刻度，得到标准储备溶液，即该标准储备溶液含天冬氨酸0.005mol/L、谷氨酸0.025mol/L；
天冬氨酸-谷氨酸标准使用溶液：吸取天冬氨酸、谷氨酸标准储备液1mL，用盐酸溶液稀释至1000ml，得到标准使用溶液；每50μL标准使用溶液含有0.25nmol的天冬氨酸和1.25nmol的谷氨酸，相当于50μL该标准使用溶液含有天冬氨酸33.275ng和谷氨酸183.91ng；
其中盐酸溶液的浓度为0.02mol/L，制备方法为：量取1.8mL浓度为质量百分比37％的浓盐酸，注入1000mL高纯水中，摇匀即得；
2)样品制备
称取酵母抽提水样品2g(精确至0.0001g)，加入40mL盐酸溶液，充分搅拌溶解后，全部转移至100mL容量瓶中，并用盐酸溶液稀释至刻度；取上述溶液1.00mL，用盐酸溶液稀释至100mL，再用滤膜过滤；该溶液为样品待测液；
其中盐酸溶液浓度为0.02mol/L，制备方法为：量取1.8mL浓度为质量百分比37％的浓盐酸，注入1000mL高纯水中，摇匀即得；
3)含量测定
分别取50μL的天冬氨酸-谷氨酸标准使用溶液和样品待测液上机测定；使用离子交换氨基酸分析仪，样品经色谱注分离后与水合茚三酮试剂混合，通过记录仪连续不断地自动测量反应产物570nm的吸光度；获得的色谱图，比较标准使用溶液和样品待测液的保留时间来鉴别谷氨酸所产生的峰；记录样品中天冬氨酸、谷氨酸的峰面积、标准溶液中天冬氨酸、谷氨酸的峰面积，计算样品中天冬氨酸、谷氨酸的含量。
10.权利要求1～9任一项所述的酵母抽提水的质量控制方法在化妆品领域、食品领域或生物医药领域中的应用。
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