CN106868108A - 一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法 - Google Patents

一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106868108A
CN106868108A CN201710024743.6A CN201710024743A CN106868108A CN 106868108 A CN106868108 A CN 106868108A CN 201710024743 A CN201710024743 A CN 201710024743A CN 106868108 A CN106868108 A CN 106868108A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fto
gene polymorphism
primer pair
ftof
ftor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710024743.6A
Other languages
English (en)
Inventor
黄民
王雪丁
管少兴
郑洪�
朱霞
温鼎声
张财斌
胡品津
高翔
郅敏
晁康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Sun Yat Sen University
Original Assignee
National Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Sun Yat Sen University filed Critical National Sun Yat Sen University
Priority to CN201710024743.6A priority Critical patent/CN106868108A/zh
Publication of CN106868108A publication Critical patent/CN106868108A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用PCR方法检测FTO rs16957920基因多态性位点的引物对FTOF/FTOR，其序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。还公开了引物对FTOF/FTOR在检测生物样品FTO rs16957920基因多态性位点方面的应用，以及由其制备的FTO rs16957920基因多态性位点检测试剂盒。利用本发明的引物对及其PCR方法，可以根据扩增电泳结果确定FTO rs16957920基因多态性位点的基因型，对巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，在基因型分析的基础上可以预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗。

Description

一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法
技术领域
本发明属于医学生物技术领域。更具体地，涉及一种检测FTO rs79206939基因多态性的引物及其PCR方法。
背景技术
巯基嘌呤类药物以６－巯基嘌呤（6-mercaptopurine）、６－硫鸟嘌呤（6-thioguanine）以及其前体形式硫唑嘌呤（Azathioprine）为代表，对血液性肿瘤、炎症性肠病、绒毛膜上皮癌和恶性葡萄胎的治疗均有很好的疗效，除此之外，也被广泛运用于外科、消化内科以及皮肤科等多种临床常见病治疗。
但是，该类药物在体内的代谢复杂，疗效和毒性均存在个体差异，不良反应发生率较高，包括骨髓抑制、肝脏损害、胃肠紊乱、胰腺炎和流行感冒样症状等。研究发现，尽管很多因素，例如：性别、年龄、肝肾功能等都可能影响药物治疗的最终结果，但基因仍是造成个体用药差异的要原因。
目前，对巯嘌呤类药物代谢酶及转运体基因多态性研究较为深入，例如TPMT基因多态性可能预测其不良反应发生。但是存在，突变率低，敏感性低，临床应用前景并不十分明朗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种用PCR方法检测FTO rs16957920基因多态性位点的引物对FTOF/FTOR。可以根据电泳结果确定FTOrs16957920基因多态性位点的基因型，结合个体的其他生物学指标对于巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，克服了临床选择巯基嘌呤类药物的盲目性，在基因型分析的基础上可以预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗。
本发明的另一目的是提供上述引物对FTOF/FTOR在制备通过PCR扩增生物样品检测FTO rs16957920基因多态性位点的试剂中的应用。
本发明的再一目的是提供一种包含上述引物对FTOF/FTOR的FTO rs16957920基因多态性位点检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种用PCR方法检测FTO rs16957920基因多态性位点的引物对FTOF/FTOR，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
上述引物对FTOF/FTOR在检测生物样品FTO rs16957920基因多态性位点方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
一种通过PCR扩增生物样品检测FTO rs16957920基因多态性位点的方法，是以待测生物样品的DNA为模板，以上述引物对FTOF/FTOR进行PCR扩增，根据扩增结果确定FTOrs16957920基因多态性位点的基因型。
其中，所述待测生物样品为患者外周血。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为25μl，包括：DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，0.25mmol/L dNTPs 2μl，10μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl ExTaq® 0.15μl，余量ddH2O。
优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，66℃ 30s，72℃1mins，35个循环；72℃ 6min；4℃保存。
另外，上述引物对FTOF/FTOR在制备通过PCR扩增生物样品检测FTO rs16957920基因多态性位点的试剂盒中的应用，以及包含上述引物对FTOF/FTOR 的FTO rs16957920基因多态性位点检测试剂盒，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述试剂盒还含有dNTPs、ExTaq聚合酶。
优选地，所述试剂盒还含有0.25mmol/L的dNTPs、5U/μl的ExTaq聚合酶。
本发明上述引物对FTOF/FTOR以及用PCR方法检测FTO rs16957920基因多态性位点的方法和试剂盒，可以用于检测FTO rs16957920基因多态性位点的基因型。
本发明的引物对FTOF/FTOR以及用PCR方法可以检测FTO rs16957920基因多态性，FTO rs79206939基因多态性与巯嘌呤类药物导致的白细胞减少有关，与药物不良反应有关，因此，可以根据扩增电泳结果确定FTO rs16957920基因多态性位点的基因型，对巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种用PCR方法检测FTO rs16957920基因多态性位点的引物对FTOF/FTOR，其序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。利用本发明的引物对及其PCR方法，可以根据扩增电泳结果确定FTO rs16957920基因多态性位点的基因型，对巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，在基因型分析的基础上可以预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗，克服临床选择巯基嘌呤类药物的盲目性，避免用药不良反应。
而且，本发明的方法简单易行，应用前景广泛。
附图说明
图1为基因分型结果的基因型电泳图谱（PCR-RFLP）；HW为野生型纯合子，HM为突变型纯合子，HT为突变杂合子。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 检测FTO rs16957920基因多态性的引物及其PCR方法
1、实验所需试剂及其配置
（1）DNA提取试剂
6mol/L NaI（上海生工生物工程技术服务有限公司，上海），氯仿，异丙醇，异戊醇，乙醇均为市售分析纯产品。
（2）PCR扩增试剂
Ex Taq®酶（Takara公司，日本），合成引物（上海生工生物工程技术服务有限公司，上海）。
（3）琼脂糖凝胶电泳试剂
普通琼脂糖（Biowest公司，西班牙），低熔点琼脂糖（上海生物工程技术服务有限公司，上海），5×TBE电泳液储存液（0.45 mol/L Tris碱，0.45 mol/L硼酸，0.01 mol/L EDTA，调pH至8.0；Tris、硼酸、EDTA购自上海生工生物工程技术服务有限公司）稀释10倍使用，GoldviewTM Nucleic Acid stain（北京赛百盛生物工程公司，北京）。
（4）DL1000、DL2000 DNA Ladder Marker（Takara公司，日本）。
（5）0.5 M EDTA溶液
称取186.1 g EDTA·2H2O于1L烧杯中，加800 ml去离子水，充分搅拌，加NaOH调节pH至8.0，搅拌至完全溶解，加去离子水定容至L，高温高压灭菌。
（6）5×TBE溶液
称取54g Tris，27.5 g硼酸，置于烧杯中，加适量双蒸水搅拌溶解；加入0.5M EDTA溶液20ml，加双蒸水定容至1L，制成5×TBE储备液。储备液将稀释10倍为0.5×TBE溶液使用。
（7）6 M NaI溶液
称取45g NaI置于烧杯中，加双蒸水搅拌溶解，定容至50 ml，避光保存。
2、实验所需主要仪器
ABI GeneAmp® PCR System 2700 ( Applied Biosystems公司，美国)
Eppendorf MasterCycler® epGradient PCR仪（Eppendorf公司，德国）
DYY－11131C 型水平电泳槽（北京六一仪器厂，北京）
DYY－6C 型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂，北京）
EC3凝胶成像系统（UVP 公司，美国）
Eppendorf 5417R低温离心机（Eppendorf公司，德国）
富华SHA-C型恒温振荡水浴器（常州菲普实验仪器厂，江苏）
DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司，上海）
超低温冰箱（-80℃）（Thermo公司，德国）
3、实验方法
（1）外周血DNA提取
1）取EDTA抗凝全血100 μl，加无菌双蒸水200 μl混匀；
2）加入6 mol/L碘化钠200 μl，混匀；
3）加入氯仿/异戊醇（24:1，v/v）400 μl，反复混匀；然后12000 rpm离心10 min，小心吸出上清液置另一离心管；
4）向上清液加入异丙醇300 μl混匀，室温静置3 min，然后于12000 rpm离心10 min，弃上清；
5）加入70％乙醇500 μl，12000 rpm离心3 min，倒掉乙醇；
6）重复步骤（5）一次，倒置片刻；
7）待管壁晾干后，加入TE缓冲液40 μl溶解DNA，用吸管吹打使DNA充分溶解。
（2）DNA浓度测定及纯化
取样品20 μl，加超纯水至600 μl，充分混匀，用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280 nm、320 nm时的OD值，计算DNA的浓度和纯度。
DNA浓度 (μg/ml)=(OD260-OD320)×50 μg/ml×稀释倍数(30)
DNA纯度=(OD260-OD320)/(OD280-OD320)
DNA纯度为1.8时表示纯度好；<1.6时表示蛋白含量太高，应用氯仿/异戊醇抽提纯化；>1.9时表示有RNA污染，可用RNA酶进行处理。
（3）PCR反应
1）引物设计
设计FTO rs16957920的PCR扩增引物，如表1所示。所有引物序列均经NCBI Blast验证其合理性与特异性。
表1 引物序列
2）PCR反应体系
PCR反应体系为25μl，包括DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，dNTPs 2μl(0.25mmol/L)，上、下游引物各1μl(10μmol/L)，ExTaq® 0.15μl (5U/μl)，用ddH2O补充总体积至25μl。
3）PCR反应条件如表2所示
表2 PCR 反应条件
4、PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳
制胶：称取适量琼脂糖，加入0.5×TBE溶液配制成1%的混悬液，在微波炉中加热至完全溶解，加入终浓度为0.05 μl/ml的Goldview，充分混匀后倒入水平放置的胶模中，凝胶厚度约为5 mm，插上梳子，静止20~30 min。
上样：将制好的凝胶放入电泳槽，电泳缓冲液（同批次0.5×TBE）液面高出凝胶表面1~2 mm，取5 μl扩增产物与1 μl 6×Loading buffer混合后，依次加入加样孔中；190 V电泳15 min。
5、结果
紫外灯下观察电泳结果，并于凝胶成像系统上自动成像，结果如附图1所示，利用本发明的引物对FTOF/FTOR及PCR方法，可以检测鉴定FTO rs16957920基因多态性位点的基因型。
从临床观察来看，突变纯合子对巯基嘌呤类药物的不良反应发生率明显高于突变杂合子，而突变纯合子和突变杂合子这两者的药物不良反应发生率均强于野生型。
因此，可以利用本发明的引物对FTOF/FTOR及PCR方法检测FTO rs16957920基因多态性位点的基因型，从而判断检测对象对巯基嘌呤类药物的不良反应情况，进而指导个性化用药。本发明提供了一种简单易行且具有很强临床应用价值的PCR方法及引物。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种检测FTO rs79206939基因多态性的引物及其PCR方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物FTOF
<400> 1
cactccggta tctcgcatcc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物FTOR
<400> 2
gagcctaaac aactcgggtc a 21

Claims (9)

1.一种用PCR方法检测FTO rs16957920基因多态性位点的引物对FTOF/FTOR，其特征在于，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2. 权利要求1所述引物对FTOF/FTOR在检测生物样品FTO rs16957920基因多态性位点方面的应用。
3. 一种通过PCR扩增生物样品检测FTO rs16957920基因多态性位点的方法，其特征在于，以待测生物样品的DNA为模板，以权利要求1所述引物对FTOF/FTOR进行PCR扩增，根据扩增结果确定FTO rs16957920基因多态性位点的基因型。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为25μl，包括：DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，0.25mmol/L dNTPs 2μl，10μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl ExTaq® 0.15μl，余量ddH2O。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，66℃ 30s，72℃ 1mins，35个循环；72℃ 6min；4℃保存。
6. 权利要求1所述引物对FTOF/FTOR在制备通过PCR扩增生物样品检测FTOrs16957920基因多态性位点的试剂中的应用。
7. 一种FTO rs16957920基因多态性位点检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物对FTOF/FTOR。
8.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含有dNTPs、ExTaq聚合酶。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含有0.25mmol/L的dNTPs、5U/μl的ExTaq聚合酶。
CN201710024743.6A 2017-01-13 2017-01-13 一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法 Pending CN106868108A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710024743.6A CN106868108A (zh) 2017-01-13 2017-01-13 一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710024743.6A CN106868108A (zh) 2017-01-13 2017-01-13 一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106868108A true CN106868108A (zh) 2017-06-20

Family

ID=59157634

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710024743.6A Pending CN106868108A (zh) 2017-01-13 2017-01-13 一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106868108A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1978107A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-08 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Fto gene polymorphisms associated to obesity and/or type II diabetes
CN102304563A (zh) * 2011-04-29 2012-01-04 广州益善生物技术有限公司 一种fto基因多态性检测特异性引物和液相芯片

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1978107A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-08 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Fto gene polymorphisms associated to obesity and/or type II diabetes
CN102304563A (zh) * 2011-04-29 2012-01-04 广州益善生物技术有限公司 一种fto基因多态性检测特异性引物和液相芯片

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN SANG KIM等: "A coding variant in FTO confers susceptibility to thiopurine-induced leukopenia in East Asian patients with IBD", 《GUT》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106544419B (zh) 检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的引物、探针及试剂盒
CN104212904B (zh) 一种用于快速检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒及其使用方法
CN103667514B (zh) 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒
CN103038365A (zh) 用于在dna测序技术中针对酶促效率调整核苷酸浓度的系统和方法
CN103602643B (zh) 一种重组Taq DNA聚合酶及其制备方法
CN105671199A (zh) 结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因ugt1a1的snp检测试剂盒及其使用方法
Galeh et al. Introducing nitazoxanide as a promising alternative treatment for symptomatic to metronidazole-resistant giardiasis in clinical isolates
CN105671142A (zh) 一种检测人类pear1基因多态性的试剂盒及其应用
CN106755352B (zh) 用于快速检测abcb1基因c3435t多态性的核酸、试剂盒及方法
CN101570778A (zh) 一种检测adprt基因多态性的检测方法及试剂盒
CN106119381A (zh) 一种cyp2c19基因多态性检测试剂盒及检测方法
WO2022043774A1 (en) Method for detecting target gene or snp site of target gene by asymmetric pcr combined with magnetosensitive detector and device thereof
Nithya et al. SOD1 gene+ 35A/C (exon3/intron3) polymorphism in type 2 diabetes mellitus among south indian population
Zhao et al. Study on the application of parent-of-origin specific DNA methylation markers to forensic genetics
CN106868109A (zh) 一种检测itpa94c&gt;t基因多态性的引物及其pcr方法
CN106868108A (zh) 一种检测FTOrs79206939基因多态性的引物及其PCR方法
CN106755468A (zh) 一种检测RUNX1rs2268277基因多态性的引物及其PCR方法
CN106755469A (zh) 一种检测IMPDH1rs4731447基因多态性的引物及其PCR方法
CN106868110A (zh) 一种检测PACSIN2rs2413739基因多态性的引物及其PCR方法
CN106011298A (zh) 一种ApoE试剂盒、引物及其用途
KR101068605B1 (ko) Ｎａｔ2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 ｎａｔ2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도
CN107043808A (zh) Ugt1a1基因多态性检测引物肽核酸及其试剂盒
Liu et al. Development and validation of a whole genome amplification long-range PCR sequencing method for ADPKD genotyping of low-level DNA samples
CN102344970B (zh) 同时检测人cmv和bk病毒dna的引物序列及定量检测试剂盒
CN106978498B (zh) 人类alk基因表达的检测引物、探针及检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170620