CN106755469A - 一种检测IMPDH1rs4731447基因多态性的引物及其PCR方法 - Google Patents

一种检测IMPDH1rs4731447基因多态性的引物及其PCR方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用PCR方法检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的引物对IrF/IrR，其序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。还公开了引物对IrF/IrR在检测生物样品IMPDH1 rs4731447基因多态性位点方面的应用，以及由其制备的IMPDH1 rs4731447基因多态性位点检测试剂盒。利用本发明的引物对及其PCR方法，可以根据扩增电泳结果确定IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型，对巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，在基因型分析的基础上可以预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗。

Description

一种检测IMPDH1 rs4731447基因多态性的引物及其PCR方法
技术领域
本发明属于医学生物技术领域。更具体地，涉及一种检测IMPDH1 rs4731447基因多态性的引物及其PCR方法。
背景技术
临床上，硫嘌呤类药物（巯基嘌呤类药物）应用十分广泛。但是，该类药物的不良反应发生率较高，包括骨髓抑制、肝脏损害、胃肠紊乱、胰腺炎和流行感冒样症状等。
目前的研究认为，巯基嘌呤类药物的不良反应可能与药物的代谢途径及基因多态性有关（下式是以６－巯基嘌呤为例的硫嘌呤类药物的代谢途径）。巯基嘌呤甲基转移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）和三磷酸肌苷焦磷酸酶（inosine triphosphatepyrophosphatase，ITPA）参与巯基嘌呤类药物代谢的过程，TPMT和ITPA存在明显的遗传多态性。但是仍然有部分患者的不良反应的发生，无法解释。
。
发明内容
本发明的目的是提供一种用PCR方法检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的引物对IrF/IrR。可以根据电泳结果确定IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型，结合个体的其他生物学指标对于巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，克服了临床选择巯基嘌呤类药物的盲目性，在基因型分析的基础上可以预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗。
本发明的另一目的是提供上述引物对IrF/IrR在制备通过PCR扩增生物样品检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的试剂中的应用。
本发明的再一目的是提供一种包含上述引物对IrF/IrR的IMPDH1 rs4731447基因多态性位点检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种用PCR方法检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的引物对IrF/IrR，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
上述引物对IrF/IrR在检测生物样品IMPDH1 rs4731447基因多态性位点方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
一种通过PCR扩增生物样品检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的方法，是以待测生物样品的DNA为模板，以上述引物对IrF/IrR进行PCR扩增，根据扩增结果确定IMPDH1rs4731447基因多态性位点的基因型。
其中，所述待测生物样品为患者外周血。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为25μl，包括：DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，0.25mmol/L dNTPs 2μl，10μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl ExTaq® 0.15μl，余量ddH2O。
优选地，所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 40s，48个循环；72℃ 7min；4℃保存。
另外，上述引物对IrF/IrR在制备通过PCR扩增生物样品检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的试剂盒中的应用，以及包含上述引物对IrF/IrR 的IMPDH1 rs4731447基因多态性位点检测试剂盒，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述试剂盒还含有dNTPs、ExTaq聚合酶。
优选地，所述试剂盒还含有0.25mmol/L的dNTPs、5U/μl的ExTaq聚合酶。
本发明上述引物对IrF/IrR以及用PCR方法检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的方法和试剂盒，可以用于检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型。
本发明的引物对IrF/IrR以及用PCR方法可以检测IMPDH1 rs4731447基因多态性，IMPDH1 rs4731447基因多态性与巯嘌呤类药物导致的白细胞减少有关，与药物不良反应有关，因此，可以根据扩增电泳结果确定IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型，对巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种用PCR方法检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的引物对IrF/IrR，其序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。利用本发明的引物对及其PCR方法，可以根据扩增电泳结果确定IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型，对巯基嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测，在基因型分析的基础上可以预测患者使用巯基嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗，克服临床选择巯基嘌呤类药物的盲目性，避免用药不良反应。
而且，本发明的方法简单易行，应用前景广泛。
附图说明
图1为基因分型结果的基因型电泳图谱（PCR-RFLP）；HW为野生型纯合子，HM为突变型纯合子，HT为突变杂合子。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 检测IMPDH1 rs4731447基因多态性的引物及其PCR方法
1、实验所需试剂及其配置
（1）DNA提取试剂
6mol/L NaI（上海生工生物工程技术服务有限公司，上海），氯仿，异丙醇，异戊醇，乙醇均为市售分析纯产品。
（2）PCR扩增试剂
Ex Taq®酶（Takara公司，日本），合成引物（上海生工生物工程技术服务有限公司，上海）。
（3）琼脂糖凝胶电泳试剂
普通琼脂糖（Biowest 公司，西班牙），低熔点琼脂糖（上海生物工程技术服务有限公司，上海），5×TBE电泳液储存液（0.45 mol/L Tris碱，0.45 mol/L硼酸，0.01 mol/L EDTA，调pH至8.0；Tris、硼酸、EDTA购自上海生工生物工程技术服务有限公司）稀释10倍使用，GoldviewTM Nucleic Acid stain（北京赛百盛生物工程公司，北京）。
（4）DL1000、DL2000 DNA Ladder Marker（Takara公司，日本）。
（5）0.5 M EDTA溶液
称取186.1 g EDTA·2H2O于1 L烧杯中，加800 ml去离子水，充分搅拌，加NaOH调节pH至8.0，搅拌至完全溶解，加去离子水定容至1 L，高温高压灭菌。
（6）5×TBE溶液
称取54 g Tris，27.5 g硼酸，置于烧杯，加适量双蒸水搅拌溶解；加入0.5 M EDTA溶液20 ml，加双蒸水定容至1 L，制成5×TBE储备液。储备液将稀释10倍为0.5×TBE溶液使用。
（7）6 M NaI溶液
称取45 g NaI置于烧杯中，加双蒸水搅拌溶解，定容至50 ml，避光保存。
2、实验所需主要仪器
ABI GeneAmp® PCR System 2700 ( Applied Biosystems公司，美国)
Eppendorf MasterCycler® epGradient PCR仪（Eppendorf公司，德国）
DYY－11131C 型水平电泳槽（北京六一仪器厂，北京）
DYY－6C 型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂，北京）
EC3凝胶成像系统（UVP 公司，美国）
Eppendorf 5417R低温离心机（Eppendorf公司，德国）
富华SHA-C型恒温振荡水浴器（常州菲普实验仪器厂，江苏）
DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司，上海）
超低温冰箱（-80℃）（Thermo公司，德国）
3、实验方法
（1）外周血DNA提取
1）取EDTA抗凝全血100 μl，加无菌双蒸水200 μl混匀；
2）加入6 mol/L碘化钠200 μl，混匀；
3）加入氯仿/异戊醇（24:1，v/v）400 μl，反复混匀；然后12000 rpm离心10 min，小心吸出上清液置另一离心管；
4）向上清液加入异丙醇300 μl混匀，室温静置3 min，然后于12000 rpm离心10 min，弃上清；
5）加入70%乙醇500 μl，12000 rpm离心3 min，倒掉乙醇；
6）重复步骤（5）一次，倒置片刻；
7）待管壁晾干后，加入TE缓冲液40 μl溶解DNA，用吸管吹打使DNA充分溶解。
（2）DNA浓度测定及纯化
取样品20 μl，加超纯水至600 μl，充分混匀，用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280 nm、320 nm时的OD值，计算DNA的浓度和纯度。
DNA浓度 (μg/ml)=(OD260-OD320)×50 μg/ml×稀释倍数(30)
DNA纯度=(OD260-OD320)/(OD280-OD320)
DNA纯度为1.8时表示纯度好；<1.6时表示蛋白含量太高，应用氯仿/异戊醇抽提纯化；>1.9时表示有RNA污染，可用RNA酶进行处理。
（3）PCR反应
1）引物设计
设计IMPDH1 rs4731447的PCR扩增引物，如表1所示。所有引物序列均经NCBI Blast验证其合理性与特异性。
表1 引物序列
2）PCR反应体系
PCR反应体系为25μl，包括DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，dNTPs 2μl(0.25mmol/L)，上、下游引物各1μl(10μmol/L)，ExTaq® 0.15μl (5U/μl)，用ddH2O补充总体积至25μl。
3）PCR反应条件如表2所示
表2 PCR 反应条件
4、PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳
制胶：称取适量琼脂糖，加入0.5×TBE溶液配制成1%的混悬液，在微波炉中加热至完全溶解，加入终浓度为0.05 μl/ml的Goldview，充分混匀后倒入水平放置的胶模中，凝胶厚度约为5 mm，插上梳子，静止20~30 min。
上样：将制好的凝胶放入电泳槽，电泳缓冲液（同批次0.5×TBE）液面高出凝胶表面1~2 mm，取5 μl扩增产物与1 μl 6×Loading buffer混合后，依次加入加样孔中；190 V电泳15 min。
5、结果
紫外灯下观察电泳结果，并于凝胶成像系统上自动成像，结果如附图1所示，利用本发明的引物对IrF/IrR及PCR方法，可以检测鉴定IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型。
从临床观察来看，突变纯合子对巯基嘌呤类药物的不良反应发生率明显高于突变杂合子，而突变纯合子和突变杂合子这两者的药物不良反应发生率均强于野生型。
因此，可以利用本发明的引物对IrF/IrR及PCR方法检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型，从而判断检测对象对巯基嘌呤类药物的不良反应情况，进而指导个性化用药。本发明提供了一种简单易行且具有很强临床应用价值的PCR方法及引物。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种检测IMPDH1 rs4731447基因多态性的引物及其PCR方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 引物IrF
<400> 1
tgagctcggc ctccg 15
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物IrR
<400> 2
ctctgccctg ggcgtca 17

Claims (9)

1.一种用PCR方法检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的引物对IrF/IrR，其特征在于，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2. 权利要求1所述引物对IrF/IrR在检测生物样品IMPDH1 rs4731447基因多态性位点方面的应用。
3. 一种通过PCR扩增生物样品检测IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的方法，其特征在于，以待测生物样品的DNA为模板，以权利要求1所述引物对IrF/IrR进行PCR扩增，根据扩增结果确定IMPDH1 rs4731447基因多态性位点的基因型。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为25μl，包括：DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，0.25mmol/L dNTPs 2μl，10μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl ExTaq® 0.15μl，余量ddH2O。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 40s，48个循环；72℃ 7min；4℃保存。
6. 权利要求1所述引物对IrF/IrR在制备通过PCR扩增生物样品检测IMPDH1rs4731447基因多态性位点的试剂中的应用。
7. 一种IMPDH1 rs4731447基因多态性位点检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物对IrF/IrR。
8.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含有dNTPs、ExTaq聚合酶。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含有0.25mmol/L的dNTPs、5U/μl的ExTaq聚合酶。
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