CN106860506A - 一种富硒黄芪提取物、提取方法和应用 - Google Patents

一种富硒黄芪提取物、提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种富硒黄芪提取物、提取方法和应用，属于天然植物提取技术领域。本发明提出了一种富硒黄芪的提取物，这种提取物具有较高的调节免疫活性；同时，本发明利用了新的提取方法，使提取物的活性得到提高。选用新品种富硒黄芪为研究对象，通过观察其对免疫抑制模型大鼠IgG、IgM 、IgA以及免疫分子的影响，与普通黄芪进行对比，初步探讨富硒黄芪对免疫功能的作用，为黄芪新品种的应用和开发提供科学依据。

Description

一种富硒黄芪提取物、提取方法和应用
技术领域
本发明涉及一种富硒黄芪提取物、提取方法和应用，属于天然植物提取技术领域。
背景技术
黄芪本身就具有保肝，利尿，抗衰老，降压，提高机体免疫力等功能。硒，是人体必须的微量元素，具有防癌抗癌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物学特性，享有自由基清道夫、生命火种、抗癌之王等美誉。
富硒黄芪是黄芪新品种。经检测，普通黄芪根平均硒含量118微克/千克，富硒黄芪根平均硒含量798微克/千克，达到6倍以上。实践证明，富硒黄芪病菌少，无麻点，光泽度高；富硒黄芪培育方法可操作性强，能够实现标准化生产，硒含量稳定。
虽然近年来黄芪在调节免疫方面越来越受关注，但对富硒黄芪的研究与开发还尚缺乏。
发明内容
本发明提供了一种富硒黄芪的提取物，这种提取物具有较高的调节免疫活性；同时，本发明利用了新的提取方法，使提取物的活性得到提高。
技术方案是：
一种富硒黄芪提取物，它是由富硒黄芪经过提取而得到的。
富硒黄芪提取物的提取方法，包括如下步骤：
第1步，将富硒黄芪加入至乙醇溶液中进行加热回流提取，得到提取液；
第2步，将上述提取液过滤除渣之后，滤过液减压浓缩，再将浓缩液中加入石油醚进行萃取，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯进行萃取，得到第二萃余相；
第4步，将第二萃余相送入聚酰胺柱进行上柱操作，再经水洗至无色后，继用65～75％乙醇洗脱，收集洗脱液，干澡至恒重，得到提取物。
所述的第1步中，富硒黄芪与乙醇溶液的固液比是1：5～8，乙醇溶液是由50～70vol.％的乙醇溶液中加入NaOH调节pH至8～10得到，提取温度是65～75℃。
所述的第2步中，减压浓缩至滤液体积减小为1/5～1/3，石油醚的体积是浓缩液体积的1/5～1/7。
所述的第3步中，乙酸乙酯的体积是第一萃余相的体积1/3～1/5。
所述的第4步中，聚酰胺柱的树脂的粒度是30-60目。
富硒黄芪提取物在制备用于提高哺乳动物免疫力药物中的应用。
有益效果
本发明提出了一种富硒黄芪的提取物，这种提取物具有较高的调节免疫活性；同时，本发明利用了新的提取方法，使提取物的活性得到提高。提取方法中，采用石油醚的作用是去除一部分酯类物质，采用乙酸乙酯的作用可以有效地排除一些活性较低的提取物成分，经过聚酰胺柱纯化后进一步得到了高活性提取物。
本课题选用甘肃省渭源县康荣中药材科技有限公司培育的新品种富硒黄芪为研究对象，通过观察其对免疫抑制模型大鼠IgG、IgM、IgA以及免疫分子的影响，与普通黄芪进行对比，初步探讨富硒黄芪对免疫功能的作用，为黄芪新品种的应用和开发提供科学依据。
具体实施方式
选用甘肃省渭源县康荣中药材科技有限公司培育的新品种富硒黄芪为研究对象，通过提取之后，获得了一种具有较高免疫效果的富硒黄芪提取物，并通过观察其对免疫抑制模型大鼠IgG、IgM、IgA以及免疫分子的影响，与普通黄芪进行对比，富硒黄芪对免疫功能的作用更为明显。
提取试验中，富硒黄芪、普通黄芪购自甘肃省渭源县康荣中药材专业合作社。
实施例1
第1步，将富硒黄芪加入至乙醇溶液中进行加热回流提取，富硒黄芪与乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH调节pH至9得到，提取温度是70℃，提取时间1h，得到提取液；
第2步，将上述提取液过滤除渣之后，滤过液减压浓缩，减压浓缩至滤液体积减小为1/4，再将浓缩液中加入石油醚进行萃取，石油醚的体积是浓缩液体积的1/6，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的体积是第一萃余相的体积1/4，得到第二萃余相；
第4步，将第二萃余相送入30-60目聚酰胺柱进行上柱操作，再经水洗至无色后，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，干澡至恒重，得到提取物。
另外，将本实施例中得到的乙酸乙酯萃取物减压浓缩至干后，得到乙酸乙酯提取物，同样用于药效试验。
实施例2
与实施例1的区别在于：未采用乙酸乙酯去除低活性提取物。
第1步，将富硒黄芪加入至乙醇溶液中进行加热回流提取，富硒黄芪与乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH调节pH至9得到，提取温度是70℃，提取时间1h，得到提取液；
第2步，将上述提取液过滤除渣之后，滤过液减压浓缩，减压浓缩至滤液体积减小为1/4，再将浓缩液中加入石油醚进行萃取，石油醚的体积是浓缩液体积的1/6，得到第一萃余相；
第3步，将第一萃余相送入30-60目聚酰胺柱进行上柱操作，再经水洗至无色后，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，干澡至恒重，得到提取物。
实施例3
与实施例1的区别在于：未采用D101树脂柱进行吸附纯化。
第1步，将富硒黄芪加入至乙醇溶液中进行加热回流提取，富硒黄芪与乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH调节pH至9得到，提取温度是70℃，提取时间1h，得到提取液；
第2步，将上述提取液过滤除渣之后，滤过液减压浓缩，减压浓缩至滤液体积减小为1/4，再将浓缩液中加入石油醚进行萃取，石油醚的体积是浓缩液体积的1/6，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的体积是第一萃余相的体积1/4，得到第二萃余相；
第4步，将第二萃余相送入D101树脂柱进行上柱操作，再经水洗至无色后，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，干澡至恒重，得到提取物。
对照例1
本对照例与实施例1的区别是提取普通黄芪提取物。
第1步，将普通黄芪加入至乙醇溶液中进行加热回流提取，富硒黄芪与乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH调节pH至9得到，提取温度是70℃，提取时间1h，得到提取液；
第2步，将上述提取液过滤除渣之后，滤过液减压浓缩，减压浓缩至滤液体积减小为1/4，再将浓缩液中加入石油醚进行萃取，石油醚的体积是浓缩液体积的1/6，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的体积是第一萃余相的体积1/4，得到第二萃余相；
第4步，将第二萃余相送入30-60目聚酰胺柱进行上柱操作，再经水洗至无色后，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，干澡至恒重，得到提取物。
药效试验
近几年，随着中医药科研事业的发展，中医药在免疫方面的研究越来越多。目前，用来诱导大鼠免疫抑制模型的常用药物有环磷酰胺、氢化可的松、地塞米松、长春新碱等，其中环磷酰胺是应用最广泛，也是研究最多的一种建模药物。环磷酰胺属于烷化剂，可以与DNA形成交联，抑制DNA合成，从而抑制细胞增殖，具有较强的免疫抑制作用。此外，还有研究表明环磷酰胺可抑制动物的体液免疫和细胞免疫，造成动物的免疫抑制。当免疫细胞受到抗原刺激后，它们在脾脏进行增殖分化，而胸腺则是T细胞成熟的重要场所，因此脾脏和胸腺的相对重量和免疫功能有关。
富硒黄芪提取物对免疫抑制大鼠模型免疫球蛋白的影响
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验药品
富硒黄芪、普通黄芪购自甘肃省渭源县康荣中药材专业合作社。提取物是由上述实施例中制备得到的富硒黄芪和普通黄芪提取物，冷藏备用。使用前均用蒸馏水稀释成1ml/0.1kg体质量。注射用环磷酰胺(安道生)由Baxter Oncology(德国)提供。
1.1.2实验动物
120只SPF级SD大鼠，体重(180±20)g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研试验中心提供。实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011-0001。
1.1.3实验仪器
医用低速离心机(金坛市恒丰仪器厂，型号LX-820)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司，型号FA2004N)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-5200)。
1.2实验方法
1.2.1免疫抑制大鼠模型的建立取110只SD大鼠，雌雄各半，腹腔注射环磷酰胺(CTX)，每次80mg/kg，1次/d，连用3d，构建免疫抑制模型大鼠；另取10只大鼠为空白对照，腹腔注射等体积蒸馏水。第3次注射24h后(如造模成功，记作停药0天)，分别从模型组和空白组中各取2只大鼠，采用股动脉采血方法取3ml血液，用于测定血液WBC(如造模成功，本次检测结果记做药物实验0天)，WBC显著降低则判定为造模成功，若未显著降低则继续注射CTX，直至造模成功。
1.2.2动物分组与给药 从造模成功后的模型大鼠中选取60只体况接近的免疫抑制模型大鼠，雌雄各半，按性别、体质量随机分为6组，每组10只。分别为：模型组、实施例1～3富硒黄芪提取物组、普通黄芪提取物组(200mg·kg－1)，乙酸乙酸提取物组(400mg·kg－1)，实验另设10只健康大鼠为空白组。实验组每只大鼠按100mg/kg-1·d-1剂量灌服相应药物，模型组及空白组每只大鼠灌服等体积的蒸馏水，1次/d，连续7d。
1.2.3取材 给药第7天后，各组大鼠禁食8小时，颈椎脱位法处死后股动脉取血，分离血清，-20℃保存，备检；取各组大鼠脾脏、胸腺组织，观察体积大小及重量变化。
1.2.4指标检测
(1)取全血20微升，采用全自动血球计数仪检测外周血白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞数、中性粒细胞和淋巴细胞百分比
(2)用酶联免疫法检测各组大鼠血清中免疫球蛋白IgG、IgM及IgA的含量。
1.2.5数据统计与处理
采用SPSS 19.0统计软件分析，将实验数据所得结果用“均数±标准差(x±S)”表示，组间比较行单因素方差分析(One-Way-Anova)，P<0.05为有统计学差异。
2结果
2.1富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠外周血血常规的影响
与空白组比较，模型组大鼠外周血血象各数显著降低，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，各干预组大鼠外周血血象数据有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。
表1富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠外周血血常规的影响(x±S)
注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；
与实施例2组比较，△P＜0.05；与实施例3组比较，×P＜0.05。
与空白对照组比较，▼P>0.95。
2.2富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫球蛋白IgG、IgM及IgA表达水平的影响
与空白组比较，模型组大鼠免疫球蛋白表达水平显著降低，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，个干预组大鼠免疫球蛋白表达水平有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。
表2黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫球蛋白IgG、IgM及IgA表达水平的影响(x±S)
注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。
与实施例2组比较，△P＜0.05；与实施例3组比较，×P＜0.05。
与空白对照组比较，▼P>0.95。
本实验研究中，环磷酰胺模型组大鼠注射环磷酰胺第3天即出现蜷缩弓背，毛蓬竖，少光泽，闭目、体重减轻等体征，与正常小鼠有明显区别。解剖观察动物的胸腺，脾脏明显缩小，与正常组小鼠有明显区别，同时模型组数据表明，环磷酰胺可引起大鼠白细胞计数及其淋巴细胞百分比、血清免疫球蛋白水平下降，指标差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明大鼠的免疫功能受到明显抑制，可认为造免疫抑制小鼠模型成功。实验结果表明，富硒黄芪提取物能显著提高环磷酰胺所致兔疫抑制模型大鼠的兔疫功能，且这种作用较普通黄芪更为显著。通过以上试验结果可以看出，通过石油醚对乙醇提取物进行提取之后，可以有效地去除一部分酯类物质，提高药效；通过采用聚酰胺柱进行纯化之后，明显相对于其它的树脂具有较好的纯化效果；同时乙酸乙酸的二级萃取也可以去除一部分低活性成分，乙酸乙酯提取部的活性与空白组无显著差异。
富硒黄芪提取物对免疫抑制大鼠细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α的影响
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验药品与试剂
富硒黄芪、黄芪购自甘肃省渭源县康荣中药材专业合作社。提取物是由上述实施例中制备得到的富硒黄芪和普通黄芪提取物，冷藏备用。使用前均用蒸馏水稀释成1ml/0.1kg体质量。注射用环磷酰胺(安道生)由Baxter Oncology(德国)提供。酶联免疫试剂盒：白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)，均有南京建成生物工程研究所提供。
1.1.2实验动物
110只SPF级SD大鼠，体重(180±20)g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研试验中心提供。实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011-0001。
1.1.3实验仪器
医用低速离心机(金坛市恒丰仪器厂，型号LX-820)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司，型号FA2004N)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-5200)。
1.2实验方法
1.2.1免疫抑制大鼠模型的建立 取110只SD大鼠，雌雄各半，腹腔注射环磷酰胺(CTX)，每次80mg/kg，1次/d，连用3d，构建免疫抑制模型大鼠；另取10只大鼠为空白对照，腹腔注射等体积蒸馏水。第3次注射24h后(如造模成功，记作停药0天)，分别从模型组和空白组中各取2只大鼠，采用股动脉采血方法取3ml血液，用于测定血液WBC(如造模成功，本次检测结果记做药物实验0天)，WBC显著降低则判定为造模成功，若未显著降低则继续注射CTX，直至造模成功。
1.2.2动物分组与给药 从造模成功后的模型大鼠中选取60只体况接近的免疫抑制模型大鼠，雌雄各半，按性别、体质量随机分为6组，每组10只。分别为：模型组、实施例1～3富硒黄芪提取物组、普通黄芪提取物组(200mg·kg－1)，乙酸乙酸提取物组(400mg·kg－1)，实验另设10只健康大鼠为空白组。实验组每只大鼠按100mg/kg-1·d-1剂量灌服相应药物，模型组及空白组每只大鼠灌服等体积的蒸馏水，1次/d，连续7d。
1.2.3取材 给药第7天后，各组大鼠禁食8小时，颈椎脱位法处死后股动脉取血，分离血清，-20℃保存，备检。
1.2.4指标检测
(1)处死后取出胸腺、脾脏，记录重量变化，按“胸腺(mg)/体质量(g)、脾脏(mg)/体质量(g)”计算胸腺指数和脾脏指数。
(2)用酶联免疫法(ELISA)检测大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ等免疫细胞因子含量。
1.2.5数据统计与处理
采用SPSS 19.0统计软件分析，将实验数据所得结果用“均数±标准差(x±S)”表示，组间比较行单因素方差分析(One-Way-Anova)，P<0.05为有统计学差异。
2结果
2.1富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺、脾脏指数的影响
与空白组比较，模型组大鼠胸腺指数及脾脏指数显著降低，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，各干预组大鼠胸腺指数及脾脏指数有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。
表3黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指数、脾脏指数的影响(x±S)
注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。
与实施例2组比较，△P＜0.05；与实施例3组比较，×P＜0.05。
与空白对照组比较，▼P>0.95。
2.2富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ表达水平的影响
与空白组比较，模型组大鼠免疫细胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)含量显著降低，免疫细胞因子TNF-α含量显著升高，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，各干预组大鼠免疫细胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)含量有所升高，免疫细胞因子TNF-α含量有所降低，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。
表4富硒黄芪提取物对环磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影响(x±S)
注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。
与实施例2组比较，△P＜0.05；与实施例3组比较，×P＜0.05。
与空白对照组比较，▼P>0.95。

Claims (7)

1.一种富硒黄芪提取物，它是由富硒黄芪经过提取而得到的。
2.权利要求1所述的富硒黄芪提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步，将富硒黄芪加入至乙醇溶液中进行加热回流提取，得到提取液；
第2步，将上述提取液过滤除渣之后，滤过液减压浓缩，再将浓缩液中加入石油醚进行萃取，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯进行萃取，得到第二萃余相；
第4步，将第二萃余相送入聚酰胺柱进行上柱操作，再经水洗至无色后，继用65～75%乙醇洗脱，收集洗脱液，干澡至恒重，得到提取物。
3.根据权利要求2所述的富硒黄芪提取物的提取方法，其特征在于，所述的第1步中，富硒黄芪与乙醇溶液的固液比是1：5～8，乙醇溶液是由50～70vol.%的乙醇溶液中加入NaOH调节pH至8～10得到，提取温度是65～75℃。
4.根据权利要求2所述的富硒黄芪提取物的提取方法，其特征在于，所述的第2步中，减压浓缩至滤液体积减小为1/5～1/3，石油醚的体积是浓缩液体积的1/5～1/7。
5.根据权利要求2所述的富硒黄芪提取物的提取方法，其特征在于，所述的第3步中，乙酸乙酯的体积是第一萃余相的体积1/3～1/5。
6.根据权利要求2所述的富硒黄芪提取物的提取方法，其特征在于，所述的第4步中，聚酰胺柱的树脂的粒度是30-60目。
7.富硒黄芪提取物在制备用于提高哺乳动物免疫力药物中的应用。
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