CN106852144A

CN106852144A - 新的5,6‑二氢‑4H‑苯并[b]噻吩并‑[2,3‑d]氮杂*衍生物

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Publication number: CN106852144A
Application number: CN201580054496.3A
Authority: CN
Inventors: S·F·亨特; S·T·奥尼恩斯; V·舍伯金; E·A·F·福代斯; P·J·穆雷; D·W·布鲁克斯; 伊藤和浩; P·斯特朗
Original assignee: Poole & Co Ltd
Current assignee: Poole & Co Ltd; Pulmocide Ltd
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2015-10-08
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2035-10-08
Also published as: EP3204389A1; EP3204388B1; MX2017004652A; US10035810B2; KR20170058921A; US20170190718A1; SG11201701184WA; US20180319820A1; CN106852144B; EP3204389B1; US20170355717A1; JP6675407B2; AU2015329789B2; EP3204388A1; US20190202841A1; CA2957868A1; US10273249B2; IL250823A0; US10189863B2; US9732098B2

Abstract

提供了5,6‑二氢‑4H‑苯并[b]噻吩并‑[2,3‑d]氮杂衍生物，其可用于治疗呼吸道合胞病毒(RSV)感染和预防与RSV感染相关的疾病。(式(I))

Description

新的5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并-[2,3-d]氮杂*衍生物

发明领域

本发明涉及新的化合物、包含其的组合物、制备所述化合物的方法以及其治疗用途。本发明化合物旨在治疗或预防呼吸道合胞病毒感染和相关疾病，特别是由其A型和B型毒株引起的感染。

发明背景

人呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒家族的肺病毒，是在一岁以下婴儿中细支气管炎和肺炎的最常见原因。大多数儿童在第二个生日之前感染RSV，导致75-125,000人住院。仅在美国，每年相关的医疗费用被认为超过6.5亿美元。此外，早期呼吸道病毒感染，特别是RSV，增加了儿童哮喘随后发展的风险(Holt和Sly，2002)。RSV感染可在任何年龄的患者中产生严重的下呼吸道疾病。老年人以及那些具有受损的心脏、肺部或免疫系统的人特别易感，据估计，在美国每年大约有14,000例死亡发生于65岁以上的个体。此外，RSV感染越来越被认为是患有慢性阻塞性肺病(COPD)(Mohanet等人，2010)以及哮喘(Newcomb和Peebles，2009)和囊性纤维化(Abman等人，1988)的患者中加重的重要的促进因素。在免疫受损的成人中，约50％的RSV上呼吸道感染发展为肺炎。

RSV进入的初始入口是通过鼻子或眼睛而不是嘴(Hall等人，1981)。一旦在上呼吸道中建立，病毒能够容易地迁移到肺中。在从死亡儿童获得的肺组织研究中研究了RSV感染的病理生理学(Johnsonet等人，2007)。对来自四个个体的组织的检查显示上皮细胞的免疫染色，表明存在RSV，而基底细胞没有受到影响。该病原生物的上皮定位对治疗提出了挑战，因为药物物质的超有效浓度必须保持在离散的细胞位点，以使感染得到治疗并随后清除。

RSV病毒以两个抗原亚组存在：A型和B型。RSV A毒株的病毒以前被认为是造成大多数临床疾病的亚组病原体，并且据报道产生更多病理症状(Walsh等人,1997；Panayiotou等人,2014)。常见的RSV A毒株是RSV A2(Olivier等人，2009)。然而，在中国最近的爆发期间，发现RSV B亚组的病毒株在受影响的人群中占主导(Zhang等人，2010)。

在过去二十年中，在治疗包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎和丙型肝炎在内的许多病毒疾病方面取得了相当大的进展。在所有这些情况下，金标准疗法已经进化，其由至少在一定程度上响应于耐药性疾病的出现而带来的组合治疗组成。

FDA批准的用于治疗急性RSV感染的药物包括(气雾化的)利巴韦林和人源化的单克隆抗体帕利珠单抗(Synagis)。后一种药物靶向于RSV融合(F)蛋白，并且在高风险儿科患者中限于预防性使用。此外，最近鉴定了抗帕利珠单抗中和的临床变体(Zhu等人，2011)，因此目前没有真正有效的疫苗。利巴韦林的使用受其对病毒的低效力和对其副作用谱的担心的限制。因此，迫切需要发现针对RSV感染的具有改善的临床特征的新颖、安全和有效的治疗。此外，鉴于RSV B毒株在临床疾病中新出现的显著性，非常期望这些治疗对于RSV A和RSV B毒株引起的感染是有效的。

发明概述

在第一方面，本发明提供了式(I)化合物或其可药用盐(“本发明化合物”)，

其是：

N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-(5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺。

本文公开的生物学数据显示，本发明化合物抑制与RSV A毒株感染相关的细胞病变效应，并且还抑制与RSV B毒株感染相关的细胞病变效应。

附图简述

图1显示在用试验化合物进行早期干预后，化合物(I)对RSV A2感染的空气-液体界面(ALI)培养的上皮细胞中病毒滴度的影响

图2显示在用试验化合物进行晚期干预后，化合物(I)对RSV A2感染的空气-液体界面(ALI)培养的上皮细胞中病毒滴度的影响

图3显示化合物(I)对RSV A2感染的小鼠的肺中的病毒滴度的影响

图4显示化合物(I)对RSV A2感染的棉鼠的肺中的病毒滴度的影响

发明详述

式(I)化合物的可药用盐特别包括所述化合物的可药用酸加成盐。式(I)化合物的可药用酸加成盐意在包含式(I)化合物能够形成的治疗活性的无毒的酸加成盐。这些可药用的酸加成盐可以通过在合适的溶剂或溶剂混合物中用这类合适的酸处理游离碱形式而方便地获得。合适的酸包括，例如无机酸，例如氢卤酸如盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、双羟萘酸等。

相反，所述盐形式可以通过用合适的碱处理转化为游离碱形式。

本文所提及的盐，例如关于中间体化合物，包括可药用盐，例如上述那些，以及可能不适合于药物用途的其它盐。酸性化合物的盐包括与第1族和第2族金属的阳离子，包括钠、钾、钙和镁离子以及无机阳离子如铵离子形成的盐。

式(I)化合物的定义旨在包括所述化合物的所有立体异构体。本文使用的立体异构体是指具有相同分子式和键合的原子顺序(构成)、但是不同之处仅在于其原子在空间的三维取向的异构分子。这与结构异构体不同，所述结构异构体是指具有相同分子式、但是它们的键连接和/或它们的顺序在不同原子/基团之间不同。在立体异构体中，组成原子的顺序和键连接保持相同，但它们在空间中的取向不同。

式(I)化合物的定义旨在包含所述化合物的全部互变异构体。

除非上下文另有明确说明，式(I)化合物的定义旨在包括所述化合物的全部溶剂化物(包括所述化合物的盐的溶剂化物)。溶剂化物的实例包括水合物。

本公开物的化合物包括同位素变体，其中一个或多个指定的原子是天然存在的或非天然存在的同位素。在一项实施方案中，同位素是稳定的同位素。因此，本公开物的化合物包括例如氘标记的版本等。

本公开物还延伸至本文定义的化合物的全部多晶型物。

本文所述的新中间体[例如式(II)、(III)、(IV)、(VI)和(X)化合物]及其盐(例如可药用盐)形成本发明的另一方面。

本发明化合物可用作药物。

在一项实施方案中提供了药物组合物，其包含本发明化合物与任选的一种或多种可药用稀释剂或载体。

合适地，本发明的化合物局部施用于肺或鼻，特别是局部施用于肺。因此，在一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含本发明化合物与任选的一种或多种局部可接受的稀释剂或载体。

适于肺部或鼻内给药的组合物包括粉末、液体溶液、液体混悬液、包含溶液或混悬液的滴鼻剂或者加压或非加压的气雾剂。

该组合物可以方便地以单位剂型施用，并且可以通过制药领域熟知的任何方法制备，例如如Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA.,(1985)中所述。该组合物还可以方便地以多单位的剂型施用。

对鼻或肺的局部给药可以通过使用非加压的制剂例如水溶液或悬浮液来实现。所述制剂可以通过雾化器，例如可以是手持式和便携式或用于家庭或医院使用(即，非便携式)的雾化器施用。示例性装置是RESPIMAT吸入器。该制剂可以包含赋形剂，例如水、缓冲剂、张力调节剂、pH调节剂、粘度调节剂、表面活性剂和共溶剂(例如乙醇)。混悬剂液体和气雾剂制剂(无论是加压还是未加压的)通常含有精细粉碎形式的本发明化合物，例如具有D₅₀为0.5-10μm，例如约1-5μm。粒度分布可以使用D₁₀、D₅₀和D₉₀值表示。粒度分布的D₅₀中值被定义为占分布一半的以微米计的粒度。来自激光衍射的测量更准确地描述为体积分布，因此使用该方法获得的D₅₀值更有意义地称为Dv₅₀值(体积分布的中值)。本文所用的Dv值是指使用激光衍射测量的粒度分布。类似地，在激光衍射的背景下使用的D₁₀和D₉₀值被认为是指Dv₁₀和Dv₉₀值，并且分别是指其中10％的分布低于D₁₀值和90％的分布低于D₉₀值。

根据本发明的一个具体方面，提供了包含悬浮在水性介质中的颗粒形式的本发明化合物的药物组合物。该水性介质通常包含水和一种或多种选自缓冲剂、张力调节剂、pH调节剂、粘度调节剂和表面活性剂的赋形剂。

对鼻或肺的局部给药也可以通过使用气雾剂制剂来实现。气雾剂制剂通常包含悬浮或溶解在合适的气雾剂推进剂例如氯氟烃(CFC)或氢氟烃(HFC)中的活性成分。合适的CFC推进剂包括三氯一氟甲烷(推进剂11)、二氯四氟甲烷(推进剂114)和二氯二氟甲烷(推进剂12)。合适的HFC推进剂包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。推进剂通常占吸入组合物总重量40％-99.5％(例如40％-90％)的重量。该制剂可以包含赋形剂，其包括共溶剂(如乙醇)和表面活性剂(如卵磷脂、脱水山梨糖醇三油酸酯等)。其它可能的赋形剂包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。将该气雾剂制剂包装在罐中，并且通过计量阀(例如由Bespak、Valois或3M或者由Aptar、Coster或Vari提供)递送合适的剂量。

对肺的局部给药也可以通过使用干粉制剂来实现。干粉制剂含有精细粉碎形式的本发明化合物，通常具有1-10μm的MMD或0.5-10μm的D₅₀，例如约1-5μm。可以通过微粉化方法或类似的尺寸减小方法制备精细粉碎形式的本发明化合物的粉末。可以使用喷射磨机(例如由Hosokawa Alpine制造的那些)进行微粉化。可以使用激光衍射(例如用MalvernMastersizer 2000S仪器)测量所得的粒度分布。该制剂通常含有局部可接受的稀释剂，例如乳糖、葡萄糖或甘露醇(优选乳糖)，通常具有相对大的粒度，例如50μm或以上的MMD，例如100μm或以上，或D₅₀为40-150μm。本文所用的术语“乳糖”是指含乳糖的组分，包括α-乳糖一水合物、β-乳糖一水合物、无水α-乳糖、无水β-乳糖和无定形乳糖。乳糖组分可以通过微粉化、过筛、研磨、压制、团聚或喷雾干燥进行加工。还包括各种形式的乳糖的市售形式，如(吸入级乳糖；DFE Pharma)、70(用于干粉吸入器的筛分乳糖；Meggle)、(DFE Pharma)和(筛分的吸入级乳糖；DFE Pharma)产品。在一项实施方案中，乳糖组分选自α-乳糖一水合物、无水α-乳糖和无定形乳糖。优选地，乳糖是α-乳糖一水合物。

干粉制剂还可含有其它赋形剂，例如硬脂酸钠、硬脂酸钙或硬脂酸镁。

干粉制剂通常使用干粉吸入器(DPI)装置递送。示例性的干粉递送系统包括SPINHALER、DISKHALER、TURBOHALER、DISKUS、SKYEHALER、ACCUHALER和CLICKHALER。干粉递送系统的其它实例包括ECLIPSE、NEXT、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、MONODOSE、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、PRESSAIR、ELLIPTA、ORIEL干粉吸入器、MICRODOSE、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR和PROHALER。

本发明的化合物可用于治疗RSV感染和预防或治疗与RSV感染相关的疾病。

在本发明的一个方面，提供了本发明化合物在制备用于治疗RSV感染和用于预防或治疗与RSV感染相关的疾病的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了治疗感染RSV的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明化合物。

在本发明的另一方面，提供了预防或治疗个体中与RSV感染相关的疾病的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明的化合物。

本发明的化合物可以在感染之前通过施用其而用于预防性环境中。

在一项实施方案中，RSV感染是RSV A毒株感染(例如被RSV A2毒株感染)。在另一项实施方案中，RSV感染是RSV B毒株感染(例如被RSV B Washington毒株感染)。

个体包括人和动物个体，特别是人类个体。

本发明的化合物尤其可用于治疗RSV感染和用于预防或治疗有风险个体中与RSV感染相关的疾病。有风险个体包括早产儿、具有肺或心脏先天性缺陷的儿童、免疫受损的个体(例如患有HIV感染的个体)、老年个体和患有影响心脏或肺的慢性健康病症(例如充血性心力衰竭或慢性阻塞性肺病)的个体。

本发明化合物可以与第二种或其它活性成分组合施用。本发明化合物可以与第二种或其它的活性成分共配制，或者第二种或其它的活性成分可以配制成通过相同或不同的途径单独施用。根据本发明的一个方面，提供了药盒，包含：(a)药物组合物，其包含本发明化合物与任选的一种或多种稀释剂或载体；(b)药物组合物，其包含第二活性成分与任选的一种或多种稀释剂或载体；(c)任选的一种或多种其它药物组合物，其各自包含第三或其它活性成分与任选的一种或多种稀释剂或载体；和(d)用于将这些药物组合物施用于有需要的个体的说明书。所述的有需要的个体可能患有RSV感染或易感染RSV。

第二或其它活性成分包括适合于治疗或预防RSV感染或与RSV感染相关的疾病或与RSV感染共发病(co-morbid)的病症的活性成分。

第二或其它活性成分可以例如选自抗病毒药(例如其它抗RSV药)，包括F蛋白抑制剂(包括抗F蛋白抗体，如帕利珠单抗)、RNA聚合酶抑制剂和利巴韦林，以及抗炎药。

本发明的化合物可以以合适的间隔施用，例如每天一次、每天两次、每天三次或每天四次。

对于平均体重(50-70kg)的人的合适剂量预期为约50μg至10mg/天，例如500μg至5mg/天，但所施用的精确剂量可由技术人员确定。

预期本发明化合物具有一种或多种以下有利的特性：

对由RSV A毒株、例如A2毒株引起的人(或动物模型、或体外系统)中细胞病变效应和/或病毒复制和/或F-蛋白表达的有效抑制；

对由RSV B毒株引起的人(或动物模型、或体外系统)中的细胞病变效应和/或病毒复制和/或F蛋白表达的有效抑制；

在肺中的作用持续时间长，优选与每日一次给药一致；和

可接受的安全性特征，特别是在肺或鼻的局部施用后。

实验部分

本文使用的缩写定义如下(表1)。未定义的任何缩写旨在表达其通常接受的含义。

表1：缩写

ALI 空气液体界面

aq 含水的

BALF 支气管肺泡灌洗液

BEAS2B SV40永生化人支气管上皮细胞系

br 宽

BSA 牛血清白蛋白

CC₅₀ 50％细胞毒性浓度

conc 浓

CPE 细胞病变效应

d 双峰

DAB 3,3'-二氨基联苯胺

DCM 二氯甲烷

DMEM 达尔伯克改良伊格尔培养基

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲基亚砜

DSS 葡聚糖硫酸钠

(ES⁺) 电喷雾电离，阳离子模式

Et 乙基

EtOAc 乙酸乙酯

FBS 胎牛血清

Hep2 人类喉上皮瘤细胞系2

HPLC 反相高效液相色谱

hr 小时

HRP 辣根过氧化物酶

IC₅₀ 50％抑制浓度

IC₇₅ 75％抑制浓度

IC₉₀ 90％抑制浓度

IgG 免疫球蛋白G

m 多重峰

(M+H)⁺ 质子化分子离子

Me 甲基

MHz 兆赫

MMD 质量中值直径

MOI 感染复数

min 分钟

m/z 质荷比

NMP N-甲基吡咯烷

NMR 核磁共振(光谱)

nt 未检测

OD 光密度

PBS 磷酸盐缓冲液

PCR 聚合酶链反应

Pen Srep 青霉素-链霉素

PFU 蚀斑形成单元

prep HPLC 制备型高效液相色谱

q 四重峰

RT 室温

RPMI 洛斯维·帕克纪念研究所培养基

RSV 呼吸道合胞病毒

s 单峰

sat 饱和

SDS 十二烷基硫酸钠

t 三重峰

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱

TMB 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺

vol 体积

WB 洗涤缓冲液

通用方法

全部起始材料和溶剂从商业来源获得或根据文献引用制备。除非另有说明，搅拌全部反应。有机溶液常规地用无水硫酸镁干燥。在所陈述的条件下在Thales H-cube流动反应器上进行氢化。

使用所指示的量在预填充硅胶(230-400目，40-63μm)柱上进行柱色谱法。SCX购自Supelco并在使用前用1M盐酸处理。除非另有说明，首先用MeOH稀释待纯化的反应混合物，并用几滴AcOH使其呈酸性。将该溶液直接加载到SCX上并用MeOH洗涤。然后通过用0.7M NH₃的MeOH溶液洗涤来洗脱所需物质。

制备型反相高效液相色谱：

Waters X-Select CSH柱C18,5μm(19x 50mm)，流速28mL min^-1，用包含0.1％v/v甲酸的H₂O-MeCN梯度历经6.5分钟洗脱，用在254nm的UV检测。梯度信息：0.0-0.2min,35％MeCN；0.2-5.5min,从35％MeCN上升至65％MeCN；5.5-5.6min,从65％MeCN上升至95％MeCN；5.6-6.5min,保持在95％MeCN。

分析和光谱方法

LCMS分析的反相HPLC条件：Waters Xselect CSH C18XP柱,2.5μm(4.6x 30mm)，在40℃；流速2.5-4.5mL min^-1，用包含0.1％v/v甲酸的H₂O-MeCN历经4分钟梯度洗脱，用UV在254nm检测。梯度信息：0-3.00min,从95％H₂O-5％MeCN升至5％H₂O-95％MeCN；3.00-3.01min,保持在5％H₂O-95％MeCN,流速升至4.5mL min^-1；3.01 3.50min,保持在5％H₂O-95％MeCN；3.50-3.60min,恢复至95％H₂O-5％MeCN,流速降至3.50mL min^-1；3.60-3.90min,保持在95％H₂O-5％MeCN；3.90-4.00min,保持在95％H₂O-5％MeCN,流速降至2.5mL min^-1。

¹H NMR光谱法：使用残余的未氘化溶剂作为参照，在Bruker Avance III光谱仪上在400MHz下获得光谱，除非另有说明，在DMSO-d₆中进行。

化合物(I)的合成方法

已经用于制备本发明化合物的非限制性合成策略如下(方案1)。化合物(I)的所有公开路径都源自氮杂衍生物中间体(VIIIa)，其可以从市售的起始原料经三个步骤容易地获得。主要差异产生于将合成转化应用于所述关键中间体(VIIIa)从而产生化合物(I)的三种不同前体即中间体(II)、(III)和(IV)的顺序。途径1包括噻吩羧酸(II)与2-氟-6-甲基苯胺的酰胺偶联。备选的制备方法，途径2利用通过与螺环胺：7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷的S_NAr置换反应从2-氯烟酰胺中间体(III)形成化合物(I)。该方法已被放大以提供超过0.5kg的单批次的化合物(I)，并且这种合成方式也在下文中描述。化合物(I)的第三种方法是途径3，其由苯胺(IV)和预形成的2-氨基烟酸(VI)之间的酰胺偶联反应组成。

流程1：用于制备化合物(I)的合成途径

方案1中的通式基团LG和LG¹表示离去基团，使得所得化合物转化为反应性亲电子试剂。合适的离去基团的实例包括卤素原子，例如Cl和Br，其中Cl通常是优选的，因为其易于获得和使用形成其的试剂。本领域技术人员应当理解，在本文中使用的常见离去基团的其它实例包括甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯[对三氟甲基磺酸酯])。制备酰胺的方法的综述包括：Amide bond formation and peptide coupling’Montalbetti,C.A.G.N.和Falque,V.Tetrahedron,2005,61,10827-10852中。本发明情况下，烷基R^a是乙基，更通常是低级烷基，例如C_1-6烷基或C_1-4烷基。

2-氯-5-甲基烟酸乙酯

向2-氯-5-甲基烟酸(3.90g,22.7mmol)在DCM(100mL)的溶液中加入草酰氯(9.95mL,114mmol)，然后加入1滴DMF。将所得混合物于室温下搅拌30分钟，并真空蒸发。将由此所得残余物溶于EtOH(66mL)中，再搅拌2小时，并随后真空蒸发。将所得粗产物经快速柱色谱纯化(SiO₂,120g,0-50％DCM在异己烷中的溶液，梯度洗脱)，得到标题化合物，为无色油状物(3.71g,82％产率)；¹H NMRδ:1.32(3H,t),2.34(3H,s),4.34(2H,q),8.06-8.07(1H,m),8.41-8.43(1H,m)。[还参见：Yamamoto S.等人,Bioorg.Med.Chem.2012,20,422-434.]

5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酸乙酯

将2-氯-5-甲基烟酸乙酯(3.70g,18.5mmol)、7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷半草酸盐(9.57g,55.6mmol)和DIPEA(19.4mL,111mmol)在NMP(50mL)中的混合物在150℃加热2小时。冷却至室温后，将该粗的混合物倒入水(200mL)中，并用EtOAc萃取(3x 200mL)。将合并的有机萃取物用盐水洗涤(2x 100mL)，随后干燥，并真空蒸发，得到标题化合物(4.81g,g,88％产率)；R^t 1.32min；m/z 291(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:1.29(3H,t),1.67(4H,br t),2.18(3H,s),3.52(4H,br t),3.67(4H,s),4.25(2H,q),7.74(1H,表观的dd),8.12(1H,表观的dd)。

5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酸：中间体(VI)。

将5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酸乙酯(4.1g,14mmol)和氢氧化锂(0.50g,21mmol)在THF:水(4:1,50mL)中的混合物在50℃加热18小时，然后真空蒸发。由此所得的残余物通过加入1M盐酸酸化至pH 4，并将所得混合物用EtOAc萃取(10x250mL)。将合并的有机萃取物真空蒸发，得到标题化合物，为结晶状固体(3.4g,92％产率)；R^t0.42min；m/z 263(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:1.67(4H,br t),2.17(3H,s),3.52(4H,br t),3.69(4H,s),7.74(1H,表观的dd),8.09(1H,表观的dd),12.69(1H,br)。

1-(4-硝基苯甲酰基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[b]氮杂-5-酮。

室温下向1,2,3,4-四氢-苯并[b]氮杂-5-酮(25.0g,155mmol)在吡啶(124mL)的溶液中逐滴加入4-硝基苯甲酰氯(57.6g,310mmol)在MeCN(124mL)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌16小时，并随后用水(50mL)小心猝灭，并用EtOAc(100mL)萃取。将有机萃取物依次用饱和NaHCO₃水溶液(100mL)、饱和NH₄Cl水溶液(2x 100mL)、水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，并最后用1M盐酸(2x 100mL)洗涤，干燥，并在真空中蒸发挥发物。将由此所得的粗固体用MeOH(300mL)浆化，经过滤收集，并干燥，得到标题化合物，为浅黄色固体(44.8g,HPLC检测为93％纯度,93％产率)；R^t1.92min；m/z 311(M+H)⁺(ES⁺)。该物质无需进一步纯化即可用于后续步骤。

5-氯-1-(4-硝基苯甲酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[b]氮杂-4-甲醛.

0℃下向纯净的DMF(236mL)中逐滴加入磷酰氯(15.8mL,170mmol)，并将所得混合物用1-(4-硝基苯甲酰基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[b]氮杂-5-酮(44.8g.141mmol)在DMF(141mL)中的溶液处理[后者通过在90℃下加热悬浮液直至固体完全溶解而获得，并且在仍然热的时候加入溶液]，同时保持内部温度在0-5℃之间。将反应混合物在0℃搅拌15分钟，然后升至室温30分钟，并随后在80℃加热72小时。将所得混合物冷却至室温，并在EtOAc(500mL)和饱和NaOAc水溶液(500mL)之间分配。分离水层，并用EtOAc洗涤(2x 500mL)。将合并的有机萃取物用盐水洗涤(8x 300mL)，随后干燥，并真空蒸发，得到褐色固体。将由此所得的粗产物用MeOH(300mL)浆化，经过滤收集，并干燥，得到标题化合物，为黄色固体(25.8g,HPLC测定纯度88％，51％产率)；R^t2.28min；m/z 357(M+H)⁺(ES⁺)。该物质无需进一步纯化即可用于后续步骤。

6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯：中间体(VIIIa)

室温下向5-氯-1-(4-硝基苯甲酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[b]氮杂-4-甲醛(36.6g,89.0mmol)在吡啶(260mL)的溶液中加入2-巯基乙酸乙酯(18.6mL,170mmol)，然后加入三乙胺(81.0mL)。将反应混合物在70℃加热1小时，并在118℃加热2小时，随后冷却至室温。将形成的白色沉淀经过滤除去，并将滤液真空浓缩。将所得残余物溶于DCM(100mL)，并用水(100mL)洗涤，然后用1M盐酸(70mL)洗涤。将有机萃取物干燥，并真空蒸发。将由此所得的粗固体用MeOH(150mL)浆化，经过滤收集并干燥，得到标题化合物，为黄色固体(34.2g,84％产率)；R^t 2.65min；m/z 423(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:1.32(3H,t),3.09-3.17(1H,m),3.28-3.41(假定2H，被溶剂遮蔽),4.33(2H,q),4.83-4.92(1H,m),6.96(1H,br d),7.10(1H,td),7.24(2H,br d),7.28(1H,td),7.78-7.81(2H,重叠的s和dd),8.06(2H,br d)。

6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸:

中间体(VII)

向6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(1.50g,3.55mmol)在THF:MeOH混合物(1:1,36mL)的溶液中加入2M NaOH水溶液(9.0mL)，将该混合物在50℃加热2小时。冷却至室温后，将该混合物在EtOAc(200mL)和水(200mL)之间分配。分离水层，并通过加入1M盐酸酸化至pH3，然后用EtOAc萃取(2x 150mL)。真空除去挥发物，得到标题化合物，为黄色固体(1.44g,99％产率)；R^t 2.24min；m/z 395(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:3.06-3.17(1H,m),3.27-3.40(假定2H，被溶剂遮蔽),4.83-4.92(1H,m),6.95(1H,br d),7.08(1H,br t),7.23-7.30(3H,重叠的br d和br t),7.69(1H,s),7.78(1H,dd),8.06(2H,br d),13.33(1H,br s)。

6-(4-氨基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯：中间体(IXa)

催化还原方法

将6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(1.00g,2.37mmol)在THF:EtOH(1:1,100mL)和1M盐酸(2.00mL)的混合物中的溶液通过Thales H-cube(1.0mL.min^-1,25℃,55mm10％Pd/C Cat-Cart,全氢模式)。真空除去挥发物，得到标题化合物(0.98g,～100％产率)；R^t 2.28min；m/z 393(M+H)⁺(ES⁺)。该物质无需进一步纯化即可用于后续步骤。

溶解金属还原法

向铁粉(5.29g,94.7mmol)和6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(8.00g,18.9mmol)在IPA(80mL)的混悬液中加入饱和氯化铵水溶液(8.0mL)。将所得混合物在80℃搅拌1小时，并随后经硅藻土过滤。将硅藻土垫用MeOH(1.5L)洗涤，将合并的滤液真空蒸发。将所得残余物用水(400mL)和乙醚(400mL)洗涤，并真空干燥，得到标题化合物，为黄色固体(5.89g,HPLC纯度88％,70％产率)；R^t 2.21min；m/z393(M+H)⁺(ES⁺)。该物质无需进一步纯化即用于后续步骤。

6-(4-(2-氯-5-甲基烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯:中间体(Xa)

向2-氯-5-甲基烟酸(2.49g,14.5mmol)在DCM(50mL)的混悬液中加入草酰氯(4.24mL,48.4mmol)和一滴DMF。将所得混合物在室温下搅拌1小时，然后真空蒸发。将该残余物溶于DCM(25mL)中，并室温下加入6-(4-氨基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(3.80g,9.68mmol)在吡啶(20mL)的溶液中。将反应混合物在室温下保持1小时，并随后通过加入水(100mL)猝灭，并用EtOAc(100mL)萃取。分离水层，并用EtOAc洗涤(2x 100mL)。将合并的有机萃取物用水(100mL)洗涤，真空蒸发，并将所得固体用水(200mL)研磨。以相同的规模重复该次序，得到标题化合物，为浅黄色固体(10.0g,HPLC纯度89％,95％产率)；R^t2.51min；m/z 545/547(M+H)⁺(ES⁺)。该物质无需进一步纯化即用于后续步骤。

N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺。

向6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸(10.0g,25.4mmol)在DCM(250mL)的混悬液中加入草酰氯(11.1mL,127mmol)，然后加入1滴DMF。将所得混合物在室温下搅拌1小时，然后真空蒸发。将由此所得的残余物溶于DCM(100mL)，并向该溶液中加入2-氟-6-甲基苯胺(6.35g,50.7mmol)在吡啶(100mL)中的溶液。将该混合物在室温下搅拌1小时，随后真空蒸发。该残余物溶于EtOAc(500mL)中，并将该溶液用1M盐酸洗涤(2x 100mL)，然后用饱和NaHCO₃水溶液(100mL)洗涤，随后干燥并真空蒸发。用另外的6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸(12.0g,30.4mmol)重复该方法三次，得到标题化合物，为浅黄色固体(51.1g,HPLC纯度93％,87％产率)；R^t 2.46min；m/z 502(M+H)⁺(ES⁺)。该物质无需进一步纯化即用于后续步骤。

6-(4-(5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯:

方法1:用2-氨基烟酸(VI)使苯胺(IXa)酰化

向5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酸(2.21g,8.41mmol)在DCM(50mL)的混悬液中加入草酰氯(0.80mL,9.17mmol)，然后加入1滴DMF。将所得混合物在室温下搅拌1小时，然后加入第二批的草酰氯(0.80mL,9.17mmol)和DMF(1滴)。再过30分钟后，将该混合物真空蒸发，并将由此所得的残余物溶于DCM(50mL)中，并加入6-(4-氨基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(3.00g,7.64mmol)在吡啶(20mL)的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌1小时，然后用水(100mL)稀释，并通过相分离器。将有机相真空蒸发，并将所得的残余物经快速柱色谱(SiO₂,80g,0-100％EtOAc在异己烷中的溶液，梯度洗脱)纯化。分离该浅橙色残余物，并用乙腈研磨(2x 20mL)，经过滤收集形成的固体并干燥，得到标题化合物，为白色固体(2.78g,HPLC纯度94％,57％产率)；R^t1.95min；m/z 637(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:1.32(3H,t),1.62(4H,br t),2.16(3H,s),3.06-3.38(假定3H，被溶剂遮蔽),3.45(4H,br t),3.60(4H,s),4.32(2H,q),4.85-4.95(1H,br),6.88(1H,br d),6.99(2H,br d),7.14(1H,br t),7.29(1H,td),7.45-7.53(3H,重叠的m),7.79(1H,s),7.82(1H,dd),8.04(1H,表观的dd),10.37(1H,s)。

方法2:用7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷置换2-卤代烟酰胺(Xa)。

将6-(4-(2-氯-5-甲基烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(4.97g,9.10mmol)和7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷半草酸盐(5.93g,27.3mmol)在NMP(23mL)和Et₃N(7.61mL,54.6mmol)中的混悬液在150℃加热7.5小时，然后冷却至室温，并放置60小时。加入水(400mL)，经过滤收集所得沉淀。将由此所得固体经快速柱色谱(SiO₂,120g,0-30％THF在DCM中的溶液，梯度洗脱)纯化，得到标题化合物，为浅黄色固体(3.72g,64％产率)；R^t 1.94min；m/z 637(M+H)⁺(ES⁺)。

6-(4-(5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸:中间体(II).

向6-(4-(5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(3.72g,5.84mmol)在THF:MeOH混合物(1:1,40mL)的溶液中加入氢氧化锂(700mg,29.2mmol)在水(40mL)中的溶液。将反应混合物加热至50℃持续1小时，然后冷却至室温。真空除去挥发物，并将剩余水溶液用水稀释，并超声直至所得沉淀溶解。将该混合物通过加入1M盐酸中和，并经过滤收集所得固体，真空干燥，得到标题化合物，为灰白色固体(3.27g,92％产率)；R^t 1.64min；m/z 609(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:1.62(4H,br t),2.16(3H,s),3.00-3.51(假定8H，被溶剂遮蔽),3.60(4H,s),4.82-4.96(1H,br),6.86(1H,br d),6.99(2H,br d),7.11(1H,br t),7.28(1H,td),7.46-7.54(3H,重叠m),7.62(1H,s),7.78(1H,dd),8.03(1H,dd),10.38(1H,s)。

6-(4-(2-氯-5-甲基烟酰胺基)苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺:中间体(IIIa)

将2-氯烟酰氯(1.21g,3.36mmol)在DCM(10mL)中的溶液加入搅拌过的6-(4-氨基苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(2.00g,4.24mmol)在吡啶(10mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后倒入水(100mL)中，并萃取入EtOAc中(2x 50mL)。将合并的有机物真空蒸发，并将所得固体在EtOAc(50mL)中浆化，经过滤收集。使用5.0、15.0和最后18.0g的所述苯胺原料，以逐渐增大的规模重复上述方法三次。将所有四个批次溶解在DCM(300mL)中来将其合并。真空蒸发溶剂，得到标题化合物，为白色固体(40.3g,75％产率)；R^t2.39min；m/z 625(M+H)⁺(ES⁺)；¹HNMRδ:2.26(3H,s),2.32(3H,s),3.09-3.33(假定3H，被溶剂遮蔽),4.83-5.03(1H,m),6.86(1H,d),7.04(2H,d),7.09-7.19(3H,m),7.22-7.34(2H,m),7.51(2H,d),7.83(1H,dd),7.91(1H,d),7.96(1H,s),8.36(1H,dd),10.04(1H,s),10.71(1H,s)。

6-(4-氨基苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺:中间体(IV)

方法1:溶解金属还原

向N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(5.00g,9.97mmol)在EtOH(100mL)的溶液中加入氯化铵(5.33g,100mmol)、水(20mL)，然后加入铁粉(2.78g,49.8mmol)。将所得混合物回流下搅拌1小时，随后经硅藻土过滤。将该硅藻土垫用EtOH(50mL)洗涤，并将合并的滤液真空蒸发。将所得残余物溶于EtOAc(200mL)中，用水洗涤(2x 100mL)，并随后干燥，真空蒸发。用另外的N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(15.0g,29.9mmol)重复该方法三次，并将所得固体合并，用Et₂O(200mL)研磨，得到标题化合物，为浅黄色固体(41.1g,87％产率)；R^t 2.12min；m/z 472(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:2.25(3H,s),3.02-3.30(3H,br),4.85-5.05(1H,br),5.51(2H,s),6.27(2H,d),6.75(2H,d),6.80(1H,d),7.10-7.15(3H,重叠m),7.24-7.30(2H,重叠m),7.81(1H,dd),7.93(1H,s),10.02(1H,s)。

方法2:催化氢化

向N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(100mg,0.199mmol)在THF(4.0mL)的溶液中加入5％Pd/C糊(58wt％水,21.0mg,0.100mmol)，并将该混合物在5巴氢气下搅拌18小时。反应完成后，将该混合物通过Agilent 0.45μm注射过滤器，并将滤液真空蒸发，得到标题化合物(91.0mg,97％产率)；R^t 2.13min；m/z 472(M+H)⁺(ES⁺)。

制备N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-(5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬-2-基)烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺:化合物(I)。

途径1:噻吩羧酸(II)与2-氟-6-甲基苯胺的酰胺偶联。

向6-(4-(5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酰胺基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸(400mg,0.657mmol)在DCM(40mL)的溶液中加入1-氯-N,N,2-三甲基丙-1-烯-1-胺(174μL,1.31mmol)。将反应物在室温下搅拌1.5小时，并随后真空浓缩。将该残余物溶于DCM(40mL)，并将该溶液的等分试样(5.0mL，0.080mmol)加入到2-氟-6-甲基苯胺中，将反应混合物在室温下搅拌3天。真空蒸发挥发物，并将所得残余物经制备型HPLC纯化，得到化合物(I)，为灰白色固体(14mg,23％产率)；R^t1.85min；m/z 716(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:1.62(4H,br t),2.17(3H,s),2.26(3H,s),3.14-3.37(假定3H，被溶剂遮蔽),3.46(4H,br t),3.60(4H,s),4.90-4.98(1H,br),6.88(1H,brd),7.02(2H,br d),7.10-7.16(3H,重叠m),7.25-7.31(2H,重叠m),7.48(1H,d),7.52(2H,br d),7.82(1H,dd),7.95(1H,s),8.04(1H,dd),10.03(1H,s),10.37(1H,s)。

途径2:用7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷代替氯代烟酰胺(III)的S_NAr置换。

向6-(4-(2-氯-5-甲基烟酰胺基)苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(10.0g,16.0mmol)和7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷半草酸盐(10.4g,48.0mmol)在NMP(125mL)的溶液中加入三乙胺(13mL,96mmol)，并将反应混合物在145℃加热7小时。冷却至室温后，将该混合物倒入水(800mL)中，并将所得固体经过滤收集，用水洗涤(2x 100mL)，并溶于DCM(400mL)中。将该溶液用水(100mL)洗涤，用硫酸钠干燥，并真空蒸发。将固体残余物经快速柱色谱纯化(SiO₂,220g,20-100％EtOAc在乙醚中的溶液，梯度洗脱)，得到标题化合物，为白色固体。对另外5和10g批次的氯烟酰胺原料重复该程序。通过溶解在EtOAc(500mL)中将三个产物批次合并，真空蒸发溶剂。将所得固体用乙醚(200mL)研磨，并经过滤收集固体，干燥，得到标题化合物，即化合物(I)，为白色固体(24g,82％产率)；R^t 1.88min；m/z 716(M+H)⁺(ES⁺)。

途径3:苯胺(IV)与2-氨基烟酸(VI)的酰胺偶联

向5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酸(83mg,0.32mmol)在DCM(5.0mL)的溶液中加入1-氯-N,N,2-三甲基丙-1-烯-1-胺(37μL,0.28mmol)。将该混合物在室温下搅拌15分钟，并随后加入6-(4-氨基苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(100mg,0.21mmol)在吡啶(5.0mL)的溶液中。将反应混合物再搅拌1小时，并真空浓缩。将该残余物用水(20mL)研磨，并将所得浅黄色固体经过滤收集，并经快速柱色谱纯化(SiO₂,12g,0-10％MeOH在DCM中的溶液，梯度洗脱)，得到化合物(I)，为白色固体(55mg,36％产率)；R^t 1.88min；m/z 716(M+H)⁺(ES⁺)。

通过途径2的化合物(I)的放大制备

上文对途径2所述的合成方法已经成功地用于以>0.5kg的规模制备本发明的化合物。与此策略有关的分析和光谱方法如下所述。

分析和光谱方法

LCMS分析的反相HPLC条件：CORTECS C18⁺4.6x 150mm柱；2.7μm(Ex.Waters#186007408)，在40℃；流速1.0mL.min^-1，历经25min用包含0.1％甲酸的纯化的H₂O-MeCN梯度洗脱，用UV 310nm检测。注射体积5μL。梯度信息：0-15min,从95％H₂O-5％MeCN升至5％H₂O-95％MeCN；15-25min,保持在5％H₂O-95％MeCN。

¹H NMR光谱：光谱使用JOEL ECX 400MHz光谱仪获得。使用残余的未氘化溶剂作为参考，并将样品在DMSO-d₆中运行。

1-(4-硝基苯甲酰基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[b]氮杂-5-酮。

向1,2,3,4-四氢苯并氮杂-5-酮(2670g,16.6mol)在DCM(23.2L)的溶液中加入30％w/v K₂CO₃水溶液(15.2L)。历经15分钟分批加入4-硝基苯甲酰氯(3105g,16.7mol)，并保持内部温度<25℃。将反应物在18-25℃搅拌18小时，此时TLC(50％v/v乙酸乙酯在庚烷中的溶液)指示反应完全。加入另外的4-硝基苯甲酰氯(167g,0.9mol)，并将反应物再搅拌1.5小时，然后TLC指示反应完全。分离各相，并将有机物加入2M NaOH(10L)溶液中，搅拌2小时。分离各相，将有机相用水洗涤(2x 5L)，用MgSO₄干燥，并过滤。将过滤垫用DCM(4L)洗涤，并将合并的有机相真空蒸发。将所得固体在45℃真空干燥24小时，得到标题化合物，为浅米色固体(4998g,97％活性产率；HPLC纯度96.2％,NMR纯度>95％)；R^t 10.09min；m/z 311.1(M+H)⁺(ES⁺)。

5-氯-1-(4-硝基苯甲酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[b]氮杂-4-甲醛

将装有DMF(10.0L)的50L瓶冷却至0℃，并历经1小时用磷酰氯(1802mL,19.33mol)逐滴处理，期间保持内部温度低于5℃(观察到从0-5℃的放热)，随后在0-5℃搅拌30分钟。将1-(4-硝基苯甲酰基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[b]氮杂-5-酮(5000g，16.11mol)在DMF(10.0L)中的溶液(通过在70℃溶解制备)随后历经30分钟在保持温度(以避免沉淀)下通过真空转移到磷酰氯/DMF溶液中，保持该批次温度在0-10℃之间。添加完成后，将反应物在氮气下在0-5℃下搅拌30分钟，然后在80℃下搅拌18小时，此时HPLC分析显示原料消耗完全。将反应混合物冷却至40℃并分成两等份，两者以相同的方式处理如下。将第一部分真空浓缩至其初始体积(～7L)的约一半，然后历经2小时加入到预冷却至10℃的饱和NaOAc水溶液(34.0L)中(观察到从20-30℃放热)。在20℃下搅拌15分钟后，将混合物用DCM(27.2L)萃取，并分离各相。将水层用DCM(27.2L)反萃取，并分离各相。将合并的有机萃取物用水(2×40L)洗涤，然后用MgSO₄(4.0kg)干燥并过滤，浓缩滤液。对粗反应混合物的第二部分重复相同的后处理程序，并与第一部分合并，得到标题化合物，为油状物(5119g,89％活性产率,HPLC纯度87.6％,¹H NMR纯度95％)；R^t 11.74min；m/z 357.2(M+H)⁺(ES⁺)。

6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯

向5-氯-1-(4-硝基苯甲酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[b]氮杂-4-甲醛(3418g，9.580mol)在吡啶(15.83升，195.4摩尔)的溶液中在10℃下在氮气中在30分钟内滴加2-巯基乙酸乙酯(1118毫升，10.24摩尔)，同时保持内部温度低于20℃(观察到从10-15℃放热)。然后在30分钟内滴加三乙胺(7531.51mL，54.03mol)处理所得溶液，保持内部温度低于20℃(没有观察到放热)。将反应混合物在20℃下搅拌1小时，然后在70℃下搅拌18小时。此后，HPLC分析显示起始的氯烯醛消耗完全，并将反应物冷却至18-25℃。

将该混合物过滤(以除去不溶性盐)，并用丙酮(1.0L)洗涤垫。将合并的滤液真空浓缩以除去挥发物，将残余物溶于DCM(11964mL)中，并用水(7623mL)洗涤。分离有机相，用1M盐酸(7623mL)洗涤，然后用MgSO₄干燥。通过过滤除去无机物，用DCM(4.0L)洗涤，将合并的滤液真空蒸发至油状残余物。

将残余物溶于乙醇(20500mL)，并将该溶液在60℃搅拌1小时，然后冷却至18-25℃，并在此温度下搅拌1小时。将所得固体经过滤收集，用乙醇(13.8L)洗涤，并在50℃真空干燥，得到标题化合物(2939g,73％活性产率,HPLC纯度96.9％,¹H NMR纯度>97％)；R^t13.85min；m/z 423.2(M+H)⁺(ES⁺)。

6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸

在18-25℃下在50L瓶中装入THF和水的1:1混合物(37.63L)和6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸乙酯(3763.7g,8.90mol)。向所得溶液中分批加入固体KOH(749.1g,13.35mol)，期间保持内部温度低于25℃(观察到从20-22℃放热)。将反应物在50℃加热18小时，此时HPLC分析显示起始原料消耗完全。将反应物冷却至18-25℃，并将有机溶剂真空除去。将剩余水溶液用水(28.27L)稀释，随后将浓盐酸(1.25L)缓慢加入该溶液中，直至达到pH 1(观察到5℃放热，具有温和的产气)。过滤所得浅棕色悬浮液，并用水(2×9.5L)洗涤过滤垫。将该固体在烘箱中在50℃真空下干燥，得到标题化合物(3185.5g,91％活性产率,HPLC纯度98.0％,¹H NMR分析91.0％)；R^t 11.11min；m/z395.2(M+H)⁺(ES⁺)。

N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺

将6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酸(1714g,1560g活性物质,3.955mol)在DCM(15.6L)中的混悬液置于氮气中，并将DMF(6.2mL,79.1mmol)加入该混合物中。然后历经40分钟缓慢加入草酰氯(690mL,7.91mol)以控制气体产生(观察到从16.9到18.3℃放热)，并将反应混合物在18-25℃搅拌过夜。TLC分析(8％甲醇在DCM中的溶液)指示一部分噻吩羧酸起始物质剩余，将另外的草酰氯(300mL,3.44mol)加入该混合物中。在18-25℃搅拌3小时，反应完全，将所得混合物真空浓缩，得到6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰氯，为深黄色固体(¹H NMR指示存在15.4％DCM和0.5％DMF)。

在氮气下将所得的粗的酰氯悬浮在DCM(7.8L)中，并用吡啶(480mL，5.93mol)处理。然后在15分钟内缓慢加入2-氟-6-甲基苯胺(475mL，4.11mol)并同时在冰/水浴中冷却(导致从20.9-35.2℃放热)。该混合物形成溶液，并在18-25℃下搅拌过夜，此时测定反应完成(HPLC 250nm)。

将所得悬浮液分成两等份，每份用水(7.8L)稀释，在18-25℃下搅拌1小时，然后通过过滤收集固体。将两个滤饼各自用水(1.8L)和DCM(2×1.6L)洗涤并合并。将固体在50℃的烘箱中干燥，得到标题化合物，为灰白色固体(1573g,79％活性产率,¹H NMR纯度>95％,包含1.98％DCM和0.56％吡啶.HCl)；R^t 12.76min；m/z 502.4(M+H)⁺(ES⁺)。

6-(4-氨基苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺；中间体(IV)

在氮气中向N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-硝基苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(80g,0.160mol)在DMF(240mL)和2-MeTHF(640mL)的混合物中的溶液中加入20％Pd(OH)₂/C催化剂(8.0g)，并将该混合物用氢气吹扫和加热到55℃。将该混合物用氢气吹扫3小时后，将反应置于氢气中过夜，然后再用氢气吹扫4小时。HPLC分析指示存在98.5％的产物和0.55％的反应中间体(结构未确认，假定为亚硝基或羟胺中间体)。

将反应混合物冷却至48℃，并通过硅藻土垫(24g)。将该硅藻土垫用DMF洗涤(2x160mL)，并将这些包含催化剂的洗涤液通过在线过滤器。将合并的滤液真空浓缩以除去大部分2-MeTHF，得到DMF/产物溶液。将该混合物历经5分钟加入水(1.6L)中，将其用冰/水浴冷却(观察的从9.9-17.6℃放热)，得到白色混悬液，将其在18-25℃搅拌1小时。经过滤收集固体，滤饼用水洗涤(3x 160mL)，然后在烘箱中于50℃干燥，得到产物，为白色固体(75.5g,HPLC纯度98.2％,经KF检测为0.34％H₂O,¹H NMR检测为6.56％DMF)。

将如此获得的固体在18-25℃下在DCM(400mL)中浆化65分钟，通过过滤收集，并用DCM(2×160mL)洗涤滤饼。然后将该物质在50℃下于烘箱中干燥，得到标题化合物，为白色固体(72.0g,65.9g活性产物,88％产率,HPLC纯度98.75％；NMR检测包含8.25％DCM和0.19％DMF)；R^t 11.01min；m/z 472.4(M+H)⁺(ES⁺)。

6-(4-(2-氯-5-甲基烟酰胺基)苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺；中间体(IIIa)。

在18-25℃下将草酰氯(133mL,1.58mol)加入2-氯-5-甲基烟酸(225.4g,1.313mol)在DCM(2254mL)的混悬液中，随后加入DMF(0.8mL,0.010mol)(导致轻微的放热和气体逸出)，并将反应物在20-25℃搅拌1小时。等分试样(淬灭到甲醇中)的HPLC分析表明剩余<1％的2-氯-5-甲基烟酸。真空除去溶剂，并将油状残余物与DCM(500mL)共沸以除去残余草酰氯。

将所得油状物溶于DCM(413mL)中，并在10分钟内滴加到6-(4-氨基苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(412.9g，0.876mol)在吡啶(283mL，3.502mol)和DCM(28920mL)的混合物中的溶液中，同时保持内部温度<40℃(最高温度达到38℃)。将反应物在18-25℃下搅拌1小时，此后HPLC(样品在甲醇中猝灭)表明反应完成(<1％的苯胺剩余)。

在18-25℃下向混合物中加入庚烷(3300mL)，将所得悬浮液搅拌15分钟，然后通过过滤收集固体。将滤饼用庚烷(2×1650mL)洗涤，将所得粗固体在90-95℃下在水(4130mL)中浆化30分钟，然后冷却至18-25℃。通过过滤收集固体，用水(2×826mL)洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥，得到标题化合物，为白色固体(504.2g,92％活性产率,HPLC纯度[230nm]98.24％；通过¹H NMR检测包含0.3％吡啶HCl，通过KF检测包含0.4％.H₂O)；R^t 12.19min；m/z 625.6(M+H)⁺(ES⁺)。

N-(2-氟-6-甲基苯基)-6-(4-(5-甲基-2-(7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基)烟酰氨基)苯甲酰基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺:化合物(I)

将6-(4-(2-氯-5-甲基烟酰胺基)苯甲酰基)-N-(2-氟-6-甲基苯基)-5,6-二氢-4H-苯并[b]噻吩并[2,3-d]氮杂-2-甲酰胺(563.9g,0.902mol)、7-氧杂-2-氮杂螺[3.5]壬烷半草酸盐(233.0g,1.353mol)和碳酸钾(374.0g,2.706mol)在NMP(2820mL)中的混悬液在105-115℃搅拌18小时(HPLC分析显示形成97.7％的所需产物和0.02％的氯-烟酰胺剩余)。

将反应物冷却至18-25℃，并在<45℃下搅拌中加入水(8459mL)中(轻度放热猝灭)。在18-25℃搅拌30分钟后，将所得固体经过滤收集，用水(2x 1128mL)洗涤，并吸干。将所得粗产物在水(5640mL)中在90-95℃重新浆化30分钟，然后冷却至18-25℃，经过滤收集，用水洗涤(2x 1260mL)，并在真空炉中在50℃干燥，得到白色固体(632.0g)。

¹H NMR光谱指示存在1.7％NMP，将该固体在水(5640mL)中于90-95℃重新浆化30分钟，冷却至18-25℃，过滤，用水洗涤(2x 1260mL)，并吸干。在真空炉中在50℃进一步干燥，得到标题化合物，为白色固体(614.0g,95％,通过¹H NMR检测包含0.75％NMP，通过KF检测为1.7％H₂O)R^t 9.48min；m/z 716.8(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMRδ:1.60(4H,br t),2.16(3H,s),2.25(3H,s),3.14-3.30(假定3H，宽m，部分被溶剂遮蔽),3.44(4H,br t),3.59(4H,s),4.93(1H,br d),6.86(1H,br d),7.01(2H,br d),7.09-7.15(3H,重叠m),7.24-7.30(2H,重叠m),7.48(1H,d),7.51(2H,br d),7.82(1H,d),7.95(1H,s),8.02(1H,d),10.04(1H,s),10.39(1H,s)。

生物学测试：实验方法

在HEp2细胞中评估RSV诱导的CPE

在感染前一天，在384孔板(目录号353962，BD Falcon，Oxford，UK)中含有2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的5％无血清DMEM中接种HEp2细胞(103/孔/50μL)。在含有2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的无血清DMEM中制备RSV A2毒株(#0709161v,NCPV,PublicHealth England,Wiltshire)或RSV B Washington毒株(VR-1580,ATCC,Manassas,VA20108)，然后加入(50μL/孔)以达到1MOI的最终病毒浓度。同时，将化合物(I)(0.5μL DMSO溶液)加入到含有病毒溶液的100μL HEp2细胞培养物中，以提供0.5％的最终DMSO溶液。将板(37℃/5％CO₂)孵育5天以便使用RSV A2毒株进行研究，或孵育6天以便使用RSV B毒株进行研究，然后将刃天青钠盐(5μL的0.03％溶液；Sigma-Aldrich，Dorset，UK)加入到每个孔中并将板再孵育6小时(37℃/5％CO₂)。使用多孔扫描仪(Clariostar：BMG，Buckinghamshire，UK)测定每个孔的荧光[545nm(激发)/590nm(发射)]。计算每个孔的抑制百分比，并且从化合物(I)生成的浓度-响应曲线计算IC₅₀、IC₇₅和IC₉₀值。

BEAS2B支气管上皮细胞中RSV F蛋白表达的评估

RSV上皮细胞感染后的早期事件是RSV F-蛋白在细胞表面上的表达。将BEAS2B细胞(SV40永生化的人支气管上皮细胞系)在96孔板中生长。一旦超过70％汇合，使用在含有2％FBS(Life technologies,Paisley,UK)的澄清RPMI-1640培养基(Life technologies，Paisley，UK)中的RSV A2(#0709161v，NCPV，Public Health England，Wiltshire)以0.01的MOI感染细胞，并孵育3天(37℃/5％CO₂)。

吸出上清液，细胞用4％甲醛(100μL在PBS中的溶液)固定20分钟，用洗涤缓冲液(200μL；含0.05％Tween-20的PBS)洗涤3次，并用封闭溶液(100μL；5％Marvel牛奶在PBS中的溶液)孵育1小时。然后用洗涤缓冲液(200μL)洗涤细胞，并与抗-RSV(2F7；小鼠单克隆，批号160290，目录号ab43812，Abcam plc，Cambridge，UK)F-融合蛋白抗体(50μL；在5％牛奶/PBS-吐温中以1:1000稀释制备)在37℃下孵育1小时。洗涤后，将细胞与HRP缀合的抗小鼠IgG抗体(50μL，在PBS中的5％牛奶中以1:2000稀释制备；批号00095437，目录号P0447，DakoUK Ltd，Cambridgeshire，UK)孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，用PBS洗涤一次。然后加入TMB底物(100μL；底物试剂包批号320436，目录号DY999，R&D Systems，Inc.Abingdon，UK)，加入硫酸水溶液(50μL；2N)终止反应。在微板读数器(MultiskanThermoFisher Scientific)中比色法测定所得信号(OD：450nm，参考波长为655nm)。然后洗涤细胞，用1％结晶紫溶液(50μL；批号SLB4576，目录号HT90132-1L，Sigma-Aldrich)处理30分钟。用PBS(200μL)洗涤三次后，向每个孔中加入1％SDS(100μL)，将平板轻轻摇动1小时，然后读取在595nm的吸光度。通过用OD_450-655除以OD₅₉₅读数来校正测量的OD_450-655读数的细胞数。计算每个孔的抑制百分比，并且从化合物(I)产生的浓度-响应曲线得出IC₅₀值。

细胞存活力：刃天青试验

在实验前一天将HEp2细胞接种在384孔板(10³/孔/50μL；BD Falcon Ref 353962)中的FBS DMEM(5％，含有2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠)中。将无血清DMEM(50μL)加入到测试孔中，而对于对照孔，除去培养基并加入无菌水(100μL)。加入化合物(I)(0.5μL DMSO溶液)，得到0.5％的最终DMSO浓度。将Hep2细胞与每种测试化合物孵育5天(37℃/5％CO₂在5％FBS中)，然后将刃天青储备溶液(5μL；0.03％)加入到每个孔中，将板孵育另外6小时(37℃/5％CO₂)。使用多扫描仪(Clariostar：BMG Labtech)测定每个孔在545nm(激发)和590nm(发射)处的荧光。相对于溶媒(0.5％DMSO)处理，计算每个孔的细胞存活力的损失百分比。

因此，相对于溶媒，与测试化合物处理相关的细胞存活力的任何明显增加被计算为负百分比。在适当的情况下，从化合物(I)产生的浓度-响应曲线计算CC₅₀值。

评估空气-液体界面(ALI)培养的支气管上皮细胞中的病毒滴度

ALI培养的人支气管上皮细胞来自Epithelix Sàrl(瑞士,日内瓦)，并通过每3-4天更换基础培养基来维持，同时用PBS每周洗涤一次顶部表面。在第0天，用无菌PBS(300μL)将每孔的顶端表面洗涤一次，将插入物转移到含有新鲜MucilAir培养基(780μL；EP04MM)的新24孔板中。将RSV A2(50μL；在MucilAir培养基中稀释，得到0.01的最终MOI)加入细胞1小时(37℃/5％CO₂)。为了标准化MOI计算，每个MucilAir插入物被估计为含有每孔2×10⁵个顶面细胞。用移液枪除去病毒接种物，将插入物用无菌PBS(300μL)洗涤两次。

通过向每个孔的顶部表面添加无菌PBS(300μL)5分钟进行取样。然后取出顶端样品并转移到含有溶于PBS(50μL)的50％蔗糖的管中，然后储存在-80℃。从第0天开始每天重复该收获程序，并在第7天结束。

对于“早期干预”方案，在第0-7天对ALI培养物进行顶端施用化合物(I)，或对于“晚期干预”方案，在第3-7天进行顶端施用。将化合物(I)(50μL，在0.5％DMSO/PBS中)加入到顶端表面，孵育1小时(37℃/5％CO₂)后移除。在相应的顶端表面上进行溶媒处理(0.5％DMSO/PBS)，以确保每个孔接受相同数目的操作。在第5天，从每个孔中取出基础培养基并补充新鲜的MucilAir培养基作为ALI培养细胞的必要维持步骤。

通过噬斑测定来定量病毒滴度。HEp2细胞在24孔板(Corning)中生长48小时，然后在含有10％FBS的DMEM中感染，直到它们达到100％汇合。收集的样品在室温下解冻，并在无血清DMEM中制备10倍系列稀释液。抽吸来自HEp2细胞的生长培养基并用300μL系列稀释的病毒收集物替换，并在37℃/5％CO₂下感染4小时。吸去感染性培养基并用Plaque AssayOverlay(500μL；MEM中的1％甲基纤维素，2％FBS，1％Pen Strep，0.5μg/mL两性霉素B)替换，并在37℃/5％CO₂下放置7天。将细胞用冰冷的甲醇固定10分钟，并在室温下用在0.05％PBS-吐温('封闭缓冲液')中的5％奶粉(Marvel)封闭1小时。将抗RSV F蛋白抗体(2F7；Abcam：ab43812)在封闭缓冲液中稀释至1:100的浓度，加入细胞中并在室温下振摇1小时。使用PBS洗涤细胞，并与第二抗体(HRP缀合的山羊抗小鼠第二抗体(Dako P044701-2)用封闭缓冲液以1:400稀释)在室温下振摇孵育1小时。除去二抗溶液，用PBS洗涤细胞，随后用超纯水(按照制造商的说明书)制备金属增强的显影底物DAB。每孔接受300μL显影底物(sigmaFAST D0426)，直到斑块可见。通过肉眼计数噬斑并使用光学显微镜确认，计算每mL的噬斑形成单位。

小鼠中的RSV感染

在异氟烷(5％在O₂中)麻醉下，用RSV A2或病毒稀释液(DMEM，2％FBS，12.5％蔗糖)鼻内感染非禁食小鼠(雄性BALB/C，20-30g)。将RSV的A2株(50μL的1.3×10⁶PFU/mL：最终0.65×10⁵PFU/小鼠)以滴注方式滴注到每个鼻孔中，在两鼻孔之间交替递送，直到递送50μL的体积。感染后，每只动物每天称重以监测变化。将化合物(I)溶于100％DMSO(20mg/mL和/或2mg/mL)中，然后在等渗盐水中以1:10稀释，以在所有处理中达到10％DMSO。然后将制剂超声处理以产生悬浮液。在感染(第0天)前1天和1小时，然后在感染后第1、2和3天，用FMJ-250PennCentury装置经气管内(20μL)或用移液管经鼻内(40μL)施用悬浮液。RSV激发后四天，将动物安乐死(通过腹膜内注射过量的戊巴比妥)，气管插管，并提取BALF用于总细胞计数和分化细胞计数。在BALF收集后，从每只动物取出右肺并在冰冷的达尔贝克改良的Eagles培养基(使用10倍于肺重量的含有1％BSA和25％蔗糖的DMEM)中匀化2×20秒。然后将匀浆转移到无菌管中并在4℃(2000rpm；5分钟)下旋转。将澄清的匀浆转移至冷冻的冷冻管中，快速冷冻并储存在-80℃。将来自肺匀浆的上清液用于空斑测定。

将HEp2细胞在24孔板(Corning)中生长48小时，然后在含有10％FBS的DMEM中感染，直到它们达到100％汇合。将肺匀浆物在室温解冻，并在无血清DMEM中制备10倍系列稀释液。抽吸来自HEp2细胞的生长培养基并用300μL连续稀释的肺匀浆物替换，进行感染(4h；37℃/5％CO₂)。抽吸感染性培养基并用Plaque Assay Overlay(500μL；1％甲基纤维素在MEM中，2％FBS、1％Pen Strep、0.5μg/mL两性霉素B)替换，并放置7天(37℃/5％CO₂)。将细胞用冰冷却的甲醇固定10分钟，并在室温下用在0.05％PBS-吐温(封闭缓冲液)中的5％奶粉(Marvel)封闭1小时。

将抗RSV F-蛋白抗体[2F7](Abcam：ab43812)在封闭缓冲液中稀释至1:100的浓度，加入细胞并在室温下振荡1小时。使用PBS洗涤细胞，然后与第二抗体(以1:400用封闭缓冲液稀释的HRP缀合的山羊抗小鼠第二抗体(Dako P044701-2))在室温下摇动孵育1小时。除去二抗溶液，用PBS洗涤细胞，然后用超纯水(按照制造商的说明书)制备金属增强的显影底物DAB。每孔接受300μL显影底物(sigmaFAST D0426)，直到斑块可见。通过肉眼计数噬斑并使用光学显微镜确认，计算每mL肺匀浆上清液的噬斑形成单位。

棉鼠中的RSV感染

用hRSV/A/Long(ATCC，Manassas，VA；10⁵pfu)以体积为0.1mL的蔗糖稳定培养基感染6和8周龄之间的雄性Sigmodon hepidus棉鼠。将化合物(I)溶于100％DMSO(以3.3、10、33和100mg/mL)，然后在等渗盐水中以1:10稀释，以在所有处理中达到10％DMSO。然后将制剂超声处理以产生悬浮液。在感染前4小时(第0天)，然后在感染后第1、2和3天，通过移液管经鼻内(50μL)施用所得悬浮液。RSV激发后4天，将动物安乐死并取出肺。左叶用于通过噬斑测定的病毒滴定，舌叶用于RSV/A/Long NS-1 qRT-PCR和细胞因子qRT-PCR。

在Eagle(E)-MEM中将肺匀浆的上清液以1:10和1:100稀释。从未稀释(纯的)样品开始、随后用稀释的匀浆，一式两份感染24孔板中的汇合HEp-2单层(50μL样品/孔)。在孵育1小时(37℃/5％CO₂)后，孔用0.75％甲基纤维素培养基覆盖，并在37℃培养箱中替换平板。孵育(4天)后，除去覆盖物，将细胞用0.1％结晶紫染色固定(1小时)，然后冲洗并风干。计数斑块，病毒滴度表示为每克组织的斑块形成单位(pfu.g^-1)。

也从匀浆的肺组织中提取总RNA(RNeasy纯化试剂盒；Qiagen)，并使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)用样品(1μg)制备cDNA。对于实时PCR反应(RSV NS-1和RANTES基因)，使用QuantiFastGreen PCR试剂盒(Qiagen)，终体积为25μL，引物终浓度为0.5μM。在Bio-Rad iCycler上进行扩增：在95℃历时3分钟1次循环，然后以95℃10秒、60℃10秒、72℃15秒40次循环。基线循环和循环阈值(Ct)由iQ5软件在PCR基线扣除曲线拟合模型中计算。使用在目的转录物(例如来自RSV感染后第4天的肺)中最富集的连续稀释的cDNA样品制作标准曲线。将Ct值与log₁₀cDNA稀释因子作图。这些曲线用于将不同样品获得的Ct值转换为相对表达单位，然后将其用相应样品中表达的β-肌动蛋白mRNA水平(“管家基因”)进行标准化。mRNA水平表示为一组中所有动物的几何平均值±SEM。

体外筛选结果

本文公开的化合物(I)的性质总结于下表(表A)，并显示了对HEp2细胞中RSV A2诱导的CPE和RSV B诱导的CPE的有效抑制活性。此外，本发明的化合物在BEAS2B支气管上皮细胞中表现出对RSV A2F蛋白表达的有效抑制。检测到与化合物(I)孵育对细胞存活力无影响。

表A化合物(I)的处理对HEp2细胞中RSV A2-和RSV B诱导的CPE、对BEAS2B支气管上皮细胞中RSV A2F蛋白表达和细胞存活力的影响。

在指定浓度下的IC₅₀/CC₅₀值(nM)或抑制率(％)

表注：1.在0.1μg/mL的抑制率(％)；2.在1μg/mL的抑制率(％)；

还使用空气-液体培养的人原发性支气管上皮细胞评估抗病毒效应。所述细胞经历广泛的粘液纤毛分化，导致具有与正常人呼吸道上皮中观察到的形态特征相似的培养物。因此，该细胞模型密切模仿人类气道中的RSV感染。

RSV滴度从第1天开始升高，然后在第3天达到峰值，然后逐渐温和地降低至第7天。从第0天到第7天，化合物(I)每天处理顶端孔(早期干预，见表B，图1)诱导了浓度依赖性抑制，并且在7天内在0.1μg/mL显示完全抑制。在病毒峰值后第3天给药时，用化合物(I)处理在感染后第6天和第7天也产生显著降低的病毒滴度(晚期干预，见表C，图2)。

表B：用化合物(I)早期干预(0-7天)对RSV A2感染的空气-液体界面培养的支气管上皮细胞顶端洗涤液中RSV A2病毒滴度的影响。

在所述天数的顶端洗涤液中的病毒滴度，表示为几何平均值

1.如果在用10倍稀释的顶端洗涤液的测定中检测到任何斑块，则分配为1PFU/mL；2.所有实验的n值为3。

表C：化合物(I)的晚期干预(第3-7天)对RSV A2感染的空气-液体界面培养的支气管上皮细胞的顶端洗涤液中的RSV A2病毒滴度的影响。

在所述天数的顶端洗涤液中的病毒滴度，表示为几何平均值

体内检测

人类RSV能够在用于临床前筛选的许多动物物种中感染和复制，从而使得能够在体内评估和比较新的抗感染剂的性能和特征(Bem等人，2011)。虽然灵长类物种也可以被感染和研究，但这种性质的工作大多数是在小鼠或棉鼠中进行。标准的近亲交配小鼠品系和棉鼠均被表征为用于人RSV复制的“半容许”，但与近亲交配的小鼠品系相比，在棉鼠中可见显著更强的病毒复制。因此，化合物(I)在上述体内系统中进行检测。

在RSV A2感染的小鼠中，病毒滴度在接种后第4天达到峰值。化合物(I)在接种前1天和1小时(第0天)施用，然后在病毒感染后第2天和第3天鼻内(表D，图3)或气管内(表E)施用，并且在两种情况下都表现出有效的剂量依赖性抑制肺匀浆中的病毒滴度。

表D:使用化合物(I)进行鼻内处理对来自RSV A2感染小鼠的肺中的RSV A2病毒滴度的影响。

1.所有实验的n值为8；2.:定量下限(LOQ)。

表E:化合物(I)的气管内处理对来自RSVA2感染小鼠的肺中RSV A2病毒滴度的影响。

1.所有实验的n值为8；2.:定量下限(LOQ)。

在第4天，来自RSV/S/Long感染的棉鼠的肺匀浆中也观察到化合物(I)对病毒滴度的有效的剂量依赖性抑制(表F，图4)。此外，药物物质显示RSV NS-1基因转录物(表G)和肺中RANTES转录物的剂量依赖性抑制(表H)。

表F:使用化合物(I)进行鼻内处理对来自RSV A2感染的棉鼠的肺中的RSV A2病毒滴度的影响。

1.所有实验的n值为6；2.:定量下限(LOQ)。

表G:使用化合物(I)进行鼻内治疗对RSV A2感染的棉鼠肺中RSV A2NS-1基因表达的影响。

1.所有实验的n值为6。

表H:用化合物(I)鼻内处理对RSV A2感染的棉鼠肺中RANTES基因表达的影响。

1.所有实验的n值为6。

综述

本发明化合物的体外抗病毒活性已通过其对RSV感染的HEp2细胞的细胞保护作用证实。在该测定系统中，从所得到的对病毒介导的CPE的抑制来检测和定量病毒复制的抑制。特别值得注意地是，化合物(I)是对所研究的RSV A毒株和RSV B毒株诱导的CPE的有效抑制剂。化合物(I)的有效抗病毒活性进一步通过其在BEAS2B细胞中抑制RSV A2F蛋白表达而得到证实。

本发明化合物通过其在细胞存活力测定中没有任何显著的影响而证实其对哺乳动物细胞的低毒性。此外，在包括支气管上皮细胞的空气-液体界面培养物在内的人肺上皮的体外模型中，当通过早期或晚期干预施用时，本发明化合物完全抑制病毒滴度。后一种发现对于治疗已患疾病特别重要。

在用RSV感染的小鼠和棉鼠中已经证明了本发明化合物的体内抗病毒活性。在测定系统中，根据斑块测定中测量的肺匀浆中的RSV滴度检测并定量了病毒复制的抑制率。与在ALI培养的人支气管细胞中进行的研究获得的数据一致，化合物(I)完全抑制了RSV A2感染的小鼠和棉鼠的肺中的病毒滴度。因此，本发明的化合物对于成为治疗和/或预防RSV感染和相关疾病的有效药物具有必需的贡献。

参考文献

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在整个说明书和所附权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包括”和诸如“含有”和“包含”的变体应被理解为暗示包含所述整体、步骤、整体的组或步骤的组，但不排除任何其他整体、步骤、整体的组或步骤的组。

本文所提及的所有专利和专利申请以其整体引入本文作为参考。

Claims

1.式(I)化合物或其可药用盐。

2.如权利要求1所述的化合物，其用作药物。

3.如权利要求1所述的化合物，其用于治疗RSV感染和预防与RSV感染相关的疾病。

4.如权利要求1所述的化合物在制备用于治疗RSV感染和用于预防或治疗与RSV感染相关的疾病的药物中的用途。

5.治疗感染RSV的个体的方法，其包括对所述个体施用有效量的如权利要求1所述的化合物。

6.预防或治疗个体中与RSV感染相关的疾病的方法，其包括在感染前向所述个体施用有效量的如权利要求1所述的化合物。

7.预防个体中与RSV感染相关的疾病的方法，其包括在感染前向所述个体施用有效量的如权利要求1所述的化合物。

8.如权利要求3-7中任一项所述的化合物、用途或方法，其中所述RSV感染是被RSV A毒株的病毒和/或RSV B毒株的病毒感染。

9.如权利要求1所述的化合物，其用作与第二种或其它活性成分组合施用的药物。

10.药物组合物，其包含如权利要求1所述的化合物以及任选的一种或多种可药用稀释剂或载体。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其包含悬浮在水性介质中的颗粒形式的式(I)化合物。

12.如权利要求10所述的药物组合物，其包含第二或其它活性成分。

13.如权利要求9所述的化合物或如权利要求12所述的药物组合物，其中第二或其它活性成分选自：抗病毒药(例如其它抗RSV剂)，包括F蛋白抑制剂(包括抗F蛋白抗体，如帕利珠单抗)，RNA聚合酶抑制剂和利巴韦林，以及抗炎剂。

14.制备如权利要求1中所定义的式(I)化合物或其可药用盐的方法，其包括将式(II)化合物或其盐与2-氟-6-甲基苯胺反应

15.式(II)化合物或其盐

16.制备如权利要求1中所定义的式(I)化合物或其可药用盐的方法，其包括将式(III)化合物或其盐与7-氧杂-2-氮杂螺[3,5]壬烷或其盐反应，

其中LG是离去基团，例如卤素原子，特别是氯。

17.式(III)化合物或其盐，

其中LG是离去基团，例如卤素原子；特别是氯。

18.制备如权利要求1中所定义的式(I)化合物或其可药用盐的方法，其包括将式(IV)化合物或其盐

与式(VI)化合物或其盐反应

19.式(IV)化合物或其盐

20.式(VI)化合物或其盐

21.制备式(II)化合物或其盐的方法，其包括将式(X)化合物或其盐

其中LG是离去基团，例如卤素原子，特别是氯，且R^a是低级烷基，例如乙基；

与7-氧杂-2-氮杂螺[3,5]壬烷或其盐反应，然后将该羧酸酯水解为游离酸。

22.式(X)化合物或其盐，

其中LG是离去基团，例如卤素原子，特别是氯，且R^a是低级烷基，例如乙基。