JP6675407B2 - 新規５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｂ］チエノ−［２，３−ｄ］アゼピン誘導体 - Google Patents

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Description

(発明の分野)
本発明は、新規の化合物、それを含む組成物、該化合物を製造する方法、及び治療におけるその使用に関する。本発明の化合物は、呼吸器合胞体ウイルス感染及び関連疾患、特に、そのA株及びB株によって引き起こされる感染を治療又は予防することが意図される。
(発明の背景)
ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、パラミクソウイルス科のニューモウイルスであり、1歳未満の幼児の細気管支炎及び肺炎の最も一般的な原因である。ほとんどの子供はその2歳の誕生日より前にRSVに感染し、75〜125,000人が入院に至る。関連医療費は、米国だけで年間6億5000万ドルを超えると考えられる。さらに、若年期の呼吸器ウイルス感染、とりわけ、RSVによるものは、その後の小児喘息の発症のリスクを増大させる(Holt及びSlyの文献、2002)。RSV感染は、あらゆる年齢の患者において重度の下気道疾患を生じさせ得る。高齢者及び心臓、肺、又は免疫系障害を有する者が特に影響を受けやすく、65歳を超える対象では、米国で年間約14,000件の死亡が発生すると推定される。さらに、RSV感染は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)(Mohanらの文献、2010)並びに喘息(Newcomb及びPeeblesの文献、2009)及び嚢胞性線維症(Abmanらの文献、1988)に罹患している患者における重要な増悪促進因子(precipitator of exacerbation)であると次第に考えられつつある。免疫不全の成人では、RSVによる上気道感染の約50％が肺炎に進行する。
RSVの初期の進入路は、口よりもむしろ鼻又は目を通るものである(Hallらの文献、1981)。ひとたび上気道に定着すると、ウイルスは、肺に容易に移動することができる。RSV感染の病態生理は、死亡した子供から得られた肺組織の研究において調査された(Johnsonらの文献、2007)。4人の個体由来の組織の検討により、基底細胞が影響を受けることなくRSVが存在することを示す上皮細胞の免疫染色が明らかになった。病原生物の上皮局在は治療への課題を提供している。なぜなら、感染を治療し、その後、消失させることができるためには、有効濃度を超える原薬を個別の細胞部位で維持しなければならないからである。
RSVウイルスは、2つの抗原性サブグループ:A及びBとして存在する。RSV A株のウイルスは、かつては、臨床疾患の大多数の原因となるサブグループ病原体とみなされ、より症候性の病理を生じると報告された(Walshらの文献、1997; Panayiotouらの文献、2014)。一般的なRSV A株はRSV A2である(Olivierらの文献、2009)。しかしながら、最近の中国での大流行の時に、RSV Bサブグループ由来のウイルス株が罹患集団の中で圧倒的に多いことが分かった(Zhangらの文献、2010)。
過去20年にわたり、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)及びB型肝炎とC型肝炎の両方を含むいくつかのウイルス疾患の治療において、かなりの進歩が達成された。これらの全ての事例において、少なくともある程度は薬剤耐性疾患の出現に応えて実現された組合せ治療からなる最も信頼できる治療法が進化してきた。
急性RSV感染の治療に対するFDA承認薬は、(エアロゾル化された)リバビリン及びヒト化モノクローナル抗体のパリビズマブ(Synagis)を含む。後者の薬剤は、RSV融合(F)タンパク質を標的とするものであり、高リスク小児患者での予防的使用に限定されている。さらに、パリビズマブによる中和に耐性のある臨床変異体が最近同定されたため(Zhuらの文献、2011)、真に効果的なワクチンは現在入手できない。リバビリンの使用は、ウイルスに対するその低い効力によって及びその副作用プロファイルに対する懸念によって制限されている。その結果として、改善された臨床プロファイルを有するRSV感染に対する新規の安全かつ効果的な治療法の発見に対する緊急の満たされていない必要性が存在する。さらに、臨床疾患においてRSV B株が新たに目立つようになっていることを考慮すると、これらの治療は、RSV A株とRSV B株の両方に起因する感染に対して有効であることが非常に望ましい。
(発明の概要)
第1の態様において、本発明は: N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミドである、式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩(「本発明の化合物」)を提供する。
Figure 0006675407
本明細書に開示される生物学的データから、本発明の化合物がRSV A株による感染と関連する細胞変性効果を阻害し、かつRSV B株による感染と関連する細胞変性効果も阻害することが明らかになっている。
(図面の簡単な説明)
図1は、試験化合物による早期介入後のRSV A2感染気液界面(ALI)培養上皮細胞におけるウイルス力価に対する化合物(I)の効果を示している。 図2は、試験化合物による後期介入後のRSV A2感染気液界面(ALI)培養上皮細胞におけるウイルス力価に対する化合物(I)の効果を示している。 図3は、RSV A2感染マウスの肺におけるウイルス力価に対する化合物(I)の効果を示している。 図4は、RSV A2感染コットンラットの肺におけるウイルス力価に対する化合物(I)の効果を示している。
(発明の詳細な説明)
式(I)の化合物の医薬として許容し得る塩には、特に、該化合物の医薬として許容し得る酸付加塩が含まれる。式(I)の化合物の医薬として許容し得る酸付加塩は、式(I)の化合物が形成することができる治療的に活性のある無毒な酸付加塩を含むことが意図される。これらの医薬として許容し得る酸付加塩は、遊離塩基形態を、好適な溶媒又は溶媒混合物中にて、そのような適当な酸で処理することによって好都合に得ることができる。適当な酸は、例えば、無機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば、塩酸もしくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など;又は有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、p-アミノサリチル酸、パモン酸などを含む。
逆に、該塩形態を、適当な塩基での処理によって、遊離塩基形態に変換することができる。
本明細書において、例えば、中間体化合物との関連で言及される塩には、医薬として許容し得る塩、例えば、上記の塩及び医薬用途に不利になり得る他の塩が含まれる。酸性化合物の塩には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムイオンを含む、第1族金属及び第2族金属の陽イオンとともに並びに無機陽イオン、例えば、アンモニウムイオンとともに形成される塩が含まれる。
式(I)の化合物の定義は、該化合物の全ての立体異性体を含むことが意図される。本明細書で使用される立体異性体は、同じ分子式及び結合原子の配列(構成)を有するが、それらの原子の空間内での3次元配向だけが異なる異性体分子を指す。これは、同じ分子式を共有するが、結合接続及び/又はその順序が異なる原子/基の間で異なる構造異性体と対照をなす。立体異性体では、構成原子の順序及び結合接続は同じ状態を維持しているが、それらの空間内での配向は異なっている。
式(I)の化合物の定義は、該化合物の全ての互変異性体を含むことが意図される。
式(I)の化合物の定義は、文脈により別途具体的に示されない限り、該化合物の全ての溶媒和物(該化合物の塩の溶媒和物を含む)を含むことが意図される。溶媒和物の例としては、水和物が挙げられる。
本開示の化合物には、1以上の指定された原子が天然又は非天然の同位体である同位体変種が含まれる。一実施態様において、同位体は安定同位体である。したがって、本開示の化合物には、例えば、重水素標識バージョンなどが含まれる。
本開示は、本明細書に定義される化合物の全ての多形形態にも及ぶ。
本明細書に記載の新規の中間体[例えば、式(II)、(III)、(IV)、(VI)、及び(X)の化合物など]は、その塩(例えば、医薬として許容し得る塩)がそうであるように、本発明のさらなる態様を形成する。
本発明の化合物は、医薬として有用である。
一実施態様において、本発明の化合物を、任意に1以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物が提供される。
本発明の化合物は、肺又は鼻に局所的に、特に、肺に局所的に投与されることが好適である。したがって、一実施態様において、本発明の化合物を、任意に1以上の局所に許容される希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物が提供される。
肺又は鼻腔内投与用の組成物は、粉末、液体溶液、液体懸濁液、溶液もしくは懸濁液を含む点鼻剤、又は加圧もしくは非加圧エアロゾルを含むことが好適である。
該組成物は、単位剤形で好都合に投与することができ、例えば、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第17版、Mack Publishing Company, Easton, PA.,(1985)に記載されているような、医薬分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。該組成物は、複数単位剤形で好都合に投与することもできる。
鼻又は肺への局所投与は、水性溶液又は懸濁液などの非加圧製剤の使用によって達成することができる。そのような製剤は、ネブライザー、例えば、手持ち式及び携帯式であり得るネブライザー又は家庭もしくは病院で使用するための(すなわち、非携帯式の)ネブライザーによって投与することができる。装置例は、RESPIMAT吸入器である。該製剤は、水、緩衝剤、張性調整剤、pH調整剤、粘性調節剤、界面活性剤、及び共溶媒(例えば、エタノール)などの賦形剤を含むことができる。懸濁液及びエアロゾル製剤(加圧式又は非加圧式を問わない)は、通常、微細に分割された形態の、例えば、0.5〜10μm、例えば、約1〜5μmのD50を有する、本発明の化合物を含む。粒径分布は、D10、D50、及びD90値を用いて表すことができる。粒径分布のD50中央値は、分布を二分するミクロン単位の粒径と定義される。レーザー回折から得られる測定は、体積分布と記載される方が正確であり、したがって、この手順を用いて得られるD50値は、Dv50値(体積分布の中央値)と呼ばれる方が意味が通る。本明細書で使用されるように、Dv値は、レーザー回折を用いて測定される粒径分布を指す。同様に、レーザー回折との関連で使用されるD10及びD90値は、Dv10及びDv90値を意味するものと理解され、それぞれ、分布の10％がD10値よりも下に位置し、分布の90％がD90値よりも下に位置する粒径を指す。
本発明の具体的な一態様によれば、水性媒体に懸濁した微粒子形態の本発明の化合物を含む医薬組成物が提供される。水性媒体は、通常、水並びに緩衝剤、張性調整剤、pH調整剤、粘性調節剤、及び界面活性剤から選択される1以上の賦形剤を含む。
鼻又は肺への局所投与は、エアロゾル製剤の使用によって達成することもできる。エアロゾル製剤は、通常、好適なエアロゾル噴射剤、例えば、クロロフルオロカーボン(CFC)又はハイドロフルオロカーボン(HFC)に懸濁又は溶解した活性成分を含む。好適なCFC噴射剤としては、トリクロロモノフルオロメタン(噴射剤11)、ジクロロテトラフルオロメタン(噴射剤114)、及びジクロロジフルオロメタン(噴射剤12)が挙げられる。好適なHFC噴射剤としては、テトラフルオロエタン(HFC-134a)及びヘプタフルオロプロパン(HFC-227)が挙げられる。噴射剤は、通常、全吸入組成物の40重量％〜99.5重量％、例えば、40重量％〜90重量％を含む。該製剤は、共溶媒(例えば、エタノール)及び界面活性剤(例えば、レシチン、トリオレイン酸ソルビタンなど)を含む、賦形剤を含むことができる。他の可能な賦形剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセリンなどが挙げられる。エアロゾル製剤はキャニスターに包装され、好適な用量は(例えば、Bespak、Valois、又は3Mによるか、或いはAptar、Coster、又はVariによって供給されるような)定量バルブによって送達される。
肺への局所投与は、乾燥粉末製剤の使用によって達成することもできる。乾燥粉末製剤は、微細に分割された形態の、通常、1〜10μmのMMD又は0.5〜10μm、例えば、約1〜5μmのD50を有する、本開示の化合物を含む。微細に分割された形態の本発明の化合物の粉末は、微粒子化プロセス又は同様のサイズ低下プロセスによって調製することができる。微粒子化は、ジェットミル、例えば、Hosokawa Alpineによって製造されているものを用いて実施することができる。得られる粒径分布は、(例えば、Malvern Mastersizer 2000S機器による)レーザー回折を用いて測定することができる。該製剤は、通常、局所で許容される希釈剤、例えば、通常、比較的大きい粒径、例えば、50μm以上、例えば、100μm以上のMMD又は40〜150μmのD50の、ラクトース、グルコース、又はマンニトール(好ましくは、ラクトース)を含む。本明細書で使用されるように、「ラクトース」という用語は、α-ラクトース一水和物、β-ラクトース一水和物、α-ラクトース無水物、β-ラクトース無水物、及び非晶質ラクトースを含む、ラクトース含有成分を指す。ラクトース成分は、微粒子化、篩別、ミリング、圧縮、凝集、又はスプレー乾燥によって処理することができる。様々な形態の市販型のラクトースも包含され、これには、例えば、Lactohale(登録商標)(吸入等級ラクトース; DFE Pharma)、InhaLac(登録商標)70(乾燥粉末吸入器用の篩別ラクトース; Meggle)、Pharmatose(登録商標)(DFE Pharma)、及びRespitose(登録商標)(篩別吸入等級ラクトース; DFE Pharma)製品がある。一実施態様において、該ラクトース成分は、α-ラクトース一水和物、α-ラクトース無水物、及び非晶質ラクトースからなる群から選択される。好ましくは、該ラクトースはα-ラクトース一水和物である。
乾燥粉末製剤は、他の賦形剤、例えば、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、又はステアリン酸マグネシウムも含み得る。
乾燥粉末製剤は、通常、乾燥粉末吸入器(DPI)装置を用いて送達される。例となる乾燥粉末送達系としては、SPINHALER、DISKHALER、TURBOHALER、DISKUS、SKYEHALER、ACCUHALER、及びCLICKHALERが挙げられる。乾燥粉末送達系のさらなる例としては、ECLIPSE、NEXT、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、MONODOSE、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、PRESSAIR、ELLIPTA、ORIEL乾燥粉末吸入器、MICRODOSE、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR、及びPROHALERが挙げられる。
本発明の化合物は、RSV感染の治療において及びRSV感染と関連する疾患の予防又は治療のために有用である。
本発明の一態様において、RSV感染の治療ための及びRSV感染と関連する疾患の予防又は治療のための薬剤の製造のための本発明の化合物の使用が提供される。
本発明の別の態様において、RSVに感染した対象の治療方法であって、該対象に、本発明の化合物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。
本発明の別の態様において、対象におけるRSV感染と関連する疾患の予防又は治療方法であって、該対象に、本発明の化合物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。
本発明の化合物は、感染前のその投与により、予防的状況で使用することができる。
一実施態様において、RSV感染は、RSV A株感染(例えば、RSV A2株によるもの)である。別の実施態様において、RSV感染は、RSV B株感染(例えば、RSV Bワシントン株によるもの)である。
対象には、ヒト及び動物対象、とりわけ、ヒト対象が含まれる。
本発明の化合物は、とりわけ、RSV感染の治療に及びリスクのある対象におけるRSV感染と関連する疾患の予防又は治療に有用である。リスクのある対象には、早産児、肺又は心臓の先天性欠陥を有する子供、免疫不全対象(例えば、HIV感染に罹患している対象)、高齢対象、及び心臓又は肺に影響を及ぼす慢性的な健康障害(例えば、鬱血性心不全又は慢性閉塞性肺疾患)に罹患している対象が含まれる。
本発明の化合物は、第2の又はさらなる活性成分と組み合わせて投与することができる。本発明の化合物は、第2のもしくはさらなる活性成分と共製剤化することができ、又は第2の又はさらなる活性成分は、同じもしくは異なる経路で別々に投与されるように製剤化することができる。本発明の一態様によれば、(a)本発明の化合物を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物;(b)第2の活性成分を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物;(c)任意に、各々第3の又はさらなる活性成分を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、1以上のさらなる医薬組成物;及び(d)それを必要とする対象への該医薬組成物の投与のための指示書を含むパーツのキットが提供される。それを必要とする対象は、RSV感染に罹患するか又はRSV感染に罹患しやすい可能性がある。
第2の又はさらなる活性成分には、RSV感染又はRSV感染と関連する疾患又はRSV感染と併存する疾病の治療又は予防に好適な活性成分が含まれる。
第2の又はさらなる活性成分は、例えば、Fタンパク質阻害剤(抗Fタンパク質抗体、例えば、パリビズマブを含む)、RNAポリメラーゼ阻害剤、及びリバビリンを含む抗ウイルス剤(例えば、他の抗RSV剤)、並びに抗炎症剤から選択することができる。
本発明の化合物は、好適な間隔で、例えば、1日に1回、1日に2回、1日に3回、又は1日に4回、投与することができる。
平均体重(50〜70kg)のヒトに対する好適な投与量は、約50μg〜10mg/日、例えば、500μg〜5mg/日であると考えられるが、投与されるべき正確な用量は、当業者により決定されることができる。
本発明の化合物は、以下の有利な属性のうちの1つ又は複数を有すると考えられる:
RSV A株、例えば、A2株によって引き起こされるヒト(又は動物モデル又はインビトロ系)での細胞変性効果及び/又はウイルス複製及び/又はF-タンパク質発現の強力な阻害;
RSV B株によって引き起こされるヒト(又は動物モデル又はインビトロ系)での細胞変性効果及び/又はウイルス複製及び/又はF-タンパク質発現の強力な阻害;
好ましくは、1日1回の投与と合致する、肺での長い作用持続時間;並びに
とりわけ、肺又は鼻への局所投与後の、許容される安全性プロファイル。
(実験の節)
本明細書で使用される略語を以下に定義する(表1)。定義されていない略語はいずれも、その一般的に認められている意味を伝えることが意図される。
表1:略語
Figure 0006675407
Figure 0006675407
(一般的手順)
出発材料及び溶媒は全て、商業的供給源から得られたか、又は文献引用に従って調製されたかのいずれかであった。別途明記されない限り、反応液は全て撹拌した。有機溶液は、ルーチンに無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。水素化は、記載された条件下にて、Thales H-cubeフロー反応器で実施した。
カラムクロマトグラフィーは、示された量を用いて、プレパックシリカ(230〜400メッシュ、40〜63μm)カートリッジで実施した。SCXは、Supelcoから購入し、使用前に、1M塩酸で処理した。別途明記されない限り、精製されることになる反応混合物をMeOHでまず希釈し、数滴のAcOHで酸性にした。この溶液をそのままSCXに充填し、MeOHで洗浄した。その後、所望の材料を、MeOH中の0.7M NH3で洗浄することにより溶出させた。
(分取逆相高速液体クロマトグラフィー:)
Waters X-Select CSHカラムC18、5μm(19×50mm)、流量28mL 分-1、0.1％v/vギ酸を含むH2O-MeCN勾配で6.5分かけて溶出させ、254nmでのUV検出を使用する。勾配情報:0.0〜0.2分、35％MeCN;0.2〜5.5分、35％MeCNから65％MeCNに上昇させる;5.5〜5.6分、65％MeCNから95％MeCNに上昇させる; 5.6〜6.5分、95％MeCNで保持する。
(分析法及び質量分光法)
(LCMS分析の逆相HPLC条件:)
Waters Xselect CSH C18 XPカラム、2.5μm(4.6×30mm)、40℃;流量2.5〜4.5mL 分-1、0.1％v/vギ酸を含むH2O-MeCN勾配で4分かけて溶出させ、254nmでのUV検出を利用する。勾配情報: 0〜3.00分、95％H2O-5％MeCNから5％H2O-95％MeCNに上昇させる; 3.00〜3.01分、5％H2O-95％MeCNで保持し、流量を4.5mL 分-1に増大させる; 3.01〜3.50分、5％H2O-95％MeCNで保持する; 3.50〜3.60分、95％H2O-5％MeCNに戻し、流量を3.50mL 分-1に減少させる; 3.60〜3.90分、95％H2O-5％MeCNで保持する; 3.90〜4.00分、95％H2O-5％MeCNで保持し、流量を2.5mL 分-1に減少させる。
(1H NMR分光法:)
スペクトルは、残存する非重水素化溶媒を参照として用いて、400MHzで、Bruker Avance IIIスペクトロメーターで獲得し、別途指定されない限り、DMSO-d6中で泳動させた。
(化合物(I)の合成方法)
本発明の化合物を調製するために使用されている非限定的な合成戦略が以下にまとめられている(スキーム1)。開示されている化合物(I)への経路は全て、市販の出発材料から3工程で容易に入手できるアゼピン誘導体の中間体(VIIIa)から生じる。主な変化は、合成変換を該鍵中間体(VIIIa)に適用し、それにより、化合物(I)への3つの異なる前駆体:すなわち、中間体(II)、(III)、及び(IV)を生成させる順序から生じる。経路1は、チオフェンカルボン酸(II)と2-フルオロ-6-メチルアニリンのアミドカップリングを含む。代わりの調製方法である経路2は、スピロ環式アミン: 7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナンを用いたSNAr置換反応による2-クロロニコチンアミド中間体(III)からの化合物(I)の形成を利用する。この手順は、化合物(I)を、0.5kgを超える単一バッチで提供するためにスケールアップされたものであり、この合成作戦も本明細書で以下に記載されている。化合物(I)への第3のアプローチは、アニリン(IV)と予め形成された2-アミノニコチン酸(VI)との間のアミドカップリング反応からなる経路3である。
スキーム1:化合物(I)の調製に使用される合成経路
Figure 0006675407
スキーム1の一般基LG及びLG1は、得られる化合物が反応性求電子試薬に変換されるような脱離基を表す。好適な脱離基の例としては、ハロゲン原子、例えば、Cl及びBrが挙げられ、この場合、その形成のための試薬を容易に入手及び使用することができるため、Clが通常好ましい。当業者は、この関連で使用される一般的な脱離基のさらなる例に、メシレート、トシレート、又はトリフレート[p-トリフルオメチルスルホネート(p-trifluomethylsulfonate)])が含まれることを理解しているであろう。アミドの調製方法の総説は:「アミド結合形成及びペプチドカップリング(Amide bond formation and peptide coupling)」、Montalbetti, C.A.G.N.及びFalque, V.の文献、Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852で取り上げられている。今回のケースでは、アルキル基Raはエチルであり、より一般的には、低級アルキル、例えば、C1-6アルキル又はC1-4アルキルである。
(エチル 2-クロロ-5-メチルニコチネート)
Figure 0006675407
 2-クロロ-5-メチルニコチン酸(3.90g、22.7mmol)のDCM(100mL)溶液に、塩化オキサリル(9.95mL、114mmol)、次いで、1滴のDMFを添加した。得られた混合物をRTで30分間撹拌し、真空中で蒸発させた。このようにして得られた残渣をEtOH(66mL)中に取り、さらに2時間撹拌し、その後、真空中で蒸発させた。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、120g、イソヘキサン中0〜50％DCM、勾配溶出)により精製すると、表題化合物が無色の油状物(3.71g、82％収率)として得られた;
Figure 0006675407
 [Yamamoto S.らの文献、Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 422-434も参照されたい。]
(エチル 5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチネート)
Figure 0006675407
 NMP(50mL)中のエチル 2-クロロ-5-メチルニコチネート(3.70g、18.5mmol)、7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナンヘミオキサレート(9.57g、55.6mmol)、及びDIPEA(19.4mL、111mmol)の混合物を150℃で2時間加熱した。RTに冷却した後、粗混合物を水(200mL)に注ぎ入れ、EtOAc(3×200mL)で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン(2×100mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させると、表題化合物(4.81g、88％収率)が得られた; Rt 1.32分; m/z 291(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチン酸:中間体(VI))
Figure 0006675407
 THF:水(4:1、50mL)中のエチル 5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチネート(4.1g、14mmol)及び水酸化リチウム(0.50g、21mmol)の混合物を50℃で18時間加熱し、その後、真空中で蒸発させた。このようにして得られた残渣を1M塩酸の添加によりpH 4に酸性化し、得られた混合物をEtOAc(10×250mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を真空中で蒸発させると、表題化合物が結晶性固体(3.4g、92％収率)として得られた; Rt 0.42分; m/z 263(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(1-(4-ニトロベンゾイル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ベンゾ[b]アゼピン-5-オン)
Figure 0006675407
 RTの1,2,3,4-テトラヒドロ-ベンゾ[b]アゼピン-5-オン(25.0g、155mmol)のピリジン(124mL)溶液に、4-ニトロベンゾイルクロリド(57.6g、310mmol)のMeCN(124mL)溶液を滴加した。得られた混合物をRTで16時間撹拌し、その後、水(50mL)で慎重にクエンチし、EtOAc(100mL)で抽出した。有機抽出物を、飽和水性NaHCO3(100mL)、飽和水性NH4Cl(2×100mL)、水(100mL)、ブライン(100mL)、最後に、1M塩酸(2×100mL)で順次洗浄し、乾燥させ、揮発性物質を真空中で蒸発させた。このようにして得られた粗固体をMeOH(300mL)でスラリー化させ、濾過により回収し、乾燥させると、表題化合物が薄黄色の固体(44.8g、HPLCによると93％純粋、93％収率)として得られた; Rt 1.92分; m/z 311(M+H)+(ES+)。この材料を、それ以上精製することなく、後の工程で使用した。
(5-クロロ-1-(4-ニトロベンゾイル)-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[b]アゼピン-4-カルバルデヒド)
Figure 0006675407
 0℃のニートのDMF(236mL)に、三塩化ホスホリル(15.8mL、170mmol)を滴加し、得られた混合物を、内部温度を0〜5℃に維持しながら、1-(4-ニトロベンゾイル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ベンゾ[b]アゼピン-5-オン(44.8g、141mmol)のDMF(141mL)溶液で処理した[後者は、固体の完全溶解が生じるまで懸濁液を90℃で加熱することにより得られ、この溶液はまだ熱いうちに添加された]。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、その後、RTに30分間到達させておき、その後、80℃で72時間加熱した。得られた混合物をRTに冷却し、EtOAc(500mL)と飽和水性NaOAc(500mL)に分配した。水層を分離し、EtOAc(2×500mL)で洗浄した。合わせた有機抽出物をブライン(8×300mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させると、褐色の固体が得られた。このようにして得られた粗生成物をMeOH(300mL)でスラリー化させ、濾過により回収し、乾燥させると、表題化合物が黄色の固体(25.8g、HPLCによると88％純粋、51％収率)として得られた; Rt 2.28分; m/z 357(M+H)+(ES+)。この材料を、それ以上精製することなく、後の工程で使用した。
(エチル 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート:中間体(VIIIa))
Figure 0006675407
 RTの5-クロロ-1-(4-ニトロベンゾイル)-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[b]アゼピン-4-カルバルデヒド(36.6g、89.0mmol)のピリジン(260mL)溶液に、エチル 2-メルカプトアセテート(18.6mL、170mmol)、次いで、トリエチルアミン(81.0mL)を添加した。反応混合物を70℃で1時間、及び118℃で2時間加熱し、その後、RTに冷却した。形成された白色の沈殿物を濾過により除去し、濾液を真空中で濃縮した。得られた残渣をDCM(100mL)中に取り、水(100mL)で、その後、1M塩酸(70mL)で洗浄した。有機抽出物を乾燥させ、真空中で蒸発させた。このようにして得られた粗固体をMeOH(150mL)でスラリー化させ、濾過により回収し、乾燥させると、表題化合物が黄色の固体(34.2g、84％収率)として得られた; Rt 2.65分; m/z 423(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボン酸:中間体(VII))
Figure 0006675407
 THF:MeOH(1:1、36mL)の混合物中のエチル 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(1.50g、3.55mmol)の溶液に、2M水性NaOH(9.0mL)を添加し、混合物を50℃で2時間加熱した。RTに冷却した後、混合物をEtOAc(200mL)と水(200mL)に分配した。水層を分離し、1M塩酸の添加によりpH 3に酸性化し、その後、EtOAc(2×150mL)で抽出した。揮発性物質を真空中で除去すると、表題化合物が黄色の固体(1.44g、99％収率)として得られた; Rt 2.24分; m/z 395(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(エチル 6-(4-アミノベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート:中間体(IXa))
(触媒還元法)
Figure 0006675407
 THF:EtOH(1:1、100mL)と1M塩酸(2.00mL)の混合物中のエチル 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(1.00g、2.37mmol)の溶液をThales H-cube(1.0mL.分-1、25℃、55mm 10％Pd/C Cat-Cart、完全水素モード)に通した。揮発性物質を真空中で除去すると、表題化合物(0.98g、〜100％収率)が得られた; Rt 2.28分; m/z 393(M+H)+(ES+)。この材料を、それ以上精製することなく、後の工程で使用した。
(溶解金属還元法)
鉄粉(5.29g、94.7mmol)及びエチル 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(8.00g、18.9mmol)のIPA(80mL)懸濁液に、飽和水性塩化アンモニウム(8.0mL)を添加した。得られた混合物を80℃で1時間撹拌し、その後、セライトに通して濾過した。セライトパッドをMeOH(1.5L)で洗浄し、合わせた濾液を真空中で蒸発させた。得られた残渣を水(400mL)及びジエチルエーテル(400mL)でトリチュレーションし、真空中で乾燥させると、表題化合物が黄色の固体(5.89g、HPLCによると88％純粋、70％収率)として得られた; Rt 2.21分; m/z 393(M+H)+(ES+)。この材料を、それ以上精製することなく、後の工程で使用した。
(エチル 6-(4-(2-クロロ-5-メチルニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート:中間体(Xa))
Figure 0006675407
 2-クロロ-5-メチルニコチン酸(2.49g、14.5mmol)のDCM(50mL)懸濁液に、塩化オキサリル(4.24mL、48.4mmol)及び1滴のDMFを添加した。得られた混合物をRTで1時間撹拌し、その後、真空中で蒸発させた。残渣をDCM(25mL)中に取り、RTのエチル 6-(4-アミノベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(3.80g、9.68mmol)のピリジン(20mL)溶液に添加した。反応混合物をRTで1時間維持し、その後、水(100mL)の添加によりクエンチし、EtOAc(100mL)で抽出した。水層を分離し、EtOAc(2×100mL)で洗浄した。合わせた有機抽出物を水(100mL)で洗浄し、真空中で蒸発させ、得られた固体を水(200mL)でトリチュレーションした。このシーケンスを同じスケールで繰り返すと、表題化合物が淡黄色の固体(10.0g、HPLCによると89％純粋、95％収率)として得られた; Rt 2.51分; m/z 545/547(M+H)+(ES+)。この材料を、それ以上精製することなく、後の工程で使用した。
(N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド)
Figure 0006675407
 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボン酸(10.0g、25.4mmol)のDCM(250mL)懸濁液に、塩化オキサリル(11.1mL、127mmol)、次いで、1滴のDMFを添加した。得られた混合物をRTで1時間撹拌し、その後、真空中で蒸発させた。このようにして得られた残渣をDCM(100mL)中に取り、この溶液に、2-フルオロ-6-メチルアニリン(6.35g、50.7mmol)のピリジン(100mL)溶液を添加した。混合物をRTで1時間撹拌し、その後、真空中で蒸発させた。残渣をEtOAc(500mL)中に取り、溶液を、1M塩酸(2×100mL)、次いで、飽和水性NaHCO3(100mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させた。この同じ手順を、追加の6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボン酸(12.0g、30.4mmol)を用いて3回繰り返すと、表題化合物が淡黄色の固体(51.1g、HPLCによると93％純粋、87％収率)として得られた; Rt 2.46分; m/z 502(M+H)+(ES+)。この材料を、それ以上精製することなく、後の工程で使用した。
(エチル 6-(4-(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート:)
(方法1: 2-アミノニコチン酸(VI)を用いたアニリン(IXa)のアシル化)
Figure 0006675407
 5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチン酸(2.21g、8.41mmol)のDCM(50mL)懸濁液に、塩化オキサリル(0.80mL、9.17mmol)、次いで、1滴のDMFを添加した。得られた混合物をRTで1時間撹拌し、その後、もう1回分の塩化オキサリル(0.80mL、9.17mmol)及びDMF(1滴)を添加した。さらに30分後、混合物を真空中で蒸発させ、このようにして得られた残渣をDCM(50mL)中に取り、エチル 6-(4-アミノベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(3.00g、7.64mmol)のピリジン(20mL)溶液に添加した。得られた混合物をRTで1時間撹拌し、その後、水(100mL)で希釈し、相分離器に通した。有機相を真空中で蒸発させ、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、80g、イソヘキサン中0〜100％EtOAc、勾配溶出)により精製した。単離された淡いオレンジ色の残渣をアセトニトリル(2×20mL)でトリチュレーションし、形成された固体を濾過により回収し、乾燥させると、表題化合物が白色の固体(2.78g、HPLCによると94％純粋、57％収率)として得られた; Rt 1.95分; m/z 637(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(方法2: 7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナンを用いた2-ハロニコチンアミド(Xa)の置換)
Figure 0006675407
 NMP(23mL)及びEt3N(7.61mL、54.6mmol)中のエチル 6-(4-(2-クロロ-5-メチルニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(4.97g、9.10mmol)及び7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナンヘミオキサレート(5.93g、27.3mmol)の懸濁液を150℃で7.5時間加熱し、その後、RTに冷却し、60時間静置しておいた。水(400mL)を添加し、得られた沈殿物を濾過により回収した。このようにして得られた固体をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、120g、DCM中0〜30％THF、勾配溶出)により精製すると、表題化合物が淡黄色の固体(3.72g、64％収率)として得られた; Rt 1.94分; m/z 637(M+H)+(ES+)。
(6-(4-(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボン酸:中間体(II))
Figure 0006675407
 THF:MeOH(1:1、40mL)の混合物中のエチル 6-(4-(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(3.72g、5.84mmol)の溶液に、水酸化リチウム(700mg、29.2mmol)の水(40mL)溶液を添加した。反応混合物を50℃に1時間加熱し、その後、RTに冷却した。揮発性物質を真空中で除去し、残りの水性溶液を水で希釈し、得られた沈殿物が溶解するまで超音波処理した。この混合物を1M塩酸の添加により中性化し、得られた固体を濾過により回収し、真空中で乾燥させると、表題化合物がオフホワイト色の固体(3.27g、92％収率)として得られた; Rt 1.64分; m/z 609(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(6-(4-(2-クロロ-5-メチルニコチンアミド)ベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド:中間体(IIIa))
Figure 0006675407
 2-クロロニコチノイルクロリド(1.21g、3.36mmol)のDCM(10mL)溶液を6-(4-アミノベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(2.00g、4.24mmol)のピリジン(10mL)撹拌溶液に添加した。反応混合物をRTで1時間撹拌し、その後、水(100mL)に注ぎ入れ、EtOAc(2×50mL)中に抽出した。合わせた有機物を真空中で蒸発させて、得られた固体をEtOAc(50mL)中でスラリー化させ、濾過により回収した。上記の手順を、5.0g、15.0g、最後に18.0gのアニリン出発材料を用いて、徐々にスケールを大きくして、3回繰り返した。4つ全てのバッチをDCM(300mL)に溶解させることにより、それらを合わせた。溶媒を真空中で蒸発させると、表題化合物が白色の固体(40.3g、75％収率)として得られた; Rt 2.39分; m/z 625(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(6-(4-アミノベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド:中間体(IV))
Figure 0006675407
 (方法1:溶解金属還元)
N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(5.00g、9.97mmol)のEtOH(100mL)溶液に、塩化アンモニウム(5.33g、100mmol)、水(20mL)、その後、鉄粉(2.78g、49.8mmol)を添加した。得られた混合物を還流状態で1時間撹拌し、その後、セライトに通して濾過した。このセライトパッドをEtOH(50mL)で洗浄し、合わせた濾液を真空中で蒸発させた。得られた残渣をEtOAc(200mL)中に取り、水(2×100mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させた。この手順を、追加のN-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(15.0g、29.9mmol)を用いて3回繰り返し、得られた固体を合わせ、Et2O(200mL)でトリチュレーションすると、表題化合物が淡黄色の固体(41.1g、87％収率)として得られた; Rt 2.12分; m/z 472(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(方法2:接触水素化)
N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4Hベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(100mg、0.199mmol)のTHF(4.0mL)溶液に、5％Pd/Cペースト(58wt％水、21.0mg、0.100mmol)を添加し、混合物を5バールの水素下で18時間撹拌した。反応終了時に、混合物をAgilent 0.45μmシリンジフィルターに通し、濾液を真空中で蒸発させると、表題化合物(91.0mg、97％収率)が得られた; Rt 2.13分; m/z 472(M+H)+(ES+)。
(N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド:化合物(I)の調製)
(経路1: チオフェンカルボン酸(II)と2-フルオロ-6-メチルアニリンのアミドカップリング)
Figure 0006675407
 6-(4-(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボン酸(400mg、0.657mmol)のDCM(40mL)溶液に、1-クロロ-N,N,2-トリメチルプロパ-1-エン-1-アミン(174μL、1.31mmol)を添加した。反応液をRTで1.5時間撹拌し、その後、真空中で濃縮した。残渣をDCM(40mL)中に取り、この溶液のアリコート(5.0mL、0.080mmol)を2-フルオロ-6-メチルアニリン(100mg、0.797mmol)に添加し、反応混合物をRTで3日間撹拌した。揮発性物質を真空中で蒸発させ、得られた残渣を分取HPLCにより精製すると、化合物(I)がオフホワイト色の固体(14mg、23％収率)として得られた; Rt 1.85分; m/z 716(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(経路2: 7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナンを用いたクロロニコチンアミド(III)のSNAr置換)
Figure 0006675407
 6-(4-(2-クロロ-5-メチルニコチンアミド)ベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(10.0g、16.0mmol)及び7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナンヘミオキサレート(10.4g、48.0mmol)のNMP(125mL)溶液に、トリエチルアミン(13mL、96mmol)を添加し、反応混合物を145℃で7時間加熱した。RTに冷却した後、混合物を水(800mL)に注ぎ入れ、得られた固体を濾過により回収し、水(2×100mL)で洗浄し、その後、DCM(400mL)中に取った。溶液を水(100mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させた。固体残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、220g、ジエチルエーテル中20〜100％EtOAc、勾配溶出)により精製すると、表題化合物が白色の固体として得られた。この手順を、追加の5g及び10gバッチのクロロニコチンアミド出発材料に対して繰り返した。これら3つの生成物バッチをEtOAc(500mL)への溶解及び真空中での溶媒の蒸発により合わせた。得られた固体をジエチルエーテル(200mL)でトリチュレーションし、固体を濾過により回収し、乾燥させると、表題化合物の化合物(I)が白色の固体(24g、82％収率)として得られた; Rt 1.88分; m/z 716(M+H)+(ES+)。
(経路3:アニリン(IV)と2-アミノニコチン酸(VI)のアミドカップリング)
Figure 0006675407
 5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチン酸(83mg、0.32mmol)のDCM(5.0mL)溶液に、1-クロロ-N,N,2-トリメチルプロパ-1-エン-1-アミン(37μL、0.28mmol)を添加した。混合物をRTで15分間撹拌し、その後、6-(4-アミノベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(100mg、0.21mmol)のピリジン(5.0mL)溶液に添加した。反応混合物をさらに1時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣を水(20mL)でトリチュレーションし、得られた黄褐色の固体を濾過により回収し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、12g、DCM中0〜10％MeOH、勾配溶出)により精製すると、化合物(I)が白色の固体(55mg、36％収率)として得られた; Rt 1.88分; m/z 716(M+H)+(ES+)。
(経路2による化合物(I)の調製のスケールアップ)
経路2について上で記載された合成法を利用して、本発明の化合物を＞0.5kgのスケールで調製するのに成功した。この作戦に関する分析法及び分光法を以下に記載する。
(分析法及び分光法)
(LCMS分析のための逆相HPLC条件:)
CORTECS C18+ 4.6×150mmカラム; 2.7μm(例えば、Waters #186007408)、40℃;流量1.0mL.分-1、0.1％ギ酸を含む精製H2O-MeCN勾配で25分かけて溶出させ、310nmでのUV検出を利用する。注入容量5μL。勾配情報: 0〜15分、95％H2O-5％MeCNから5％H2O-95％MeCNに上昇させる; 15〜25分、5％H2O-95％MeCNで保持する。
(1H NMR分光法:)
スペクトルは、JOEL ECX 400 MHzスペクトロメーターを用いて獲得した。残存する非重水素化溶媒を参照として用い、サンプルをDMSO-d6中で測定した。
(1-(4-ニトロベンゾイル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ベンゾ[b]アゼピン-5-オン)
Figure 0006675407
 1,2,3,4-テトラヒドロベンズアゼピン-5-オン(2670g、16.6mol)のDCM(23.2L)溶液に、K2CO3の30％w/v水性溶液(15.2L)を添加した。4-ニトロベンゾイルクロリド(3105g、16.7mol)を、＜25℃の内部温度を維持しながら、15分かけて少しずつ添加した。反応液を18〜25℃で18時間撹拌すると、その時点で、TLC(ヘプタン中、50％v/v酢酸エチル)により、反応が終了していないことが示された。追加の4-ニトロベンゾイルクロリド(167g、0.9mol)を添加し、反応液をさらに1.5時間撹拌し、その後、TLCにより、反応が終了していることが示された。相を分離し、有機物を2M NaOH(10L)の溶液に添加し、2時間撹拌した。相を分離し、有機物を水(2×5L)で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、濾過した。パッドをDCM(4L)で洗浄し、合わせた有機物を真空中で蒸発させた。得られた固体を、真空中、45℃で24時間で乾燥させると、表題化合物が薄いベージュ色の固体(4998g、97％活性収率; HPLC純度96.2％、NMR純度＞95％)として得られた; Rt 10.09分; m/z 311.1(M+H)+(ES+)。
(5-クロロ-1-(4-ニトロベンゾイル)-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[b]アゼピン-4-カルバルデヒド)
Figure 0006675407
 DMF(10.0L)を仕込んだ50L容器を0℃に冷却し、内部温度を5℃未満に維持しながら、塩化ホスホリル(1802mL、19.33mol)で1時間かけて滴下処理し(0〜5℃の発熱が観察された)、その後、0〜5℃で30分間撹拌した。その後、70℃での溶解によって調製された1-(4-ニトロベンゾイル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ベンゾ[b]アゼピン-5-オン(5000g、16.11mol)のDMF(10.0L)溶液を、(沈殿を避けるために)温めながら、バッチ温度を0〜10℃に維持しつつ、30分かけて、真空移動により、塩化ホスホリル/DMF溶液に添加した。添加し終わったら、反応液を、窒素下、0〜5℃で30分間、その後、80℃で18時間撹拌し、その時点で、HPLC分析により、出発材料の消費が終了していることが示された。反応混合物を40℃に冷却し、2等分し、その両方を同じ方法で次のように後処理した。第1の部分をそのもとの容量の約半分(〜7L)にまで真空中で濃縮し、その後、10℃に予め冷却された飽和水性NaOAc(34.0L)に2時間かけて添加した(20〜30℃の発熱が観察された)。20℃で15分間撹拌した後、混合物をDCM(27.2L)で抽出し、相を分離した。水層をDCM(27.2L)で逆抽出し、相を分離した。合わせた有機抽出物を水(2×40L)で洗浄し、その後、MgSO4(4.0kg)上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮した。同じ後処理手順を粗反応混合物の第2の部分に対して繰り返し、第1のものと合わせると、表題化合物が油状物(5119g、89％活性収率、HPLC純度87.6％、1H NMR純度95％)として得られた; Rt 11.74分; m/z 357.2(M+H)+(ES+)。
(エチル 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート)
Figure 0006675407
 窒素下、10℃の5-クロロ-1-(4-ニトロベンゾイル)-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[b]アゼピン-4-カルバルデヒド(3418g、9.580mol)のピリジン(15.83L、195.4mol)溶液に、内部温度を20℃未満に維持しながら、エチル-2-メルカプトアセテート(1118mL、10.24mol)を30分かけて滴加した(10〜15℃の発熱が観察された)。その後、得られた溶液を、内部温度を20℃未満に維持しながら、トリエチルアミン(7531.51mL、54.03mol)で30分かけて滴下処理した(発熱は観察されなかった)。反応混合物を20℃で1時間、その後、70℃で18時間撹拌した。この後、HPLC分析により、出発クロロエナールの消費が終了していることが明らかになり、反応液を18〜25℃に冷却させておいた。
混合物を(不溶性の塩を除去するために)濾過し、パッドをアセトン(1.0L)で洗浄した。合わせた濾液を真空中で濃縮して、揮発性物質を除去し、残渣をDCM(11964mL)中に取り、水(7623mL)で洗浄した。有機相を分離し、1M塩酸(7623mL)で洗浄し、その後、MgSO4上で乾燥させた。無機物を濾過により除去し、DCM(4.0L)で洗浄し、合わせた濾液を真空中で蒸発させると、油性残渣になった。
該残渣をエタノール(20500mL)中に取り、溶液を60℃で1時間撹拌し、その後、18〜25℃に冷却し、この温度で1時間撹拌した。得られた固体を濾過により回収し、エタノール(13.8L)で洗浄し、真空下、50℃で乾燥させると、表題化合物(2939g、73％活性収率、HPLC純度96.9％、1H NMR純度＞97％)が得られた; Rt 13.85分; m/z 423.2(M+H)+(ES+)。
(6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボン酸)
Figure 0006675407
 50L容器に、18〜25℃で、THFと水の1:1混合物(37.63L)及びエチル 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキシレート(3763.7g、8.90mol)を仕込んだ。得られた溶液に、内部温度を25℃未満に維持しながら、固形KOH(749.1g、13.35mol)を少しずつ添加した(20〜22℃の発熱が観察された)。反応液を50℃で18時間加熱すると、その時点で、HPLC分析により、出発材料の消費が終了していることが明らかになった。反応液を18〜25℃に冷却させておき、有機溶媒を真空中で除去した。残りの水性溶液を水(28.27L)で希釈し、その後、pH 1に達するまで、濃塩酸(1.25L)をこの溶液にゆっくりと添加した(適度なガス放出を伴って、5℃の発熱が観察された)。得られた薄褐色の懸濁液を濾過し、パッドを水(2×9.5L)で洗浄した。固体を、真空下、50℃のオーブンで乾燥させると、表題化合物(3185.5g、91％活性収率、HPLC純度98.0％、1H NMRアッセイ91.0％)が得られた; Rt 11.11分; m/z 395.2(M+H)+(ES+)。
(N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド)
Figure 0006675407
 6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボン酸(1714g、1560g活性材料、3.955mol)のDCM(15.6L)懸濁液を窒素雰囲気下に置き、DMF(6.2mL、79.1mmol)を混合物に添加した。その後、ガス発生を制御するために、塩化オキサリル(690mL、7.91mol)を40分かけてゆっくりと添加し(16.9〜18.3℃の発熱が観察された)、反応混合物を18〜25℃で一晩撹拌した。TLC分析(DCM中、8％メタノール)により、チオフェンカルボン酸出発材料の一部が残存していることが示され、追加の塩化オキサリル(300mL、3.44mol)を混合物に添加した。18〜25℃で3時間撹拌した後、反応が終了し、得られた混合物を真空中で濃縮すると、6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボニルクロリドが暗黄色の固体として得られた(1H NMRにより、15.4％DCM及び0.5％DMFの存在が示された)。
そのようにして得られた粗酸塩化物を窒素雰囲気下でDCM(7.8L)に懸濁させ、ピリジン(480mL、5.93mol)で処理した。その後、氷/水浴から冷却しながら、2-フルオロ-6-メチルアニリン(475mL、4.11mol)を15分かけてゆっくりと添加した(20.9〜35.2℃の発熱が生じた)。混合物が溶液を形成し、これを18〜25℃で一晩撹拌すると、その時点で、反応が終了していることが明らかになった(HPLC 250nm)。
得られた懸濁液を2等分し、その各々を水(7.8L)で希釈し、18〜25℃で1時間撹拌し、その後、固体を濾過により回収した。2つのフィルターケーキを、各々、水(1.8L)及びDCM(2×1.6L)で洗浄し、合わせた。固体を50℃のオーブンで乾燥させると、表題化合物がオフホワイト色の固体(1573g、79％活性収率、1H NMR純度＞95％、1.98％のDCM及び0.56％のピリジン.HClを含む)として得られた; Rt 12.76分; m/z 502.4(M+H)+(ES+)。
(6-(4-アミノベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド;中間体(IV))
Figure 0006675407
 窒素雰囲気下のDMF(240mL)及び2-MeTHF(640mL)の混合物中のN-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-ニトロベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(80g、0.160mol)の溶液に、20％Pd(OH)2/C触媒(8.0g)を添加し、混合物に水素をスパージし、55℃に加熱した。水素を3時間スパージした後、反応液を一晩水素雰囲気下に置き、その後、水素をさらに4時間スパージした。HPLC分析により、98.5％の生成物及び0.55％の反応中間体(何であるかは確認されなかったが、ニトロソ又はヒドロキシルアミン中間体と推定される)の存在が示された。
反応混合物を48℃に冷却し、セライトパッド(24g)に通した。セライトパッドをDMF(2×160mL)で洗浄し、これらの洗浄液が触媒を含むので、それらをインラインフィルターに通した。合わせた濾液を真空中で濃縮して、2-MeTHFの大部分を除去すると、DMF/生成物溶液が生じた。この混合物を、氷/水浴で冷却した水(1.6L)に、5分かけて添加すると(9.9〜17.6℃の発熱が観察された)、白色の懸濁液が生じ、これを18〜25℃で1時間撹拌した。固体を濾過により回収し、フィルターケーキを水(3×160mL)で洗浄し、その後、50℃のオーブンで乾燥させると、生成物が白色の固体(75.5g、HPLC純度98.2％、KFによると0.34％H2O、1H NMRによると6.56％DMF)として得られた。
そのようにして得られた固体を、DCM(400mL)中、18〜25℃で65分間スラリー化させ、濾過により回収し、フィルターケーキをDCM(2×160mL)で洗浄した。その後、この材料を50℃でオーブン乾燥させると、表題化合物が白色の固体(72.0g、65.9gの活性生成物、88％収率、HPLC純度98.75％; NMRによると、8.25％DCM及び0.19％DMFを含む)として得られた; Rt 11.01分; m/z 472.4(M+H)+(ES+)。
(6-(4-(2-クロロ-5-メチルニコチンアミド)ベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド;中間体(IIIa))
Figure 0006675407
 塩化オキサリル(133mL、1.58mol)、次いで、DMF(0.8mL、0.010mol)を、18〜25℃の2-クロロ-5-メチルニコチン酸(225.4g、1.313mol)のDCM(2254mL)懸濁液に添加し(少しの発熱及びガス発生が生じる)、反応液を20〜25℃で1時間撹拌した。(メタノールに入れてクエンチした)アリコートのHPLC分析により、＜1％の2-クロロ-5-メチルニコチン酸が残存していることが示された。溶媒を真空中で除去し、油性残渣をDCM(500mL)と共沸させると、残存する塩化オキサリルが除去された。
得られた油状物をDCM(413mL)中に取り、内部温度を＜40℃に維持しながら、ピリジン(283mL、3.502mol)及びDCM(28920mL)の混合物中の6-(4-アミノベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(412.9g、0.876mol)の懸濁液に10分かけて滴加した(最高温度は38℃に達した)。反応液を18〜25℃で1時間撹拌し、その後、HPLC(サンプルをメタノールに入れてクエンチした)により、反応が終了している(＜1％のアニリンs/mが残存している)ことが示された。
ヘプタン(3300mL)を18〜25℃で混合物に添加し、得られた懸濁液を15分間撹拌し、その後、固体を濾過により回収した。フィルターケーキをヘプタン(2×1650mL)で洗浄し、そのようにして得られた粗固体を、水(4130mL)中、90〜95℃で30分間スラリー化させ、その後、18〜25℃に冷却した。固体を濾過により回収し、水(2×826mL)で洗浄し、50℃の真空オーブンで乾燥させると、表題化合物が白色の固体(504.2g、92％活性収率、HPLC純度[230nm] 98.24％; 1H NMRによると0.3％ピリジンHCl及びKFによると0.4％.H2Oを含む)として得られた; Rt 12.19分; m/z 625.6(M+H)+(ES+)。
(N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-6-(4-(5-メチル-2-(7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナン-2-イル)ニコチンアミド)ベンゾイル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド:化合物(I))
Figure 0006675407
 6-(4-(2-クロロ-5-メチルニコチンアミド)ベンゾイル)-N-(2-フルオロ-6-メチルフェニル)-5,6-ジヒドロ-4H-ベンゾ[b]チエノ[2,3-d]アゼピン-2-カルボキサミド(563.9g、0.902mol)、7-オキサ-2-アザスピロ[3.5]ノナンヘミオキサレート(233.0g、1.353mol)、及び炭酸カリウム(374.0g、2.706mol)のNMP(2820mL)懸濁液を105〜115℃で18時間撹拌した(HPLC分析により、所望の生成物が97.7％形成され、クロロ-ニコチンアミドが0.02％残存していることが示された)。
反応液を18〜25℃に冷却し、＜45℃で撹拌しながら、水(8459mL)に添加した(少し発熱性のクエンチ)。18〜25℃で30分間撹拌した後、得られた固体を濾過により回収し、水(2×1128mL)で洗浄し、吸引乾燥させた。このようにして得られた粗生成物を、水(5640mL)中、90〜95℃で30分間再スラリー化させ、その後、18〜25℃に冷却し、濾過により回収し、水(2×1260mL)で洗浄し、50℃の真空オーブンで乾燥させると、白色の固体(632.0g)が得られた。
1H NMRスペクトルにより、1.7％NMPが存在することが示され、固体を、水(5640mL)中、90〜95℃で30分間再スラリー化させ、18〜25℃に冷却し、濾過し、水(2×1260mL)で洗浄し、吸引乾燥させた。50℃の真空オーブンでさらに乾燥させると、表題化合物が白色の固体(614.0g、95％、1H NMRによると0.75％NMP及びKFによると1.7％H2Oを含む)として得られた。Rt 9.48分; m/z 716.8(M+H)+(ES+);
Figure 0006675407
(生物学的試験:実験方法)
(HEp2細胞におけるRSV誘導性CPEの評価)
感染1日前に、HEp2細胞を、2mM L-グルタミン及び1mMピルビン酸ナトリウムを含む5％無血清DMEMに入れて、384ウェルプレート(カタログ番号353962, BD Falcon, Oxford, UK)に播種した(103個/ウェル/50μL)。RSV A2株(#0709161v, NCPV, Public Health England, Wiltshire)又はRSV Bワシントン株(VR-1580, ATCC, Manassas, VA 20108)ウイルス溶液を、2mM L-グルタミン及び1mMピルビン酸ナトリウムを含む無血清DMEM中で調製し、その後、1 MOIの最終ウイルス濃度を達成するように添加した(50μL/ウェル)。同時に、化合物(I)(0.5μL DMSO溶液)をウイルス溶液とともに100μLのHEp2細胞培養物に添加して、0.5％の最終DMSO溶液を提供した。プレートを、RSV A2株を用いる試験については5日間又はRSV B株を用いる試験については6日間、インキュベートし(37℃/5％CO2)、その後、レサズリンナトリウム塩(5μLの0.03％溶液; Sigma-Aldrich, Dorset, UK)を各ウェルに添加し、プレートをさらに6時間インキュベートした(37℃/5％CO2)。各ウェルの蛍光[545nm(励起)/590nm(放出)]を、マルチスキャナー(Clariostar: BMG, Buckinghamshire, UK)を用いて決定した。各ウェルについての阻害率を計算し、IC50、IC75、及びIC90値を、化合物(I)について作成された濃度-応答曲線から計算した。
(BEAS2B気管支上皮細胞におけるRSV Fタンパク質発現の評価)
RSVによる上皮細胞の感染の後に起こる初期事象は、細胞の表面でのRSV F-タンパク質の発現である。BEAS2B細胞(SV40-不死化ヒト気管支上皮細胞株)を96ウェルプレートで増殖させた。ひとたび70％コンフルエントを上回れば、細胞を、2％FBS(Life technologies, Paisley, UK)を含む清澄なRPMI-1640培地(Life technologies, Paisley, UK)中で、0.01のMOIで、RSV A2(#0709161v, NCPV, Public Health England, Wiltshire)に感染させ、3日間インキュベートした(37℃/5％CO2)。
上清を吸引し、細胞を4％ホルムアルデヒド(PBS溶液中、100μL)で20分間固定し、洗浄バッファー(200μL; 0.05％Tween-20を含むPBS)で3回洗浄し、ブロッキング溶液(100μL; PBS中の5％Marvelミルク)とともに1時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄バッファー(200μL)で洗浄し、抗RSV(2F7;マウスモノクローナル、ロット160290、カタログ番号ab43812、Abcam plc, Cambridge, UK) F-融合タンパク質抗体(50μL; 5％ミルク/PBS-tween中に1:1000希釈で調製した)とともに37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、細胞をHRPコンジュゲート抗マウスIgG抗体(50μL、PBS中の5％ミルク中に1:2000希釈で調製した;ロット00095437、カタログ番号P0447、Dako UK Ltd, Cambridgeshire, UK)とともに1時間インキュベートした。細胞を洗浄バッファーで2回及びPBSで1回洗浄した。その後、TMB基質(100μL;基質試薬パックロット320436、カタログ番号DY999、R&D Systems社、Abingdon, UK)を添加し、反応を水性硫酸(50μL; 2N)の添加により停止させた。得られたシグナルを、比色定量(OD: 450nm、参照波長を655nmとする)により、マイクロプレートリーダー(Multiskan FC(登録商標), ThermoFisher Scientific)で決定した。その後、細胞を洗浄し、1％クリスタルバイオレット溶液(50μL;ロットSLB4576、カタログ番号HT90132-1L、Sigma-Aldrich)を30分間適用した。PBS(200μL)で3回洗浄した後、1％SDS(100μL)を各ウェルに添加し、プレートを1時間軽く振盪させた後、595nmでの吸光度を読み取った。OD450-655をOD595読取値で割ることにより、測定されたOD450-655読取値を細胞数について補正した。各ウェルについての阻害率を計算し、化合物(I)について作成された濃度-応答曲線からIC50値を導き出した。
(細胞生存:レサズリンアッセイ)
実験1日前に、HEp2細胞を、FBS DMEM(5％、2mM L-グルタミン及び1mMピルビン酸ナトリウムを含む)に入れて、384ウェルプレート(103個/ウェル/50μL; BD Falcon Ref 353962)に播種した。無血清DMEM(50μL)を試験ウェルに添加し、一方、対照ウェルについては、培地を除去し、滅菌水(100μL)を添加した。化合物(I)(0.5μLのDMSO溶液)を添加して、0.5％の最終DMSO濃度を生じさせた。Hep2細胞を各試験化合物とともに5日間インキュベートし(5％FBS中、37℃/5％CO2)、その後、レサズリンストック溶液(5μL; 0.03％)を各ウェルに添加し、プレートをさらに6時間インキュベートした(37℃/5％CO2)。545nm(励起)及び590nm(放出)での各ウェルの蛍光を、マルチスキャナー(Clariostar: BMG Labtech)を用いて決定した。細胞生存の損失率を、各ウェルについて、ビヒクル(0.5％DMSO)処理と比べて計算した。
ビヒクルと比べた試験化合物処理と関連する細胞生存の明らかな増加はいずれも、結果的に、負のパーセンテージとして集計される。適切な場合、CC50値を、化合物(I)について作成された濃度-応答曲線から計算した。
(気液界面(ALI)培養気管支上皮細胞におけるウイルス力価の評価)
ALI培養ヒト気管支上皮細胞をEpithelix Sarl(Geneva, Switzerland)から調達し、頂端表面をPBSで週1回洗浄しながら、基本培地を3〜4日毎に交換することにより維持した。0日目に、各ウェルの頂端表面を滅菌PBS(300μL)で1回洗浄し、インサートを、新鮮なMucilAir培養培地(780μL; EP04MM)を含む新しい24ウェルプレートに移した。RSV A2(50μL; 0.01の最終MOIになるようにMucilAir培養培地に希釈した)を細胞に1時間添加した(37℃/5％CO2)。MOIの計算を標準化するために、各MucilAirインサートを1ウェル当たり2×105個の頂端向き細胞を含むと推定した。ウイルス接種原をピペットで除去し、インサートを滅菌PBS(300μL)で2回洗浄した。
滅菌PBS(300μL)を各ウェルの頂端表面に5分間添加することにより、サンプリングを実施した。その後、頂端サンプルを取り出し、PBS(100μL)に溶解した50％スクロースを含むチューブに移した後、-80℃で保存した。この回収手順を0日目から始めて毎日繰り返し、7日目に終えた。
ALI培養物の頂端に、「早期介入」プロトコルについては、0〜7日目に、又は「後期介入」プロトコルについては、3〜7日目に、化合物(I)を投与した。化合物(I)(0.5％DMSO/PBS中、50μL)を頂端表面に添加し、1時間インキュベートし(37℃/5％CO2)、その後、除去した。各ウェルが同じ回数の操作を受けることを確実にするために、ビヒクル処理(0.5％DMSO/PBS)を対応する頂端表面に対して実施した。5日目に、基本培地を各ウェルから除去し、ALI培養細胞にとっての必要な維持工程として、新鮮なMucilAir培養培地を補充した。
ウイルス力価をプラークアッセイにより定量した。HEp2細胞を24ウェルプレート(Corning)で48時間増殖させた後、これらが100％コンフルエンシーに達するまで、10％FBSを含むDMEM中で感染させた。回収したサンプルをRTで解凍し、10倍段階希釈液を無血清DMEM中で調製した。HEp2細胞由来の増殖培地を吸引し、300μLの段階希釈ウイルス収集物と交換し、37℃/5％CO2で4時間感染させておいた。感染性培地を吸引し、プラークアッセイオーバーレイ(500μL; MEM中1％メチルセルロース、2％FBS、1％Pen Strep、0.5μg/mLアムホテリシンB)と交換し、37℃/5％CO2で7日間放置した。細胞を氷冷メタノールで10分間固定し、0.05％PBS-tween中の5％粉乳(Marvel)(「ブロッキングバッファー」)で、RTで1時間ブロッキングした。抗RSV F-タンパク質抗体(2F7; Abcam: ab43812)をブロッキングバッファー中で1:100の濃度に希釈し、振盪させながら、細胞にRTで1時間添加した。細胞をPBSを用いて洗浄し、2次抗体(ブロッキングバッファーで1:400に希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗マウス2次抗体(Dako P044701-2))とともに、振盪させながらRTで1時間インキュベートした。2次抗体溶液を除去し、細胞をPBSで洗浄した後、金属増強発色基質DABを(製造元の指示に従って)超純水中で調製した。各ウェルに、プラークが見えるまで、300μLの発色基質(sigmaFAST D0426)を投与した。プラークを目視で計数し、光学顕微鏡法を用いて確認し、1mL当たりのプラーク形成単位の計算を可能にした。
(マウスにおけるRSV感染)
非絶食マウス(雄BALB/C、20〜30g)に、イソフルラン(O2中5％)麻酔下、RSV A2又はウイルス希釈液(DMEM、2％FBS、12.5％スクロース)を鼻腔内感染させた。A2株のRSV(50uLの1.3×106PFU/mL:最終0.65×105PFU/マウス)を、50μLの容量が送達されるまで、2つの鼻孔の間を交互に1滴ずつの形で、各鼻孔に注入した。感染後、各動物を毎日計量して、変化をモニタリングした。化合物(I)を100％DMSOに(20mg/mL及び/又は2mg/mLで)溶解させ、その後、等張生理食塩水に1:10で希釈して、全ての処理において10％DMSOを達成した。その後、製剤を超音波処理して、懸濁液を生じさせた。この懸濁液を、感染1日前及び感染1時間前(0日目)、その後、感染後1日目、2日目、及び3日目に、FMJ-250 PennCentury装置で気管内に(20μL)又はピペットで鼻腔内に(40μL)投与した。RSV攻撃から4日後、動物を(ペントバルビトン過剰用量の腹腔内注射によって)安楽死させ、気管にカニューレを挿入し、全細胞数及び細胞百分率数の計算のために、BALFを抽出した。BALF回収後、右肺を各動物から摘出し、2×20秒のバーストの間、(1％BSA及び25％スクロースを含む肺重量の10倍のDMEMを用いて)、氷冷したダルベッコの改変イーグル培地中でホモジナイズした。その後、ホモジネートを滅菌チューブに移し、4℃でスピンした(2000rpm; 5分間)。透明になったホモジネートを冷えたクライオバイアルに移し、瞬間凍結させ、-80℃で保存した。肺ホモジネートからの上清をプラークアッセイに使用した。
HEp2細胞を24ウェルプレート(Corning)で48時間増殖させた後、これらが100％コンフルエンシーに達するまで、10％FBSを含むDMEM中で感染させた。肺ホモジネートをRTで解凍し、10倍段階希釈液を無血清DMEM中で調製した。HEp2細胞由来の増殖培地を吸引し、300μLの段階希釈肺ホモジネートと交換し、感染させておいた(4時間; 37℃/5％CO2)。感染性培地を吸引し、プラークアッセイオーバーレイ(500μL; MEM中1％メチルセルロース、2％FBS、1％Pen Strep、0.5μg/mLアムホテリシンB)と交換し、7日間放置した(37℃/5％CO2)。細胞を氷冷メタノールで10分間固定し、0.05％PBS-tween中の5％粉乳(Marvel)(「ブロッキングバッファー」)で、RTで1時間ブロッキングした。
抗RSV F-タンパク質抗体(2F7; Abcam: ab43812)をブロッキングバッファー中で1:100の濃度に希釈し、振盪させながら、細胞にRTで1時間添加した。細胞をPBSを用いて洗浄し、2次抗体(ブロッキングバッファーで1:400に希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗マウス2次抗体(Dako P044701-2))とともに、振盪させながらRTで1時間インキュベートした。2次抗体溶液を除去し、細胞をPBSで洗浄した後、金属増強発色基質DABを(製造元の指示に従って)超純水中で調製した。各ウェルに、プラークが見えるまで、300μLの発色基質(sigmaFAST D0426)を投与した。プラークを目視で計数し、光学顕微鏡法を用いて確認し、肺ホモジネート上清1mL当たりのプラーク形成単位の計算を可能にした。
(コットンラットにおけるRSV感染)
6〜8週齢の雄のシグモドン・ヒスピズス(Sigmodon hispidus)コットンラットを、0.1mLの容量のスクロース安定化培地中のhRSV/A/Long(ATCC, Manassas, VA; 105pfu)に感染させた。化合物(I)を100％DMSOに(3.3、10、33、及び100mg/mLで)溶解させ、その後、等張生理食塩水に1:10で希釈して、全ての処理において10％DMSOを達成した。その後、製剤を超音波処理して、懸濁液を生じさせた。得られた懸濁液を、感染4時間前(0日目)、その後、感染後1日目、2日目、及び3日目に、ピペットにより鼻腔内投与した(50μL)。RSV攻撃から4日後、動物を安楽死させ、肺を摘出した。左葉をプラークアッセイによるウイルス力価測定に使用し、舌葉をRSV/A/Long NS-1 qRT-PCR及びサイトカインqRT-PCRに使用した。
肺ホモジネートの上清をイーグル(E)-MEMに1:10及び1:100希釈した。24ウェルプレート中のコンフルエントなHEp-2単層に、2連で、未希釈(ニート)のサンプルから始め、次に、希釈したホモジネートを感染させた(1ウェル当たり50μLのサンプル)。1時間のインキュベーションの後(37℃/5％CO2)、ウェルに0.75％メチルセルロース培地を重層し、プレートを37℃インキュベーターに戻した。(4日間の)インキュベーションの後、オーバーレイを除去し、細胞を0.1％クリスタルバイオレット染料で固定し(1時間)、その後、すすぎ、風乾させた。プラークを計数し、ウイルス力価を組織1グラム当たりのプラーク形成単位(pfu.g-1)として表した。
また、全RNAを、ホモジナイズした肺組織から抽出し(RNeasy精製キット; Qiagen)、サンプル(1μg)を用いて、QuantiTect逆転写キット(Qiagen)を用いて、cDNAを調製した。リアルタイムPCR反応(RSV NS-1及びRANTES遺伝子)のために、QuantiFast SYBR(登録商標) Green PCRキット(Qiagen)を、25μLの最終容量で、0.5μMの最終プライマー濃度で使用した。増幅を、Bio-Rad iCyclerで、95℃で3分間の1サイクル、次いで、95℃で10秒間、60℃で10秒間、及び72℃で15秒間の40サイクルにわたって実施した。ベースラインサイクル及びサイクル閾値(Ct)を、iQ5ソフトウェアにより、PCRベースライン減算曲線フィットモードで計算した。標準曲線を、対象となる転写物の中で最も濃縮されている段階希釈cDNAサンプル(例えば、一次RSV感染から4日後の肺)を用いて作成した。Ct値をlog10 cDNA希釈係数に対してプロットした。これらの曲線を用いて、様々なサンプルについて得られたCt値を相対発現単位に変換し、その後、これを、対応するサンプル中で発現されたβ-アクチンmRNA(「ハウスキーピング遺伝子」)のレベルに対して正規化した。mRNAレベルをグループ内の全ての動物についての幾何平均±SEMとして表した。
(インビトロスクリーニングの結果)
本明細書に開示される化合物(I)のプロファイルが以下にまとめられており(表A)、これは、HEp2細胞におけるRSV A2誘導性CPEとRSV B誘導性CPEの両方に対する強力な阻害活性を示している。さらに、本発明の化合物は、BEAS2B気管支上皮細胞におけるRSV A2 F-タンパク質発現の強力な阻害を示している。化合物(I)とのインキュベーションに起因する細胞生存に対する効果は全く検出されなかった。
表A HEp2細胞におけるRSV A2誘導性及びRSV B誘導性CPEに対する、BEAS2B気管支上皮細胞におけるRSV A2 F-タンパク質発現に対する、及び細胞生存に対する化合物(I)による処理の効果。
Figure 0006675407
 表脚注: 1. 0.1μg/mLでの阻害(％); 2. 1μg/mLでの阻害(％);
また、抗ウイルス効果を、気液培養ヒト初代気管支上皮細胞を用いて評価した。細胞は、広範囲にわたる粘膜繊毛分化を経て、正常ヒト呼吸上皮で観察されるものと同様の形態的特徴を有する培養物を生じる。結果として、この細胞モデルは、ヒト気道におけるRSV感染を厳密に模倣する。
RSV力価は、1日目から増大し、3日で最大となり、その後、最大7日まで徐々にかつ穏やかに低下した。0日目から7日目までの毎日の頂端ウェルに対する化合物(I)による処理(早期介入、表B、図1を参照)は、濃度依存的阻害を誘導し、0.1μg/mLで7日間にわたって完全阻害を示した。化合物(I)による処理は、それをウイルスピークの3日後から投与したとき、感染後6日目及び7日目に、ウイルス力価の劇的な低下ももたらした(後期介入、表C、図2を参照されたい)。
表B: RSV A2に感染させられ、気液界面で培養された気管支上皮細胞由来の頂端洗浄液中のRSV A2ウイルス力価に対する化合物(I)による早期介入(0〜7日)の効果。
Figure 0006675407
 1. 10倍希釈頂端洗浄液を用いたアッセイで少しでもプラークが検出されたら、1PFU/mLを割り当てた; 2.全ての実験について、n値は3であった。
表C: RSV A2に感染させられ、気液界面で培養された気管支上皮細胞由来の頂端洗浄液中のRSV A2ウイルス力価に対する化合物(I)による後期介入(3〜7日)の効果。
Figure 0006675407
 1. 10倍希釈頂端洗浄液を用いたアッセイで少しでもプラークが検出されたら、1PFU/mLを割り当てた; 2.全ての実験について、n値は3であった。
(インビボ試験)
ヒトRSVは、前臨床スクリーニングに使用されるいくつかの動物種で感染及び複製することができ、それにより、新規の抗感染剤の性能及びプロファイルをインビボで評価及び比較することが可能になる(Bemらの文献、2011)。霊長類種を感染させ、試験することもできるが、この種の仕事はほとんど、マウス又はコットンラットで実施される。標準的な近交系マウス系統とコットンラットはどちらも、ヒトRSVの複製に対して「半許容性」として特徴付けられるが、顕著により大きいウイルス複製は、近交系マウス系統と比較してコットンラットで見られる。それゆえ、化合物(I)を上述のインビボ系で試験した。
RSV A2感染マウスにおいて、ウイルス力価は、接種後4日目に最大となった。化合物(I)を、接種の1日前及び1時間前(0日目)、その後、ウイルス感染の2日後及び3日後に、鼻腔内(表D、図3)又は気管内(表E)のいずれかに投与し、どちらの場合も、肺ホモジネートにおけるウイルス力価の強力な用量依存的阻害を示した。
表D: RSV A2感染マウス由来の肺におけるRSV A2ウイルス力価に対する化合物(I)による鼻腔内処理の効果。
Figure 0006675407
 1.全ての実験について、n値は8であった; 2.:定量の下限(LOQ)。
表E: RSV A2感染マウス由来の肺におけるRSV A2ウイルス力価に対する化合物(I)による気管内処理の効果。
Figure 0006675407
 1.全ての実験について、n値は8であった; 2.:定量の下限(LOQ)。
化合物(I)によるウイルス力価の強力な用量依存的阻害は、4日目のRSV/S/Long感染コットンラット由来の肺ホモジネートでも見られた(表F、図4)。さらに、原薬は、肺におけるRSV NS-1遺伝子転写物(表G)及びRANTES転写物(表H)の用量依存的阻害を示した。
表F: RSV A2感染コットンラット由来の肺におけるRSV A2ウイルス力価に対する化合物(I)による鼻腔内処理の効果。
Figure 0006675407
 1.全ての実験について、n値は6であった; 2.:定量の下限(LOQ)。
表G: RSV A2感染コットンラット由来の肺におけるRSV A2 NS-1遺伝子発現に対する化合物(I)による鼻腔内処理の効果。
Figure 0006675407
 1.全ての実験について、n値は6であった。
表H: RSV A2感染コットンラット由来の肺におけるRANTES遺伝子発現に対する化合物(I)による鼻腔内処理の効果。
Figure 0006675407
 1.全ての実験について、n値は6であった。
(まとめ)
本発明の化合物のインビトロ抗ウイルス活性が、RSVに感染したHEp2細胞に対するその細胞保護効果によって示されている。このアッセイ系では、ウイルス複製の阻害を、結果として生じたウイルス媒介CPEの阻害から検出及び定量した。化合物(I)が、試験されたRSV A株とRSV B株の両方によって誘導されるCPEの強力な阻害剤であることは特に注目すべきである。化合物(I)の強力な抗ウイルス活性はさらに、BEAS2B細胞におけるそのRSV A2 F-タンパク質発現の阻害からも明らかであった。
本発明の化合物は、細胞生存アッセイでそれらにいかなる顕著な効果もないことから判断されるように、低い哺乳動物細胞毒性を示す。さらに、気管支上皮細胞の気液界面培養を含むヒト肺上皮のインビトロモデルにおいて、本発明の化合物は、早期介入又は後期介入のいずれかによって投与したとき、ウイルス力価を完全に阻害した。後者の観察は、確立した疾患の治療にとって特に有意義である。
本発明の化合物のインビボ抗ウイルス活性がRSVに感染したマウス及びコットンラットで示されている。このアッセイ系では、ウイルス複製の阻害を、プラークアッセイで測定される肺ホモジネートにおけるRSV力価から検出及び定量した。ALI培養ヒト気管支細胞で実施された試験から得られたデータと一致して、化合物(I)は、RSV A2感染マウス及びコットンラットの肺におけるウイルス力価を完全に阻害した。したがって、本発明の化合物は、RSV感染及び関連疾患の治療及び/又は予防のための効果的な薬となるための必要な属性を有する。
(参考文献)
Figure 0006675407
Figure 0006675407
本明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上、別途要求されない限り、「含む(comprise)」という語並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変化形は、記載された整数、工程、整数の群、又は工程の群の包含を意味するのであって、任意の他の整数、工程、整数の群、又は工程の群を除外するものではないことが理解されるであろう。
本明細書で言及される特許及び特許出願は全て、引用により完全に組み込まれる。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩
Figure 0006675407
 。
（構成２）
医薬としての使用のための、構成1記載の化合物。
（構成３）
RSV感染の治療における及びRSV感染と関連する疾患の予防のための使用のための、構成1記載の化合物。
（構成４）
RSV感染の治療のための及びRSV感染と関連する疾患の予防又は治療のための薬剤の製造のための、構成1記載の化合物の使用。
（構成５）
RSVに感染した対象の治療方法であって、該対象に、構成1記載の化合物の有効量を投与することを含む、前記方法。
（構成６）
対象におけるRSV感染と関連する疾患の予防又は治療方法であって、感染前の該対象に、構成1記載の化合物の有効量を投与することを含む、前記方法。
（構成７）
対象におけるRSV感染と関連する疾患の予防方法であって、感染前の該対象に、構成1記載の化合物の有効量を投与することを含む、前記方法。
（構成８）
前記RSV感染が、RSV A株のウイルス及び/又はRSV B株のウイルスによる感染である、構成3〜7のいずれか１記載の、使用のための化合物、使用、又は方法。
（構成９）
第2の又はさらなる活性成分と組み合わせた医薬としての使用のための、構成1記載の化合物。
（構成１０）
構成1記載の化合物を、任意に1以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
（構成１１）
水性媒体に懸濁した微粒子形態の式(I)の化合物を含む、構成10記載の医薬組成物。
（構成１２）
第2の又はさらなる活性成分を含む、構成10記載の医薬組成物。
（構成１３）
前記第2の又はさらなる活性成分が、Fタンパク質阻害剤(抗Fタンパク質抗体、例えば、パリビズマブを含む)、RNAポリメラーゼ阻害剤、及びリバビリンを含む抗ウイルス剤(例えば、他の抗RSV剤)、並びに抗炎症剤から選択される、構成9記載の使用のための化合物又は構成12記載の医薬組成物。
（構成１４）
構成1記載の式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩の調製方法であって、式(II)の化合物又はその塩;
Figure 0006675407
 を2-フルオロ-6-メチルアニリンと反応させることを含む、前記方法。
（構成１５）
式(II)の化合物又はその塩
Figure 0006675407
 。
（構成１６）
構成1記載の式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩の調製方法であって、式(III)の化合物又はその塩;
Figure 0006675407
 (式中、LGは、脱離基、例えば、ハロゲン原子、とりわけ、塩素である。)
を7-オキサ-2-アザスピロ[3,5]ノナン又はその塩と反応させることを含む、前記方法。
（構成１７）
式(III)の化合物又はその塩
Figure 0006675407
 (式中、LGは、脱離基、例えば、ハロゲン原子;とりわけ、塩素である。)。
（構成１８）
構成1記載の式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩の調製方法であって、式(IV)の化合物又はその塩;
Figure 0006675407
 を式(VI)の化合物又はその塩;
Figure 0006675407
 と反応させることを含む、前記方法。
（構成１９）
式(IV)の化合物又はその塩
Figure 0006675407
 。
（構成２０）
式(VI)の化合物又はその塩
Figure 0006675407
 。
（構成２１）
式(II)の化合物又はその塩の調製方法であって、式(X)の化合物又はその塩;
Figure 0006675407
 (式中、LGは、脱離基、例えば、ハロゲン原子、とりわけ、塩素であり、R a は、低級アルキル、例えば、エチルである。)
を7-オキサ-2-アザスピロ[3,5]ノナン又はその塩と反応させ、次いで、カルボキシレートエステルを遊離酸に加水分解することを含む、前記方法。
（構成２２）
式(X)の化合物又はその塩
Figure 0006675407
 (式中、LGは、脱離基、例えば、ハロゲン原子、とりわけ、塩素であり、R a は、低級アルキル、例えば、エチルである。)。

Claims (13)

  1. 式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩：
    Figure 0006675407
     。
  2. 請求項1記載の化合物を含む、医薬組成物。
  3. RSV感染の治療のための、及び/又はRSV感染と関連する疾患の予防のための、請求項2記載の医薬組成物。
  4. 前記RSV感染が、RSV A株のウイルス及び/又はRSV B株のウイルスによる感染である、請求項3記載の医薬組成物。
  5. 前記式(I)の化合物が、水性媒体に懸濁した微粒子形態である、請求項2〜4のいずれか一項記載の医薬組成物。
  6. 第2の又はさらなる活性成分を含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の医薬組成物。
  7. 前記第2の又はさらなる活性成分が、抗ウイルス剤、Fタンパク質阻害剤、RNAポリメラーゼ阻害剤、リバビリン、及び抗炎症剤から選択される、請求項6記載の医薬組成物。
  8. 請求項1記載の式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩の調製方法であって、
    式(II)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     を2-フルオロ-6-メチルアニリンと反応させること；又は
    式(III)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     (式中、LGは、ハロゲン原子である。)
    を7-オキサ-2-アザスピロ[3,5]ノナン又はその塩と反応させること；又は
    式(IV)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     を式(VI)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     と反応させることを含む、前記方法。
  9. 式(II)の化合物又はその塩の調製方法であって：
    Figure 0006675407
     式(X)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     (式中、LGは、ハロゲン原子であり、Raは、C1-6アルキルである。)
    を7-オキサ-2-アザスピロ[3,5]ノナン又はその塩と反応させ、次いで、カルボキシレートエステルを遊離酸に加水分解することを含む、前記方法。
  10. 式(II)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     。
  11. 下記からなる群から選択される化合物：
    式(III)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     (式中、LGは、ハロゲン原子である。)；及び
    式(IV)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     。
  12. 式(VI)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     。
  13. 式(X)の化合物又はその塩：
    Figure 0006675407
     (式中、LGは、ハロゲン原子であり、Raは、C1-6アルキルである。)。
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