CN106834390A - 细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法 - Google Patents

细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法以克雷伯氏菌NY1种子液作为种子液，以加入蔗糖、丙酮酸钠和α‑酮戊二酸钠的无机盐培养基为发酵体系，进行微生物发酵培养，提取微生物絮凝剂。本发明的方法通过发酵体系的营养条件来优化克雷伯氏菌NY1发酵过程中唾液酸产量，从而提高具有唾液酸修饰的糖蛋白微生物絮凝剂的产量。本发明的方法能够有效地提高克雷伯氏菌NY1发酵产絮凝剂的产量与活性，同时提高了碳源的转化率，从而降低了微生物絮凝剂的生产成本。且本发明的方法能够使克雷伯氏菌NY1发酵产絮凝剂的产量及活性达到稳定。

Description

细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法
技术领域
本发明属于水处理领域，涉及糖蛋白絮凝剂，具体涉及一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法
背景技术
微生物絮凝剂(MBF)多为次生代谢物，是细胞分泌的大分子。其产量和性能因微生物菌种、发酵碳源及条件不同而有所差异。从目前报道的MBF的结构看，有蛋白质类、多糖类、DNA类、糖蛋白类及其它胞外聚合物类。糖蛋白类MBF分子结构中含有羟基、羰基、糖环、肽键、酯键、芳环及杂环芳基等多种活性官能团，可用于去除水样中悬浮固体颗粒物(SS)、重金属离子、有色物质等，可成为绿色的、多功能水处理药剂。但由于糖蛋白结构的复杂性和较高的微生物絮凝剂生产成本，在实际研究过程中，鲜有人能够做到稳定高产高活性。
现有技术中，提高微生物絮凝剂产量的方法主要有筛选优势菌株、构建基因工程菌、改善营养条件以及优化发酵工艺等常规方法。基因调控是一个复杂的过程,涉及定位基因与抑制基因的相互作用、定位基因的表达、絮凝产物的合成与分泌等，且构建的基因工程菌只在特定条件下才能表达，因此该方法并不长用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，能够有效地提高微生物发酵产絮凝剂时的产量，并保持稳定高产，克服现有的微生物发酵产絮凝剂过程中产量低、稳定性差的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，其特征在于，该方法以克雷伯氏菌NY1种子液作为种子液，以加入蔗糖、丙酮酸钠和α-酮戊二酸钠的无机盐培养基为发酵体系，进行微生物发酵培养，提取微生物絮凝剂。
具体的，该方法包括以下步骤：
步骤一，制备种子液：
从克雷伯氏菌NY1菌株保存斜面上挑取一环菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，得到克雷伯氏菌NY1种子液；
步骤二，制备发酵体系：
向无机盐培养基中加入蔗糖、丙酮酸钠和α-酮戊二酸钠，溶解，灭菌，得到发酵体系；
步骤三，微生物发酵：
向步骤二制得的发酵体系中接种步骤一制得的克雷伯氏菌NY1种子液，在摇床上，恒温好氧条件下培养3d，得到发酵液；
步骤四，提取微生物絮凝剂：
将步骤三制得的发酵液离心去除NY1菌体，得到上清液，把上清液与无水乙醇按体积比1：3混合，收集漂浮凝聚体，将收集到的漂浮凝聚体，再溶于体积为发酵液体积三分之一的蒸馏水中；
重复离心得到上清液和乙醇提取的过程，再次离心去除菌体，用无水乙醇提取，反复提取三次。取漂浮凝聚体在未干前分装，冻干，得到糖蛋白絮凝剂。
本发明还具有如下区别技术特征：
步骤一中，所述的克雷伯氏菌NY1种子液为OD600nm为1.78±0.06的铜绿假单胞菌NY1种子液。
步骤二中，蔗糖投加量为20～21g/L，丙酮酸钠投加量为1～5g/L，α-酮戊二酸钠投加量为1～4g/L。丙酮酸钠和α-酮戊二酸钠在微生物代谢过程中具有促进其分泌唾液酸的作用。
优选的，步骤二中，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠投加量为4g/L，α-酮戊二酸钠投加量为2g/L。
步骤二中，所述的无机盐培养基包括(g/L)：2.5gNaNO3，1mL微量元素(2.5gFeSO4·7H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.2g MnCl2·4H2O，0.024g CoCl2·6H2O，0.024g NiCl2·6H2O，0.017g CuCl2·2H2O，0.109g Na2MoO4·2H2O，0.062g H3BO3，5mL 12.1M HCl，溶于1000mL蒸馏水)，2mL 1M MgSO4·7H2O溶液，0.2mL 1M CaCl2·2H2O溶液，30mL磷酸盐缓冲液，调pH为7.8，加蒸馏水于1000mL容量瓶中定容，121℃高压水蒸气灭菌30min。
步骤三中，所述的克雷伯氏菌NY1种子液的接种体积比为1.8％～2.2％。
步骤三中，发酵培养时，摇床温度为27℃～31℃，转速为130～165rpm。
优选的，步骤三中，发酵培养时，摇床温度为28℃，转速为165rpm。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的方法通过发酵体系的营养条件来优化克雷伯氏菌NY1发酵过程中唾液酸产量，从而提高具有唾液酸修饰的糖蛋白微生物絮凝剂的产量。本发明的方法能够有效地提高克雷伯氏菌NY1发酵产絮凝剂的产量与活性，同时提高了碳源的转化率，从而降低了微生物絮凝剂的生产成本。且本发明的方法能够使克雷伯氏菌NY1发酵产絮凝剂的产量及活性达到稳定。
附图说明
图1是实施例1中克雷伯氏菌NY1所产絮凝剂产量及絮凝率。
图2是实施例1中克雷伯氏菌NY1所产絮凝剂红外谱图。
以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
本发明是获得高产微生物絮凝剂NY1菌株后，在其优化发酵工艺条件下，从微生物絮凝剂合成机理出发，改变其营养条件，从而获得高产、稳定且高活性的NY1菌发酵条件。本申请在实验过程中发现，克雷伯氏菌NY1发酵产絮凝剂差量与其发酵液粘度呈正相关，发酵液粘度越大，微生物絮凝剂产量越大。然而对所产微生物絮凝剂的表征发现，发酵液粘度大小并不影响微生物絮凝剂的平均分子量，而是与微生物絮凝剂中唾液酸含量成正比。微生物中的唾液酸可调节其代谢循环过程中糖蛋白的半衰期，当机体内缺少SA，可导致糖蛋白迅速消失。据此推测，SA分泌可影响MBF的产量与活性。基于这一点重要原因。
需要说明的是，本申请的克雷伯氏菌NY1为已有的菌种，参见文献：Nie M,Yin X,Jia J,et al.Production of a novel bioflocculant MNXY1by Klebsiella pneumoniaestrain NY1and application in precipitation of cyanobacteria and municipalwastewater treatment[J].J.Appl.Microbiol.,2011,111(3):47-58。
遵从上述技术方案，以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，制备种子液：
菌种的活化：将NY1菌种子液在无菌操作台转接至牛肉膏固体斜面培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养2d，再放入冰箱冷藏室中保存，每个月至少转接一次。
牛肉膏固体培养基(g/L)为：1000ml牛肉膏液体培养基中加入18g～20g琼脂加热搅拌至沸腾用作斜面和平板。
无菌条件下，从克雷伯氏菌NY1菌株保存斜面上挑取一环菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，30℃,160rpm恒温振荡，好氧培养24h，得到OD600nm为1.78±0.06的克雷伯氏菌NY1种子液。
牛肉膏蛋白胨液体培养基(g/L)为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠(NaCl)5g，溶于1000ml蒸馏水中，加热至牛肉膏完全溶解后至室温时调pH于7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。
本实施例中，克雷伯氏菌NY1种子液为OD600nm为1.78±0.06的铜绿假单胞菌NY1种子液。
步骤二，制备发酵体系：
向无机盐培养基中加入蔗糖、丙酮酸钠和α-酮戊二酸钠，置于250ml锥形瓶中，待其溶解后于121℃高压蒸汽灭菌30min，得到发酵体系，备用。
蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠投加量为4g/L，α-酮戊二酸钠投加量为2g/L。
无机盐培养基包括：2.5gNaNO3，1mL微量元素(2.5g FeSO4·7H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.2g MnCl2·4H2O，0.024g CoCl2·6H2O，0.024g NiCl2·6H2O，0.017g CuCl2·2H2O，0.109g Na2MoO4·2H2O，0.062g H3BO3，5mL 12.1M HCl，溶于1000mL蒸馏水)，2mL 1MMgSO4·7H2O溶液，0.2mL 1M CaCl2·2H2O溶液，30mL磷酸盐缓冲液，调pH为7.8，加蒸馏水于1000mL容量瓶中定容，121℃高压水蒸气灭菌30min。
在糖蛋白末端，细胞表面存在少量唾液酸(SA)，很少以游离的形式存在，它们大多通过2-位异头碳的羟基以α-糖苷键沟通内外并具防御功能，SA修饰蛋白质与否可以调节生物体液和粘蛋白的粘度。SA可调节循环过程中糖蛋白的半衰期，当机体内缺少SA，可导致糖蛋白迅速消失。据此推测，SA分泌可影响MBF的产量与活性。丙酮酸是合成聚唾液酸的前体物质，发酵液中添加前体物质有助于该类物质的合成。同时丙酮酸是微生物TCA循环的起始物质，而在TCA循环中，丙酮酸会代谢为α-酮戊二酸钠，因此α-酮戊二酸钠也有利于合成唾液酸，因此，选择蔗糖为主要碳源，丙酮酸为第二碳源，α-酮戊二酸钠为第三碳源组成三碳源发酵体系。
步骤三，微生物发酵：
向步骤二制得的发酵体系中接种步骤一制得的克雷伯氏菌NY1种子液，在摇床上，恒温好氧条件下培养3d，得到发酵液；
其中，克雷伯氏菌NY1种子液的接种体积比为2％；发酵培养时，摇床温度为28℃，转速为165rpm。
温度是微生物的重要生存因子，在适宜的温度范围内，随着温度升高，酶促反应速率也会相应提高，则微生物的代谢速率和生长速率能够相应提高。但是过低或者过高的温度则均会降低微生物的代谢速率和生长速率。
克雷伯氏菌NY1属于好氧微生物，发酵体系内的溶解氧对它的生长至关重要，在一定范围内溶解氧越多，越有利于NY1的生长和对絮凝剂的分泌，转速对于溶解氧量就更加尤为重要。
步骤四，提取微生物絮凝剂：
将步骤三制得的发酵液离心去除NY1菌体，得到上清液，把上清液与无水乙醇按体积比1：3混合，收集漂浮凝聚体，将收集到的漂浮凝聚体，再溶于体积为发酵液体积三分之一的蒸馏水中；
重复离心得到上清液和乙醇提取的过程，再次离心去除菌体，用无水乙醇提取，反复提取三次，取漂浮凝聚体在未干前分装，冻干，得到糖蛋白絮凝剂。
结果测试表征：
克雷伯氏菌NY1所产絮凝剂产量均为11g/L以上，絮凝率为96％以上，絮凝剂中唾液酸含量为10ng/gMBF～12.52ng/gMBF(MBF指的是糖蛋白絮凝剂)之间，蛋白质含量为0.37g/gMBF～0.4g/gMBF之间。不同时间节点发酵所产絮凝剂的产量和絮凝率如图1所示，在较长的时间跨度内所产的絮凝剂均能保持高产高活，这也是本技术的优越性所在。
克雷伯氏菌NY1所产絮凝剂的红外谱图如图2所示，在3430cm-1附近宽而强的吸收峰为-OH和-NH的伸缩振动峰，絮凝剂中有分子间和分子内氢键存在；1638cm-1处宽峰是由仲酰胺基(-NHC＝O-)的C＝O键伸缩振动造成的，可以看出絮凝剂分子中蛋白肽链主要为无规则卷曲和螺旋状；1400cm-1～1200cm-1所看到的不太尖的吸收峰(1373cm-1，1232cm-1)是C-H的变角振动；1200cm-1～1000cm-1间比较大的吸收峰是所有糖衍生物的典型吸收，包括不同基团的C-O变形振动和伸缩振动、C-O-C伸缩振动等。
对比例1：
本对比例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二的发酵体系中，由三碳源体系变为双碳源体系，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠投加量为6g/L，不投加α-酮戊二酸钠。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。絮凝剂的产量为9.52g/L，絮凝率为95.28％，絮凝剂中SA含量为9.5ng/gMBF，蛋白质含量为0.3g/gMBF。远远低于实施例1的各项指标。
对比例2：
本对比例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二的发酵体系中，由三碳源体系变为双碳源体系，蔗糖投加量为22g/L，丙酮酸钠投加量为4g/L，不投加α-酮戊二酸钠。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。絮凝剂的产量为8.725g/L，絮凝率为94.23％，絮凝剂中SA含量为9.2ng/gMBF，蛋白质含量为0.29g/gMBF。远远低于实施例1的各项指标。
对比例3：
本对比例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二的发酵体系中，由三碳源体系变为四碳源体系，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠为2g/L，α-酮戊二酸钠为1g/L，草酰乙酸二乙酯钠投加量为3g/L。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。絮凝剂的产量为7.825g/L，絮凝率为92.13％，絮凝剂中SA含量为7.5ng/gMBF，蛋白质含量为0.25g/gMBF。远远低于实施例1的各项指标。
实施例2：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二中，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠为5g/L，α-酮戊二酸钠为1g/L。步骤三中，克雷伯氏菌NY1种子液的接种体积比为1.8％。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.85g/L，絮凝率为96.325％，絮凝剂中SA含量为10.986ng/gMBF，蛋白质含量为0.386g/gMBF。
实施例3：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二中，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠为4g/L，α-酮戊二酸钠为2g/L。步骤三中摇床转速为155rpm。步骤三中，克雷伯氏菌NY1种子液的接种体积比为2.2％。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.785g/L，絮凝率为96.489％，絮凝剂中SA含量为10.9456ng/gMBF，蛋白质含量为0.376g/gMBF。
实施例4：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二中，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠为3g/L，α-酮戊二酸钠为3g/L。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.239g/L，絮凝率为96.597％，絮凝剂中SA含量为11.0565ng/gMBF，蛋白质含量为0.394g/gMBF。
实施例5：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二中，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠为2g/L，α-酮戊二酸钠为4g/L。步骤三中摇床转速为130rpm。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.548g/L，絮凝率为96.846％，絮凝剂中SA含量为10.964ng/gMBF，蛋白质含量为0.403g/gMBF。
实施例6：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二中，蔗糖投加量为21g/L，丙酮酸钠为4g/L，α-酮戊二酸钠为1g/L。步骤三中摇床温度设定为31℃。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.364g/L，絮凝率为96.175％，絮凝剂中SA含量为10.8965ng/gMBF，蛋白质含量为0.377g/gMBF。
实施例7：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二中，蔗糖投加量为21g/L，丙酮酸钠为3g/L，α-酮戊二酸钠为2g/L。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.236g/L，絮凝率为96.468％，絮凝剂中SA含量为11.0634ng/gMBF，蛋白质含量为0.398g/gMBF。
实施例8：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤二中，蔗糖投加量为21g/L，丙酮酸钠为2g/L，α-酮戊二酸钠为3g/L。步骤三中摇床温度设定为27℃。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.895g/L，絮凝率为96.587％，絮凝剂中SA含量为10.9778ng/gMBF，蛋白质含量为0.41g/gMBF。
实施例9：
本实施例给出一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，该方法的步骤与实施例1基本相同，区别在于：蔗糖投加量为21g/L，丙酮酸钠为1g/L，α-酮戊二酸钠为4g/L。
在恒温震荡箱培养发酵3d，最后提取絮凝剂。本实施例红外表征结果与实施例1相同。絮凝剂的产量为11.647g/L，絮凝率为96.563％，絮凝剂中SA含量为11.1236ng/gMBF，蛋白质含量为0.399g/gMBF。

Claims (9)

1.一种细菌发酵生产糖蛋白絮凝剂中提高产量活性稳定性的方法，其特征在于，该方法以克雷伯氏菌NY1种子液作为种子液，以加入蔗糖、丙酮酸钠和α-酮戊二酸钠的无机盐培养基为发酵体系，进行微生物发酵培养，提取微生物絮凝剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一，制备种子液：
从克雷伯氏菌NY1菌株保存斜面上挑取一环菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，得到克雷伯氏菌NY1种子液；
步骤二，制备发酵体系：
向无机盐培养基中加入蔗糖、丙酮酸钠和α-酮戊二酸钠，溶解，灭菌，得到发酵体系；
步骤三，微生物发酵：
向步骤二制得的发酵体系中接种步骤一制得的克雷伯氏菌NY1种子液，在摇床上，恒温好氧条件下培养3d，得到发酵液；
步骤四，提取微生物絮凝剂：
将步骤三制得的发酵液离心去除NY1菌体，得到上清液，把上清液与无水乙醇按体积比1：3混合，收集漂浮凝聚体，将收集到的漂浮凝聚体，再溶于体积为发酵液体积三分之一的蒸馏水中；
重复离心得到上清液和乙醇提取的过程，再次离心去除菌体，用无水乙醇提取，反复提取三次。取漂浮凝聚体在未干前分装，冻干，得到糖蛋白絮凝剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述的克雷伯氏菌NY1种子液为OD600nm为1.78±0.06的铜绿假单胞菌NY1种子液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中，蔗糖投加量为20～21g/L，丙酮酸钠投加量为1～5g/L，α-酮戊二酸钠投加量为1～4g/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤二中，蔗糖投加量为20g/L，丙酮酸钠投加量为4g/L，α-酮戊二酸钠投加量为2g/L。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中，所述的无机盐培养基包括：2.5gNaNO3，1mL微量元素(2.5g FeSO4·7H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.2g MnCl2·4H2O，0.024gCoCl2·6H2O，0.024g NiCl2·6H2O，0.017g CuCl2·2H2O，0.109g Na2MoO4·2H2O，0.062gH3BO3，5mL 12.1M HCl，溶于1000mL蒸馏水)，2mL 1M MgSO4·7H2O溶液，0.2mL 1M CaCl2·2H2O溶液，30mL磷酸盐缓冲液，调pH为7.8，加蒸馏水于1000mL容量瓶中定容，121℃高压水蒸气灭菌30min。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中，所述的克雷伯氏菌NY1种子液的接种体积比为1.8％～2.2％。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中，发酵培养时，摇床温度为27℃～31℃，转速为130～165rpm。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤三中，发酵培养时，摇床温度为28℃，转速为165rpm。
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