CN106770843A - 一种测定自由巯基含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定自由巯基含量的方法，所述方法包括以下步骤：将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，而后经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；利用已知自由巯基浓度的对照品溶液作为对照；通过供试品溶液的液相色谱峰面积与已知自由巯基浓度的对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。本发明的方法具有专属性好，灵敏度高的特点，可以最大限度地免受其他物质信号的干扰，测定结果准确度高，数据可靠。

Description

一种测定自由巯基含量的方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，涉及一种测定自由巯基含量的方法。
背景技术
自由巯基含量的测定方法有毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法等，也可采用紫外-可见光谱法或者荧光光谱法。然而，毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法，紫外光谱法的灵敏度和准确度比较低，但是这种方法简单、快速，并且反应条件温和，且可以同时测定总的自由巯基而被大家广泛采用。其中Ellman试剂应用最为广泛，中国药典里面收载的蛋白质中自由巯基的含量测定方法即采用该法。但当该方法测定自由巯基的残留时，即测定某种物质中自由巯基的痕量时，该方法就存在灵敏度太低的问题。而在某些反应中，尤其该物质作为起始物料或中间物质时，由于多余自由巯基物质，如二巯基聚乙二醇，二硫苏糖醇等，需要严格控制其残留。
CN102759586A公开了高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，在该方法中利用甲酸作为巯基化合物的稳定剂，流动相为含有甲酸的水相与有机相的混合物，可以明显解决或减缓巯基化合物在供试液和流动相中因极端不稳定现象而造成的含量测定误差，然而其并不能提高检测的灵敏度，并不能准确检测残留的痕量自由巯基的含量。
因此，在本领域，急需开发一种高灵敏度，且专属性好的方法来测定样品中的自由巯基含量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种测定自由巯基含量的方法，本发明方法具有专属性好，灵敏度高的特点，可以最大限度地免受其他物质信号的干扰，测定结果准确度高，数据可靠。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种测定自由巯基含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；
(2)利用已知自由巯基浓度的对照品溶液经过与步骤(1)所述供试品溶液相同的处理，得到对照品溶液的液相色谱数据；
(3)通过供试品溶液的液相色谱峰面积与对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。
在本发明中，通过利用高效液相色谱法并使用衍生剂使得可以大大提高检测的灵敏度，以解决目前测定自由巯基方法中存在的其它物质干扰大，灵敏度差的问题。
优选地，步骤(1)所述供试品为需要测定自由巯基含量的样品。
优选地，所述含有自由巯基的物质为二巯基聚乙二醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸或2-巯基乙醇中的任意一种或至少两种的混合物。
在本发明中，所述含有自由巯基的物质不限于如上列举的具体物质，其他含有自由巯基的化合物或混合物均可以利用本发明的方法实现精确的测定。
利用本发明所述的方法可以完成样品中残留自由巯基的检测，例如本发明可以实现交联玻璃酸钠中二巯基聚乙二醇的残留的定量检测。
在本发明中，所述色谱分离时的流动相可以为一切可以溶解供试品并通过HPLC进行测定的溶剂或溶剂混合物。
优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为醇类、乙腈或水中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为5％～95％(例如5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)乙腈，优选60-80％的乙腈。
优选地，步骤(1)所述色谱分离时使用的色谱柱为含有长链烷基键合相的色谱柱或其相关色谱柱，优选C18柱；柱温为4～50℃(例如4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃)，优选30～50℃。
优选地，步骤(1)所述色谱分离时样品流速为0.1～5mL/min，例如0.1mL/min、0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min、1.8mL/min、2mL/min、2.5mL/min、2.8mL/min、3mL/min、3.5mL/min、4mL/min、4.5mL/min或5mL/min。
优选地，步骤(1)所述衍生剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)的磷酸钠-EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲液。
优选地，所述衍生剂中5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的浓度为0.01～100mg/100mL，例如0.01mg/100mL、0.05mg/100mL、1mg/100mL、3mg/100mL、5mg/100mL、8mg/100mL、10mg/100mL、15mg/100mL、20mg/100mL、30mg/100mL、40mg/100mL、50mg/100mL、60mg/100mL、70mg/100mL、80mg/100mL、90mg/100mL或100mg/100mL，优选0.05～20mg/100mL。
在本发明中，如果衍生剂中5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的浓度过低则衍生不够完全，如果浓度过高，则干扰较大，均会影响到结果的准确性。
优选地，所述衍生剂中磷酸钠的浓度为0.01～1mol/L，例如0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.07mol/L、0.09mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L或1mol/L，优选0.05～0.5mol/L。
在本发明中，磷酸钠的浓度太低则缓冲效果差，在测定自由巯基含量较高的样品时影响衍生效果，浓度太高，则会由于缓冲液中离子浓度过高，从而影响衍生后数据采集时基线的平稳，影响检测方法的灵敏度。
优选地，所述衍生剂中磷酸钠缓冲液的pH值为6～12，例如6、6.3、6.5、6.8、7、7.3、7.5、7.8、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12，优选7～10。
优选地，所述衍生仪的衍生管的长度为0.2～50m，例如0.2m、0.5m、1m、3m、5m、8m、10m、15m、20m、25m、30m、35m、40m、45m或50m。衍生管长度太短会导致样品通过衍生管时时间太短，衍生不完全，导致检测结果比真实值偏低；衍生管长度太长，衍生完成的样品通过衍生管的时间就会比较长，扩散效应明显，从而导致数据采集时色谱峰不明显，影响检测的灵敏度。
优选地，所述衍生仪的衍生温度为20～100℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃。
优选地，所述衍生仪中衍生试剂的流速为0.1～5mL/min，例如0.1mL/min、0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min、1.8mL/min、2mL/min、2.5mL/min、2.8mL/min、3mL/min、3.5mL/min、4mL/min、4.5mL/min或5mL/min。
优选地，所述紫外检测器采集液相色谱数据为采集检测波长为380～450nm的数据。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的方法对于样品中自由巯基含量的测定具有专属性好，灵敏度高的特点，可以最大限度地免受其他物质信号的干扰，该方法检测限为1μg/mL，定量限为4μg/mL，准确度、精密度、线性关系以及耐用性等均良好，测定结果准确度高，数据可靠，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2测定的HPLC色谱分析结果图；
图2为实施例4得到的对照品溶液浓度与HPLC色谱峰峰面积的线性回归曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
(1)磷酸盐缓冲液(pH7.4)制备：取无水磷酸氢二钠912mg，一水合磷酸二氢钠300mg，加水使溶解成500mL，即得。
(2)0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)，1mmol/L EDTA反应缓冲液制备：称取3.5814g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解使成10mL，摇匀，得到1mol/L磷酸氢二钠溶液；称取1.5601g二水合磷酸二氢钠，加水溶解使成10mL，摇匀，得到1mol/L的磷酸二氢钠溶液；吸取9.32mL的1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68mL的1mol/L的磷酸二氢钠溶液加水稀释至约90mL，混匀，用氢氧化钠试液调pH至8.0，加水定容至100mL，摇匀,得到0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)溶液；称取0.03724g EDTA至0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)溶液中，混匀，得到0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)1mmol/L EDTA反应缓冲液。
(3)5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液制备：称取5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)0.15mg加入0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)1mmol/L EDTA反应缓冲液100mL。混匀，即得。
(4)80％乙腈制备：取乙腈800mL，加水使成1000mL。混匀并抽滤，超声15min，即得。
(5)对照品(PEG-dithiol)溶液制备：精密称取二巯基聚乙二醇对照品25mg，置50mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1mL，置50mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至刻度，制成约10ug/mL的对照品溶液。取1.0mL对照品溶液，加乙腈2mL，涡旋混匀，静置2h。
(6)空白溶液制备：取1.0mL磷酸盐缓冲液pH7.4，加乙腈2mL，涡旋混匀，静置2h。
(7)样品溶液制备：取约1.0g交联透明质酸钠凝胶，加乙腈2mL，涡旋混匀，静置2h。取上清。
(8)测定：色谱条件：流动相：80％乙腈；色谱柱：C18色谱柱；柱温：30℃；衍生试剂：0.15mg/mL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶液；衍生仪环形线圈：0.5mm×10m聚四氟乙烯管；线圈温度30℃；流速0.5mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长412nm。
分别取50μL空白溶液、对照品溶液样品溶液进样分析。
通过检测得到的样品溶液的的峰面积与已知浓度的对照品溶液峰面积的比例，可计算得到样品溶液中二巯基聚乙二醇的浓度。结果测得二巯基聚乙二醇残留为10μg/mL。
实施例2
使用实施例1的方法，按如下制备样品进行测定。
空白溶液：取磷酸盐缓冲液(pH7.4)的反应液1mL，加入乙腈2mL，涡旋混匀。静置2h。作为空白溶液。
供试品溶液1：取1.0g交联玻璃酸钠样品，加入乙腈2mL，涡旋混匀。静置2h，取上清。作为供试品溶液1。
供试品溶液2：取1.0g交联玻璃酸钠样品，加入20μg/mL的对照品乙腈溶液2mL，涡旋混匀。静置2h，取上清。作为供试品溶液2。
对照品溶液：取30μg/mL对照品溶液1mL，加入乙腈2mL，涡旋混匀。静置2h。作为对照品溶液。
分别对上述溶液进样，从色谱图中分析二巯基聚乙二醇对照品所在位置各溶液吸收情况。
实验结果：如图1所示，空白溶液图谱中，在二巯基聚乙二醇对照品保留时间处无吸收峰，其结果为0；供试品溶液2(即样品加标溶液)的图谱中，峰面积变大，证明该方法测定残余巯基的专属性良好。
实施例3
使用实施例1的方法，按如下制备样品进行测定。
取对照品溶液逐步稀释至一定浓度，按检测方法连续进样5次，计算信噪比。
实验结果：溶液浓度为4μg/mL时，信噪比为10，溶液浓度为1μg/mL时，信噪比为3。该方法的检测限为1μg/mL，定量限为4μg/mL。
实施例4
使用实施例1的方法，按如下制备样品进行测定。
分别配制4、8、16、20、30μg/mL的二巯基聚乙二醇溶液。分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，计算相关系数，其线性回归曲线如图2所示，线性方程的决定系数R2为0.9933，说明采集峰面积的结果与巯基浓度成正比，线性关系良好。
实施例5
使用实施例1的方法，按如下制备样品进行测定。
在已知二巯基聚乙二醇含量的样品(1.0g)中加入不同量对照品乙腈溶液(20μg/mL)。每个浓度加入三份平行样，测试其响应值，并计算样品中所加标样的回收率，二巯基聚乙二醇残留分析(HPLC法)方法学验证准确度实验结果如表1所示，结果表明回收率均在100％左右。此方法的准确度良好。
表1 实施例5的测定结果
实施例6
使用实施例1的方法，按如下制备样品进行测定。
称取1.0g样品，加入0.5mL对照品乙腈溶液(20ug/mL)，再加入乙腈溶液1.5mL。静置2h，取上清20μL进样，计算峰面积RSD％。二巯基聚乙二醇残留分析(HPLC法)重复性实验结果如表2所示，RSD为3.5，证明该方法的重复性良好。
表2，实施例6的测定结果
实施例7
通过按下表改变方法参数，取对照品溶液(10μg/mL)进样3次，按检测方法测定二巯基聚乙二醇的量。HPLC方法的参数变化如表4所示。
表3 实施例8的条件变动情况
利用以上参数得到的二巯基聚乙二醇残留分析(HPLC法)实验结果如表5所示，从其结果来看，方法条件的适当为动，并不会影响测定结果，证明该方法的耐用性良好。
表4 实施例8的测定结果
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种测定供试品中自由巯基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；
(2)利用已知自由巯基浓度的对照品溶液经过与步骤(1)所述供试品溶液相同的处理，得到对照品溶液的液相色谱数据；
(3)通过供试品溶液的液相色谱峰面积与对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述供试品为含有自由巯基的物质的样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有自由巯基的物质为二巯基聚乙二醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸或2-巯基乙醇中的任意一种或至少两种的混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为醇类、乙腈或水中的任意一种或至少两种的混合物；
优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为5％～95％乙腈，优选60-80％乙腈。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述色谱分离时使用的色谱柱为含有长链烷基键合相的色谱柱或其相关色谱柱，优选C18柱；柱温为4～50℃。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述色谱分离时样品流速为0.1～5mL/min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述衍生剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的磷酸钠-EDTA缓冲液；
优选地，所述衍生剂中5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的浓度为0.01～100mg/100mL，优选0.05～20mg/100mL；
优选地，所述衍生剂中磷酸钠的浓度为0.01～1mol/L，优选0.05～0.5mol/L；
优选地，所述衍生剂中磷酸钠缓冲液的pH值为6～12，优选7～10。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述衍生仪的衍生管的长度为0.2～50m；
优选地，所述衍生仪的衍生温度为20～100℃。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述衍生仪中衍生试剂的流速为0.1～5mL/min。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述紫外检测器采集液相色谱数据为采集检测波长为380～450nm的数据。
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