CN101201316A - 检测痕量辣根过氧化物酶的分光光度法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶的方法，它是在具塞试管中，依次加入HAc－NaAc缓冲溶液、KI、HRP和H₂O₂，摇匀后，置于温水浴中反应，再加入TPB摇匀，定容，将所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计上测定308nm处吸光度，根据标准曲线求得辣根过氧化物酶的浓度。该方法的优点在于KI作为HRP的氢供体底物，无毒易得；HRP催化氢受体底物H₂O₂具有特异性，本方法利用HRP催化H₂O₂氧化KI的反应测定HRP活性，方法灵敏度高，选择性好；设备简单，仅需紫外可见分光光度计和恒温水浴槽；操作简便，试剂成本低廉。

Description

检测痕量辣根过氧化物酶的分光光度法

技术领域：

本发明涉及检测痕量辣根过氧化物酶的方法，特别是一种用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶的方法。

背景技术：

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，简称HRP)是一种非常重要的过氧化物酶，在分析化学、环境科学、临床化学、有机合成等领域均有重要的应用。测定游离HRP和各种HRP标记中HRP的含量可以间接地测定体液和其他组织液中抗体或抗原的量，对于免疫学及组织化学的研究以及临床疾病的诊断具有十分重要的意义。

基于HRP催化H₂O₂氧化无色的苯胺类、苯酚类衍生物，生成具有颜色、荧光或电化学活性的醌式或偶氮类二聚或多聚产物，可用分光光度法、荧光法或电化学方法检测HPR活性和H₂O₂，并广泛用于酶联免疫和酶分析。

现有的测定HRP活性的方法主要有分光光度法，荧光光度法、化学发光法，以及酶联免疫吸附分析法、酶联荧光免疫分析法、电化学酶联免疫分析法等。其中伏安酶联免疫分析法灵敏度较高，但操作比较繁琐。上述方法主要存在两个缺点：第一，所用底物多为苯胺类、苯酚类衍生物，稳定性较差，见光或空气极易被氧化，更为不足的是苯胺类底物具有致癌作用，使它的应用受到限制。第二，HRP是一种对氢供体底物(如酚、胺、抗坏血酸等)缺乏特异性氧化的酶，可以催化氧化多种底物，因而底物类似物对测定也有干扰。因此，研究HRP的新底物和新方法具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶的方法。

本发明目的采用如下技术方案来实现：

本发明研究了阳离子表面活性剂溴代十四烷基吡啶(TPB)-HRP-KI-H₂O₂体系的光度法特征及其分析应用。在酸性条件下，HRP可以催化H₂O₂与过量的I^-反应生成I₃ ^-，I₃ ^-与阳离子表面活性剂TPB等形成缔合物微粒(TPB-I₃)_n，该缔合物微粒存在吸收效应，HRP浓度在一定范围内与TPB体系304nm处的吸光度呈线性关系。据此建立一种灵敏度高、选择性好、简便快速测定痕量HRP的光度法。

本发明采用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶。具体检测方法包括如下步骤：

1.在5.0mL的具塞试管中，依次加入HAc-NaAc缓冲溶液、KI和HRP；

2.在步骤1的具塞试管中再加入H₂O₂，摇匀；

3.将步骤2的试管置于温水浴中，再加入TPB，摇匀，用蒸馏水定容至2.5mL

4.将上述所得溶液适量倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计上扫描得到体系的吸收光谱，以不加HRP测得的吸收强度为空白；

5.将上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计测定304nm处的吸光度，绘制标准工作曲线，根据标准曲线：A_abs＝0.0801c+0.1252，R²＝0.9981，即可求得辣根过氧化物酶在0.4～3.2ng/mL范围内的浓度。

步骤1所述的具塞试管中，依次加入的HAc-NaAc缓冲溶液，其pH值为4.6～5.2，体积0.2～0.5mL，加入的KI浓度为4×10^-3mol/L～6×10^-3mol/L，加入的HRP浓度为0.1μg/mL，体积为10～80μL；

步骤2所述的加入的H₂O₂浓度为1.0×10^-5～3.0×10^-5mol/L；

步骤3所述的水浴温度为20～30℃，水浴反应时间为25～50min，TPB浓度为2.0×10^-5～6.0×10^-5mol/L；

步骤5所述的测定波长为304nm。

本发明的原理是：在偏酸性的HAc-NaAc缓冲溶液中，当有H₂O₂存在时，HRP可催化H₂O₂产生·OH，·OH可氧化过量的I^-生成I₂，过量的I^-与I₂可结合形成I₃ ^-，而TPB可与I₃ ^-结合形成(I₃ ^--TPB)_n缔合微粒。用NaNo-ZS90纳米粒度与Zeta电位分析仪对此微粒进行分析表明，该微粒的平均粒径在700～800nm范围内。因该微粒有较大的粒径可产生吸收效应，而该粒子大小与HRP的浓度有关，据此，可以建立间接测定HRP活力的新方法。其主要反应如下：

H₂O₂→·OH         (1)

·OH+I^-→OH^-+I₂    (2)

I₂+I^-→I₃ ^-              (3)

nTPB+nI₃ ^-→(I₃ ^--TPB)_n  (4)

本发明的优点是：

1：KI作为HRP的氢供体底物，该试剂无毒易得；

2：HRP催化氢受体底物H₂O₂具有特异性，本方法利用HRP催化H₂O₂氧化KI的反应，测定HRP活性，方法具有选择性好，灵敏度高(达pg/mL)的特点；

3：设备简单，仅需一台紫外可见分光光度计和恒温水浴槽；

4：操作简便，试剂成本低廉。

附图说明：

图1为本发明实施例KI-HRP-H₂O₂-TPB体系的紫外可见吸收光谱图，其中a：pH4.6-4.80×10^-3mol/L KI-1.51×10^-5mol/L H₂O₂-4.00×10^-5mol/L TPB；b：pH4.6-4.80×10^-3mol/L KI-1.51×10^-5mol/L H₂O₂-4.00×10^-5mol/L TPB-0.40ng/mL HRP；c：pH4.6-4.80×10^-3mol/L KI-1.51×10^-5mol/L H₂O₂-4.00×10^-5mol/LTPB-2.40ng/mL HRP；d：pH4.6-4.80×10^-3mol/L KI-1.51×10^-5mol/L H₂O₂-4.00×10^-5mol/L TPB-3.20ng/mL HRP。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：

采用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶的方法包括以下步骤：

1.在5.0mL的具塞试管中，依次加入pH为4.6的HAc-NaAc缓冲溶液0.2mL，4.80×10^-3mol/L的KI，0.1μg/mL 10～80μL的HRP；

2.在步骤1的溶液中加入1.51×10^-5mol/L H₂O₂，摇匀；

3.在25℃水浴30min后，再加入4.0×10^-5mol/L TPB，摇匀，用蒸馏水定容至2.5mL；

4.将上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计上扫描得到体系的吸收光谱，以不加HRP测得的吸光强度为空白，在304nm处，根据标准曲线A_abs＝0.0801c+0.1252，R²＝0.9981，即可求得辣根过氧化物酶在0.4-3.2ng/mL范围内的浓度。

图中KI-HRP-H₂O₂-TPB体系的紫外光谱图表明：(TPS-I₃)_n缔合微粒可产生吸收效应，最大吸收波长在304nm处，选择在304nm处进行测量，随着HRP浓度的增加，该缔合微粒的吸收强度增大。

虽然以上通过实例对本发明实施方式进行了描述，但本领域的技术人员应该知道，上述仅为举例，可以对实施方式做出多种变更和修改，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。

Claims (6)

1.检测痕量辣根过氧化物酶的方法，其特征是：采用阳离子表面活性剂缔合物微粒分光光度法检测痕量辣根过氧化物酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：检测方法包括如下步骤：

(1)在具塞试管中，分别加入HAc-NaAc缓冲溶液、KI和HRP；

(2)在步骤1的具塞试管中再加入H₂O₂，摇匀；

(3)将步骤2的试管置于温水浴反应，再加入TPB，摇匀，用蒸馏水定容；

(4)将上述所得溶液适量倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计上扫描得到体系的吸收光谱，以不加HRP测得的吸光强度为空白；

(5)将上述所得溶液适量倒入石英比色皿中，置于紫外可见分光光度计上测定304nm的吸光度，根据所得实验结果绘制标准工作曲线，根据该曲线，A_abs＝0.0801c+0.1252，R²＝0.9981，即可求得辣根过氧化物酶在0.4～3.2ng/mL范围内的浓度。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是：步骤1所述的具塞试管为5.0mL，加入的HAc-NaAc缓冲溶液，pH值为4.6～5.2，体积0.2～0.5mL，加入的KI浓度为4×10^-3mol/L～6×10^-3mol/L，加入的HRP浓度为0.1μg/mL，体积为10～80μL。

4.如权利要求2所述的方法，其特征是：步骤2所述的加入的H₂O₂浓度为1.0×10^-5～3.0×10^-5mol/L。

5.如权利要求2所述的方法，其特征是：步骤3所述的水浴温度为20～30℃，水浴反应时间为25～50min，TPB浓度为2.0×10^-5～6.0×10^-5mol/L，用蒸馏水定容至2.5ml。

6.如权利要求2所述的方法，其特征是：步骤5所述的测定波长为304nm。

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