CN106769363A - 溶解性有机质的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶解性有机质的定量检测方法，包括：(1)过滤去除悬浮性及难溶性颗粒物，收集滤液；(2)滤液冷冻干燥后配制成总有机碳浓度在20～150mg/L之间的溶液样品；(3)高效液相色谱检测，采集荧光多发射三维光谱数据，流动相由1～100mM的缓冲盐与有机相组成，有机相占比为2.5％～95％，洗脱时间5～60min，检测器采用固定激发波长、多发射扫描模式；(4)综合发射波长范围、洗脱梯度及洗脱时间确定不同极性腐殖质和非腐殖质区域；(5)对三维荧光数据进行背景扣除后进行定量分析，确定样品中腐殖质及非腐殖质的含量和比例。本发明的方法能够真实呈现自然环境中有机质的亲/疏水性比例及其含量。
Description
技术领域
本发明属于环境分析化学领域，具体涉及一种溶解性有机质的定量检测方法。
背景技术
溶解性有机质是一类结构复杂且非均质的混合物，主要由腐殖酸、富里酸及亲水性组分组成。溶解性有机质不仅是全球碳循环的重要部分，对全球变化具有重要影响；同时作为天然的配体和载体，其所含有的复杂官能团与水环境中多种活性金属、有机污染物、矿物及微生物相互作用，使污染物在固-液界面的分配行为复杂化，延长污染物在环境中的停留时间，影响污染物的迁移转化行为。因此，为揭示有机质各组分的环境行为，需采用分离技术，在降低其有机质的复杂性前提下才可进行各组分的表征分析研究。
传统的分离技术包括吸附分离、膜分离技术及以上两者的联合技术，这些传统的分离技术普遍存在操作繁琐、有机质损失大等缺点，同时分离过程中变化剧烈的pH值对有机质的各组分的结构和活性影响过大，且所分离的组分中亲/疏水比例并不能真实呈现水体中的原始组成。而现代分析手段——色谱技术所需样品少、分离速度快、可在线分析等诸多优点，成为目前有机质的分离、表征的重要手段。
流动相作为色谱系统的“血液”，其成份、梯度配比、流速等参数的选择决定了整个洗脱结果的优劣。而流动相中缓冲盐和有机溶剂的成份、浓度、配比梯度及洗脱时间，由目标样品中有机质的极性特征、色谱柱性质及检测器共同确定。检测器堪称色谱系统的“眼睛”，而常用的荧光检测器属于光致发光，需根据目标化合物选择合适的激发波长和发射波长，对检测的灵敏度和选择性都很重要。以往的荧光检测器中普遍选用单对激发/发射波长进行检测，而物质在吸收固定的激发光后将产生多种发射荧光。因而固定发射波段后所采集的二维样品信息将不够完整，以此为基础而进行的定量也不一定精确。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对溶解性有机质进行定量检测的方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种溶解性有机质的定量检测方法，其包括如下步骤：
(1)过滤待测样品以去除悬浮性及难溶性颗粒物，收集滤液；
(2)将步骤(1)所得滤液进行冷冻干燥后配制成总有机碳浓度在20～150mg/L之间的溶液样品；
(3)高效液相色谱分离、检测溶液样品，采集荧光多发射三维光谱数据，其中，混合流动相由浓度为1～100mM的中性缓冲盐与有机相混合组成，所述有机相占混合流动相的体积比为2.5％～95％，洗脱时间为5～60min，所用荧光检测器采用固定激发波长、多发射扫描模式；
(4)综合发射波长范围、洗脱梯度及洗脱时间共同确定不同极性腐殖质和非腐殖质区域；
(5)对所采集的三维荧光数据进行背景扣除后，按不同组分区域荧光强度进行定量分析，确定样品中腐殖质及非腐殖质的含量和比例。
步骤(1)中，所述过滤优选采用多级过滤方法的组合，更优选将待测样品分别用医用纱布和滤纸进行过滤以去除大型悬浮物，再用醋酸纤维滤膜进行过滤以去除难溶性颗粒物，之后收集过滤去杂后的滤液；其中用醋酸纤维滤膜进行过滤更优选依次用孔径范围在2～2.5μm和0.3～0.5μm的醋酸纤维滤膜进行过滤以去除难溶性颗粒物。
步骤(2)中，所述冷冻干燥优选温度为-50℃～0℃，压力在10～600Pa，冷冻干燥时间为5～30h。经过冷冻干燥处理后，取所获冻干粉末，配制成总有机碳浓度在20～150mg/L之间的溶液样品。优选地，冷冻干燥后，采用去离子水配制成总有机碳浓度在20～150mg/L之间的溶液样品。
步骤(3)中，优选用反相高效液相色谱，采用C18、C8、C4或C1等色谱柱进行分离，荧光检测器进行检测。
步骤(3)中，所述中性缓冲盐可为本领域常规，优选磷酸盐或醋酸盐，所述有机相优选乙腈、氯仿、环己烷或甲醇。
步骤(3)中，所述采集荧光多发射三维光谱数据是采集波段为200～600nm处的荧光多发射三维光谱数据。
步骤(4)中，确定不同极性腐殖质和非腐殖质区域的操作优选根据洗脱分离组分荧光峰发射波长位置确定有机质种类，当最大荧光峰位置小于380nm时定义为溶解性非腐殖质组分；最大荧光峰位置大于380nm时定义为溶解性腐殖质组分；以及
根据有机溶剂占混合流动相的比例及洗脱时间共同确定腐殖质和非腐殖质的极性特征。
其中，根据有机溶剂占混合流动相的比例及洗脱时间共同确定腐殖质和非腐殖质的极性特征的操作中，较佳地是，在反相分离柱体系中，当有机溶剂占混合流动相的比例大于2.5％且小于15％，洗脱时间大于总洗脱时间25％且小于40％的为亲水性组分；当有机溶剂占混合流动相比例大于15％且小于35％，洗脱时间大于总洗脱时间45％且小于75％的为过渡性组分；当有机溶剂占混合流动相比例大于35％且小于45％，洗脱时间大于总洗脱时间75％的为疏水性组分。
步骤(5)中，对所采集的三维荧光数据进行背景扣除优选在MATLAB软件中以去离子水为空白，对所采集的三维荧光数据进行空白及噪声扣除。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有下述有益效果：
1、确定了分离过程中流动相的成份、浓度及其洗脱梯度，实现了溶解性有机质的最大程度分离；
2、实现低总有机碳浓度水体溶解性有机质pH值中性条件下的分离，真实呈现了自然环境中有机质的亲/疏水性比例及其含量。
3、通过多发射波段荧光光谱信号的采集，实现了环境中溶解性有机质的同步分离和定量分析。
附图说明
图1是本发明实施例1的地表水溶解性有机质色谱分离图。
图2是本发明实施例2的城镇污水厂二级出水溶解性有机质色谱分离图。
具体实施方式
溶解性有机质是一类结构复杂且非均质的混合物，主要由腐殖酸、富里酸及亲水性组分组成。以往的分离及定量检测分析方法均存在一定缺陷。为了尽量客观呈现水体中溶解性有机质的组成情况，本发明的发明人经过大量的探究实验，对样品预处理的步骤进行了创新和优化，还对检测设备的参数选择和具体检测条件进行了创新和优化，各项因素最终组合在一起之后，再经过大量的反复应用验证之后，被证实具有理想的效果。本发明的技术方案在本发明之前还没有被任何现有技术述及过，具有较高的创新性。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
过滤除杂：采集的2L地表水样，分别用医用纱布、滤纸、孔径为2μm、0.45μm的醋酸纤维膜过滤，收集滤液。
浓缩配制：将收集滤液在-30℃，50Pa下进行冷冻干燥10小时，取冻干粉末配制成总有机碳含量为100mg/L的溶液样品。
色谱分离：在安捷伦色谱反相高效色谱系统中，分别注入10μL配制溶液样品、去离子水空白样品，采用乙腈-醋酸铵混合液样品，按表1时间梯度进行洗脱10min。固定激发波长为220nm，采集多发射280～550nm多发射信号数据。
组分鉴定：根据色谱分离系统及梯度洗脱时间，可鉴定出6个组分(如图1所示)，分别为：I:Em/Time＝380～550nm/0～4min(亲水性腐殖质)、II:Em/Time＝380～550nm/4～7min(过渡性腐殖质)、III:Em/Time＝380～550nm/7～10min(疏水性腐殖质)、IV:Em/Time＝330～380nm/0～4min(亲水性色氨酸)、V:Em/Time＝330～380nm/4～7min(过渡性色氨酸)、VI:Em/Time＝330～380nm/7～10min(疏水性色氨酸)、VII:Em/Time＝280～330nm/0～4min(亲水性酪氨酸)、VIII:Em/Time＝280～330nm/4～7min(过渡性酪氨酸)、IX:Em/Time＝280～330nm/7～10min(疏水性酪氨酸)。
定量分析：通过工作站导出三维数据，在MATLAB软件中对其进行空白和仪器噪声扣除后，对其荧光强度进行积分定量分析，结果见表2。
表1实施例1梯度洗脱时间表
表2实施例1定量分析结果
| 区域 | 有机质类型 | 含量/au-nm2-[mg·L-1C] | 比例/％ |
| I | 亲水性腐殖质 | 13437.5 | 42.28 |
| II | 过渡性腐殖质 | 2891.3 | 9.10 |
| III | 疏水性腐殖质 | 3091.1 | 9.73 |
| IV | 亲水性色氨酸 | 2048.2 | 6.44 |
| V | 过渡性色氨酸 | 4221.4 | 13.28 |
| VI | 疏水性色氨酸 | 1873.3 | 5.89 |
| VII | 亲水性酪氨酸 | 521.8 | 1.64 |
| VIII | 过渡性酪氨酸 | 3074.8 | 9.68 |
| IX | 疏水性酪氨酸 | 621.4 | 1.96 |
| 溶解性腐殖质 | 19419.9 | 61.11 | |
| 溶解性非腐殖质 | 12360.1 | 38.89 |
从表2可以看出，经安捷伦色谱反相高效色谱分离后，可发现所研究地表水体中溶解性有机质主要为溶解腐殖质，占总有机质的61.11％。溶解性腐殖质中主要以亲水性组分为主，其次为疏水性组分。在溶解性非腐殖质组分中主要以过渡性组分为主，其次为疏水性组分。本发明的方法较以往的有机质分离定量方法而言，不仅能够较好地分离溶解性腐殖质、溶解性非腐殖质及其物质组成，同时可辨别不同有机质组分的极性特征，并可进行定量分析，实现了环境中溶解性有机质的同步分离和定量分析，较好呈现了自然环境中有机质的亲/疏水性比例及其含量。
实施例2
过滤除杂：采集的2L某城镇污水厂二级出水，分别用医用纱布、滤纸、孔径为2.5μm、0.5μm的醋酸纤维膜过滤，收集滤液。
浓缩配制：将收集滤液在-30℃，30Pa下进行冷冻干燥12小时，取冻干粉末配制成总有机碳含量为80mg/L的溶液样品。
色谱分离：在安捷伦色谱反相高效色谱系统中，分别注入20μL配制溶液样品、去离子水空白样品，采用乙腈-醋酸铵混合液样品，按表3时间梯度进行洗脱15min。固定激发波长为230nm，采集多发射280～550nm多发射信号数据.
组分鉴定：根据色谱分离系统及梯度洗脱时间，可鉴定出9个组分(如图2所示)，分别为I:Em/Time＝380～550nm/0～5min(亲水性腐殖质)、II:Em/Time＝380～550nm/5～9min(过渡性腐殖质)、III:Em/Time＝380～550nm/9～15min(疏水性腐殖质)、IV:Em/Time＝330～380nm/0～5min(亲水性色氨酸)、V:Em/Time＝330～380nm/5～9min(过渡性色氨酸)、VI:Em/Time＝330～380nm/9～15min(疏水性色氨酸)、VII:Em/Time＝280～330nm/0～5min(亲水性酪氨酸)、VIII:Em/Time＝280～330nm/5～9min(过渡性酪氨酸)、IX:Em/Time＝280～330nm/9～15min(疏水性酪氨酸)。
定量分析：通过工作站导出三维数据，在MATLAB软件中对其进行空白和仪器噪声扣除后，对其荧光强度进行积分定量分析，结果见表4。
表3实施例2梯度洗脱时间表
| 时间(min) | 乙腈(％) | 20mM乙酸铵(％) | 流速(mL/min) |
| 0 | 2.5 | 97.5 | 1 |
| 5 | 5 | 95 | 1 |
| 9 | 20 | 80 | 1 |
| 15 | 40 | 60 | 1 |
表4实施例2定量分析结果
从表4可以看出，经安捷伦色谱反相高效色谱分离后，可发现所研究污水二级出水中溶解性有机质主要为溶解性非腐殖质，占总有机质的58.69％。溶解性腐殖质中主要以亲水性组分为主，其次为过渡性组分。在溶解性非腐殖质组分中主要以色氨酸组分为主，其中亲水性组分含量最高，疏水性组分次之。本发明的方法较以往有机质分离定量方法而言，不仅能够较好地分离溶解性腐殖质和溶解性非腐殖质，同时可辨别不同有机质组分的极性特征，并可进行定量分析，实现了环境中溶解性有机质的同步分离和定量分析，较好呈现了自然环境中有机质的亲/疏水性比例及其含量。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)过滤待测样品以去除悬浮性及难溶性颗粒物，收集滤液；
(2)将步骤(1)所得滤液进行冷冻干燥后配制成总有机碳浓度在20～150mg/L之间的溶液样品；
(3)高效液相色谱分离、检测溶液样品，采集荧光多发射三维光谱数据，其中，混合流动相由浓度为1～100mM的中性缓冲盐与有机相混合组成，所述有机相占混合流动相的体积比为2.5％～95％，洗脱时间为5～60min，所用荧光检测器采用固定激发波长、多发射扫描模式；
(4)综合发射波长范围、洗脱梯度及洗脱时间共同确定不同极性腐殖质和非腐殖质区域；
(5)对所采集的荧光多发射三维光谱数据进行背景扣除后，按不同组分区域荧光强度进行定量分析，确定样品中腐殖质及非腐殖质的含量和比例。
2.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过滤是将待测样品分别用医用纱布和滤纸进行过滤以去除大型悬浮物，再用醋酸纤维滤膜进行过滤以去除难溶性颗粒物，之后收集过滤除杂后的滤液。
3.根据权利要求2所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，其中用醋酸纤维滤膜进行过滤是依次用孔径范围在2～2.5μm和0.3～0.5μm的醋酸纤维滤膜进行过滤以去除难溶性颗粒物。
4.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述冷冻干燥的温度为-50℃～0℃，压力在10～600Pa，冷冻干燥时间为5～30h。
5.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，冷冻干燥后，采用去离子水配制成总有机碳浓度在20～150mg/L之间的溶液样品。
6.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中，选用反相高效液相色谱，采用C18、C8、C4或C1色谱柱进行分离，荧光检测器进行检测。
7.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述中性缓冲盐为磷酸盐或醋酸盐，所述有机相为乙腈、氯仿、环己烷或甲醇。
8.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述采集荧光多发射三维光谱数据是采集波段为200～600nm处的荧光多发射三维光谱数据。
9.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中，确定不同极性腐殖质和非腐殖质区域的操作是根据洗脱分离组分荧光峰发射波长位置确定有机质种类，当最大荧光峰位置小于380nm时定义为溶解性非腐殖质组分；最大荧光峰位置大于380nm时定义为溶解性腐殖质组分；以及
根据有机溶剂占混合流动相的比例及洗脱时间共同确定腐殖质和非腐殖质的极性特征；
较佳地是，在反相分离柱体系中，当有机溶剂占混合流动相的比例大于2.5％且小于15％，洗脱时间大于总洗脱时间25％且小于40％的为亲水性组分；当有机溶剂占混合流动相比例大于15％且小于35％，洗脱时间大于总洗脱时间45％且小于75％的为过渡性组分；当有机溶剂占混合流动相比例大于35％且小于45％，洗脱时间大于总洗脱时间75％的为疏水性组分。
10.根据权利要求1所述的溶解性有机质的定量检测方法，其特征在于，步骤(5)中，对所采集的三维荧光数据进行背景扣除是在MATLAB软件中以去离子水为空白，对所采集的三维荧光数据进行空白及噪声扣除。
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