CN106754960A

CN106754960A - 一个nlr类基因nlr1‑v及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN106754960A
Application number: CN201611187465.8A
Authority: CN
Inventors: 邢莉萍; 曹爱忠; 胡平; 刘佳倩; 崔超凡; 曹姝琪; 张瑞奇; 张守忠; 陈佩度
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: US11566259B2; CN106754960B; WO2018113470A1; US20190367942A1

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一个NLR类基因NLR1‑V及其表达载体和应用。具有NLR结构域的基因NLR1‑V的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自小麦‑簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上。NLR1‑V在抗白粉病小麦品种南农9918中受白粉菌诱导表达增强。通过瞬间表达将该基因转化感病小麦品种扬麦158，结果表明NLR1‑V的过量表达可以降低扬麦158的吸器指数。因此，NLR1‑V可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。

Description

一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum)的整个生育期受到多种病虫的危害，其中由小麦白粉病菌(Blurmeria graminis f.sp.tritici，Bgt)侵染引起的小麦白粉病是小麦最严重的真菌病害之一。由于小麦白粉病菌生理小种多、毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种群发生变化，会导致小麦白粉病的大爆发，给农业生产带来灾难性后果。广谱、持久抗病基因的发掘和利用对白粉病防治具有重要意义。

簇毛麦(Haynaldia villosa，2n＝2x＝14，VV)携带的抗白粉病基因Pm21对小麦白粉病具有广谱、高抗特性，该基因定位于6V染色体短臂上。南京农业大学细胞遗传研究所利用四倍体圆锥小麦与二倍体簇毛麦杂交，再与普通小麦回交多代后，选育出了普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系，将含有Pm21基因的6VS导入普通小麦。普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系自1994年进入国内育种利用以来，在白粉病常发区进行了多年种植，对白粉病表现出了广谱、高抗特性，以之为亲本已经选育出一批高抗白粉病的小麦新品种，南农9918即选育出的其中一个品种，Pm21在育种中得到广泛应用。分析Pm21介导的广谱抗性机理和克隆其候选基因对于利用基因工程手段培育具有白粉病广谱抗性的小麦品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一个NLR类基因NLR1-V的表达载体和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

NLR类基因NLR1-V来自普通小麦(Triticum asetivum L.)南农9918，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

该NLR类基因NLR1-V的蛋白质为NLR1-V，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

含有所述的NLR类基因NLR1-V的重组表达载体pBI220:NLR1-V。

所述的NLR类基因NLR1-V的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将NLR1-V基因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位点间所得。

所述的NLR类基因NLR1-V的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

有益效果：

本发明从小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上克隆获得小麦中克隆得到了一个NLR类基因NLR1-V及其所编码的蛋白质NLR1-V，将其插入表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。NLR1-V的超量表达载体用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够获得具备白粉病抗性的小麦种质。

附图说明

图1 NLR1-V在抗白粉病南农9918中受白粉菌诱导表达

图2 pBI220:NLR1-V超量表达载体图谱

图3 与白粉菌互作的表达GUS基因的表皮细胞

A图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后未形成吸器；B图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后形成吸器；其中，co:分生孢子；pp:侵入钉；ha:吸器；hy:菌丝

图4 利用瞬间表达研究NLR1-V基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应

具体实施方式

实施例1小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个NLR类基因NLR1-V的克隆

小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918是南京农业大学细胞遗传所育成的含有广谱抗白粉病基因Pm21的小麦品种(公知公用，陈佩度，张守忠，王秀娥，王苏玲，周波，冯祎高，刘大钧.抗白粉病高产小麦新品种南农9918.南京农业大学学报,2002,25(4):1438-1444)。前期已经在南农9918的6VS上开发了多个6VS的转化序列，进一步利用小片段插入易位系NAU418将Pm21限定在6EST258和CINAU15之间，并且在Pm21所在染色体区间还有6EST243和6EST238两个标记(公知公用，Radiation-induced translocations withreduced Haynaldia villosa chromatin at the Pm21locus for powdery mildewresistance in wheat.Molecular breeding,2013,31:477–484)。

将6EST258、CINAU15、6EST243、6EST238序列与水稻(http://rice.plantbiology.msu.edu)、大麦(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)、短柄草(http://plants.ensembl.org/Brachypodium_distachyon/Info/Index)的序列数据库进行Blastn比对分析，分别提取出水稻、大麦、短柄草中位于6EST258和CINAU15所在染色体区间的序列。根据其中一个大麦的序列设计引物，在南农9918受白粉菌诱导的cDNA样品中进行扩增，获得NLR1-V全长序列。cDNA样品准备及扩增流程如下：

具体流程如下：(1)将抗白粉病小麦南农9918的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵，一叶期把从感白粉病小麦材料上搜集的白粉菌孢子接种到苗上进行诱导，并于接种不同时间段取样(0h,1h,6h,12h,24h)，分别提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol试剂提取)，并且反转录成cDNA样品(用Takara公司的AMV反转录酶反转)。(2)以南农9918经白粉菌诱导24小麦的cDNA为模板，以NLR1-V基因引物P1(ATTGAGATGTCTGCACCGGTCGT,SEQ IDNO.3)和P2(CTCTCTTCGTTACATAATGTAGTGCC,SEQ ID NO.4)为引物进行RT-PCR，获得NLR1-V基因的cDNA全长片段。对该基因片段进行测序和比对，发现该基因为一个NLR类基因，命名为NLR1-V。对NLR1-V进行生物信息学分析，发现ORF(开放阅读框)2730bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码909个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2NLR类基因NLR1-V在小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中受白粉菌诱导表达

以小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导不同时间段的cDNA样品为模板，以根据NLR1-V设计的引物P3(ACGGGCTTATTCCAAGTCCT,SEQ ID NO.5)和P4(ACGCTTCTGAAGGCAGACTC，SEQ ID NO.6)为引物进行Q-PCR分析。PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uL PCR反应体系中含2×SYBR Green PCR Master Mix 10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明：在南农9918中，NLR1-V在小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导上调表达，12h小时表达水平最高，24h后表达水平开始下降(图1)。

实施例3NLR1-V基因瞬间表达载体的构建

以经白粉菌诱导的南农9918中克隆的NLR1-V基因cDNA为模板，使用引物对NLR1-V-BamHI-F(GGAGAGAACACGGGGGATCCATGTCTGCACCGGTCGTCAG，SEQ ID NO.7)和NLR1-V-StuI-R(AACGTCGTATGGGTAAGGCCTTTAAAGTAAAACTGGGACCACATTCATAG，SEQ ID NO.8)进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和StuI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和StuI双酶切后的载体pBI220(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants.EMBO J.1987,6:3901-3907.)，将NLR1-V置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因NLR1-V克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:NLR1-V(图1)。经测序验证，表明载体构建成功。

实施例4利用瞬间表达方法将NLR1-V基因转入小麦叶片

瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(Schweizer,Pokorny etal.A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-RelatedGenes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654.)。本研究利用瞬间表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒和基因轰击到小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击NLR1-V细胞的白粉菌吸器指数与未轰击NLR1-V细胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。

载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：

制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中，加入1ml 70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。12000rpm离心1min后弃上清。加入1ml ddH₂O水，涡旋混匀后，离心弃上清(重复三次)。最后加入500μl 50％甘油涡旋混匀，以备用。

包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA(总量应为1μg)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl 2.5M CaCl₂，然后加入20μl 0.1M亚精氨(现配先用)，涡旋3min。静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl 70％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入140μl 100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl100％酒精，充分涡旋，以备使用。

实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25(Christensen A H,QuailP H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectableand/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)的质粒DNA与钨粉包裹；当实施NLR1-V与GUS基因共转化时，将含有NLR1-V基因表达载体pBI220:NLR1-V的质粒DNA与含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。当GUS基因与NLR1-V基因进行共转化时，Marker基因GUS转入的细胞也是NLR1-V转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色细胞作为NLR1-V的表达细胞。

基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：0.1mol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.0)，含10mmol/L EDTA，5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100，20％甲醇)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。

实施例5NLR1-V抗病功能的分析

白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，吸器会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认(图3)。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment ofDefense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654.)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。

当单转化GUS基因时，感病小麦扬麦158的吸器指数为41.33％(统计了675个互作细胞)，当GUS基因与NLR1-V共转化感病小麦扬麦158后，统计了GUS基因表达(即NLR1-V表达)且有白粉菌互作的细胞的吸器指数，结果表明当NLR1-V转入后，扬麦158的吸器指数从41.33％降到19.23％(统计了603个细胞)(图4)。该结果说明，NLR1-V能显著降低吸器指数，对白粉菌具有抗病作用。

<110> 南京农业大学

<120> 一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用

<160> 8

<210> 1

<211> 2730

<212> DNA

<213> 普通小麦（Triticum asetivum L.）南农9918

<220>

<223> NLR1-V

<400> 1

atgtctgcac cggtcgtcag cgccaccatg ggggcgatga accccctcat cggcaagctc 60

gccgcactga ttggtgacga gtacaagaaa ctcacagggg tgaggagaca ggcctccttc 120

ctcaaggatg agcttagcgc catgaaagct ctccttgaga agcttgagct catggatgaa 180

ctggatccct tggccaagaa ctggagggat tatgtccggg agatgtccta cgacatggag 240

aattgcattg atgacttcat gcgagacctt ggaggtgccg atgcaaagac gggctttatc 300

aagaagacgg ctaaacgtct caagacgttg cggaagcgtc atcgtattgc tgatcggatg 360

gaagagctca aggggcttgc tttgcaagca aatgaacgac gcatgaggta caagattgat 420

gattgcgcca attctaccaa tcgtgtcgtt cccatcgata ctcggatgtt ggcaatctac 480

aagcaggcaa cggggcttgt tggtattgat ggcccaaaga aagagcttgt aagttggttg 540

acagatactc aggaaaaact caaggtggtg gctattgttg gatttggagg ccttggtaaa 600

actacacttg ccaaacaagt atatgatacg attggagggc aattcagctg taaaatattt 660

ttctctgttt ctcaaagacc tgatatgtca agcctccttc gtggtctcca atcggagctt 720

aatatggaag aggagttaac tcagcctcac gaggtgcaac acatcattgg ccgtcttaga 780

gaatatctca cacataagag gtaccttatt gttgttgatg acttgtggta tcaatcaaca 840

tggaatatca tgagttgtat ctttccagaa gtcgggaatg gaagtagagt aatagtaact 900

acacgagtgg aggatgtggc tatttgggca tgtcgtgatg accatgagtg tgtttataga 960

atggaacccc tcaaagaaca agactcaaga atgctgttct gtaatagagt atttggttcc 1020

ggatatgcct gtccactgcc gttaaaaaaa gtttcagatg aaattttgaa gaagtgtgga 1080

gggttgccac ttgcaattat cactatagct agtctattag caagtcgtca agcaagatca 1140

gacgagtggg agagcataag aaattgtttg ggcgctaagc ttgccataaa ttccaccttg 1200

gaagagatga ggagtatact gaaccttagc tacatgcatc ttcctcttca tctccgtcca 1260

tgtctcctgt actttggcat gtatccagaa gacaaaatta tcaggaggcg tgacatggtt 1320

ctacagtggg tagccgaagg ctttgtcaat aattctcatg gatctaatct agaggatgtt 1380

gcagagagtt atttcaatga gcttatcaat agaagtctaa ttcagcctgg agaatccata 1440

gatggaaaga ttgagtctta caaagtacac gatatgatgc ttgatttgat cctcagcaag 1500

tgtgcagaaa ataattttat aagtgtggca tataattgtg aagacgtggc aagaatgcat 1560

ggccgcgaat acaaggtccg tagattgtcc ttgacttcaa gtgctaacga tgcaacatca 1620

gaaaacattc atactagcat gcaacaaatt cgctcatttt catgctttgg agagcctaaa 1680

tacacacctc ctcttttgct atttaaatac cttcgggtgc tagtgtttat atcctcagac 1740

gcgtttggtc cgatagtgga ccttactgct attggtcaat tgtttcagct aaggtatgtc 1800

aaggtttctg cttcatacgg aatagatttt cctaccgaat ttcgcaagct tgttcatttg 1860

gagacgctgg aagtatctgg tttttcacca agcatcccgt cagatattgt ttgcttgcca 1920

cggttatctc gtctgatcct tccgtgtctt acacgtcttc ctcaagggat tgccaacata 1980

aaatcattgc gtgcattgca ctgtatggag cacatctcgc tagaggatat taatggcctt 2040

ggcgagctga ccagtctgag ggagctgagg ctttacacta aaatggtggc gggtgaagtt 2100

gatgctttgg tatccctaat tggaaagctc catgacctaa aatacctcgc ggtctctgtt 2160

gagtcttcta aacatcattg cgacccgttg tactcattat caaaccctcc tctccatatc 2220

gaggaacttg atctgtacgg gtggacactg aagagagttc ccacatggat tggtgacctc 2280

catttccttc ggatcctgga tttgtgtgtc tacaacttgt tgaacgacga ggttcatgtt 2340

gtgggaaatc ttccctgcct cgtccatctg cgtctaaggg tgttcgctga aggcggggcc 2400

gtaatctgca cgggcttatt ccaagtcctg aaagtccttc gtctcttctc tcatgatgtg 2460

gaagacatgc agtttcagat agggctaatg cccagcctgc gacagctcac tctagaagta 2520

aataatggct ggggtggtgc tgtgcctcga ggcatggagc acctattggc cctcgatcac 2580

atctctgtat ttgccagacg cggcgtcaat caccgtgatg tcgagtctgc cttcagaagc 2640

gtcttcgatg tgcacccaag acaaccttcc ttagaaataa tacctgatgt tcccctcagt 2700

tctatgaatg tggtcccagt tttactttaa 2730

<210> 2

<211> 909

<212> PRT

<213> 普通小麦（Triticum asetivum L.）南农9918

<220>

<223> 蛋白NLR1-V

<400> 2

Met Ser Ala Pro Val Val Ser Ala Thr Met Gly Ala Met Asn Pro Leu

1 5 10 15

Ile Gly Lys Leu Ala Ala Leu Ile Gly Asp Glu Tyr Lys Lys Leu Thr

20 25 30

Gly Val Arg Arg Gln Ala Ser Phe Leu Lys Asp Glu Leu Ser Ala Met

35 40 45

Lys Ala Leu Leu Glu Lys Leu Glu Leu Met Asp Glu Leu Asp Pro Leu

50 55 60

Ala Lys Asn Trp Arg Asp Tyr Val Arg Glu Met Ser Tyr Asp Met Glu

65 70 75 80

Asn Cys Ile Asp Asp Phe Met Arg Asp Leu Gly Gly Ala Asp Ala Lys

85 90 95

Thr Gly Phe Ile Lys Lys Thr Ala Lys Arg Leu Lys Thr Leu Arg Lys

100 105 110

Arg His Arg Ile Ala Asp Arg Met Glu Glu Leu Lys Gly Leu Ala Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Glu Arg Arg Met Arg Tyr Lys Ile Asp Asp Cys Ala Asn

130 135 140

Ser Thr Asn Arg Val Val Pro Ile Asp Thr Arg Met Leu Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Lys Gln Ala Thr Gly Leu Val Gly Ile Asp Gly Pro Lys Lys Glu Leu

165 170 175

Val Ser Trp Leu Thr Asp Thr Gln Glu Lys Leu Lys Val Val Ala Ile

180 185 190

Val Gly Phe Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Gln Val Tyr

195 200 205

Asp Thr Ile Gly Gly Gln Phe Ser Cys Lys Ile Phe Phe Ser Val Ser

210 215 220

Gln Arg Pro Asp Met Ser Ser Leu Leu Arg Gly Leu Gln Ser Glu Leu

225 230 235 240

Asn Met Glu Glu Glu Leu Thr Gln Pro His Glu Val Gln His Ile Ile

245 250 255

Gly Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Thr His Lys Arg Tyr Leu Ile Val Val

260 265 270

Asp Asp Leu Trp Tyr Gln Ser Thr Trp Asn Ile Met Ser Cys Ile Phe

275 280 285

Pro Glu Val Gly Asn Gly Ser Arg Val Ile Val Thr Thr Arg Val Glu

290 295 300

Asp Val Ala Ile Trp Ala Cys Arg Asp Asp His Glu Cys Val Tyr Arg

305 310 315 320

Met Glu Pro Leu Lys Glu Gln Asp Ser Arg Met Leu Phe Cys Asn Arg

325 330 335

Val Phe Gly Ser Gly Tyr Ala Cys Pro Leu Pro Leu Lys Lys Val Ser

340 345 350

Asp Glu Ile Leu Lys Lys Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Ile Ile Thr

355 360 365

Ile Ala Ser Leu Leu Ala Ser Arg Gln Ala Arg Ser Asp Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Ile Arg Asn Cys Leu Gly Ala Lys Leu Ala Ile Asn Ser Thr Leu

385 390 395 400

Glu Glu Met Arg Ser Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Met His Leu Pro Leu

405 410 415

His Leu Arg Pro Cys Leu Leu Tyr Phe Gly Met Tyr Pro Glu Asp Lys

420 425 430

Ile Ile Arg Arg Arg Asp Met Val Leu Gln Trp Val Ala Glu Gly Phe

435 440 445

Val Asn Asn Ser His Gly Ser Asn Leu Glu Asp Val Ala Glu Ser Tyr

450 455 460

Phe Asn Glu Leu Ile Asn Arg Ser Leu Ile Gln Pro Gly Glu Ser Ile

465 470 475 480

Asp Gly Lys Ile Glu Ser Tyr Lys Val His Asp Met Met Leu Asp Leu

485 490 495

Ile Leu Ser Lys Cys Ala Glu Asn Asn Phe Ile Ser Val Ala Tyr Asn

500 505 510

Cys Glu Asp Val Ala Arg Met His Gly Arg Glu Tyr Lys Val Arg Arg

515 520 525

Leu Ser Leu Thr Ser Ser Ala Asn Asp Ala Thr Ser Glu Asn Ile His

530 535 540

Thr Ser Met Gln Gln Ile Arg Ser Phe Ser Cys Phe Gly Glu Pro Lys

545 550 555 560

Tyr Thr Pro Pro Leu Leu Leu Phe Lys Tyr Leu Arg Val Leu Val Phe

565 570 575

Ile Ser Ser Asp Ala Phe Gly Pro Ile Val Asp Leu Thr Ala Ile Gly

580 585 590

Gln Leu Phe Gln Leu Arg Tyr Val Lys Val Ser Ala Ser Tyr Gly Ile

595 600 605

Asp Phe Pro Thr Glu Phe Arg Lys Leu Val His Leu Glu Thr Leu Glu

610 615 620

Val Ser Gly Phe Ser Pro Ser Ile Pro Ser Asp Ile Val Cys Leu Pro

625 630 635 640

Arg Leu Ser Arg Leu Ile Leu Pro Cys Leu Thr Arg Leu Pro Gln Gly

645 650 655

Ile Ala Asn Ile Lys Ser Leu Arg Ala Leu His Cys Met Glu His Ile

660 665 670

Ser Leu Glu Asp Ile Asn Gly Leu Gly Glu Leu Thr Ser Leu Arg Glu

675 680 685

Leu Arg Leu Tyr Thr Lys Met Val Ala Gly Glu Val Asp Ala Leu Val

690 695 700

Ser Leu Ile Gly Lys Leu His Asp Leu Lys Tyr Leu Ala Val Ser Val

705 710 715 720

Glu Ser Ser Lys His His Cys Asp Pro Leu Tyr Ser Leu Ser Asn Pro

725 730 735

Pro Leu His Ile Glu Glu Leu Asp Leu Tyr Gly Trp Thr Leu Lys Arg

740 745 750

Val Pro Thr Trp Ile Gly Asp Leu His Phe Leu Arg Ile Leu Asp Leu

755 760 765

Cys Val Tyr Asn Leu Leu Asn Asp Glu Val His Val Val Gly Asn Leu

770 775 780

Pro Cys Leu Val His Leu Arg Leu Arg Val Phe Ala Glu Gly Gly Ala

785 790 795 800

Val Ile Cys Thr Gly Leu Phe Gln Val Leu Lys Val Leu Arg Leu Phe

805 810 815

Ser His Asp Val Glu Asp Met Gln Phe Gln Ile Gly Leu Met Pro Ser

820 825 830

Leu Arg Gln Leu Thr Leu Glu Val Asn Asn Gly Trp Gly Gly Ala Val

835 840 845

Pro Arg Gly Met Glu His Leu Leu Ala Leu Asp His Ile Ser Val Phe

850 855 860

Ala Arg Arg Gly Val Asn His Arg Asp Val Glu Ser Ala Phe Arg Ser

865 870 875 880

Val Phe Asp Val His Pro Arg Gln Pro Ser Leu Glu Ile Ile Pro Asp

885 890 895

Val Pro Leu Ser Ser Met Asn Val Val Pro Val Leu Leu

900 905

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P1

<400> 3

attgagatgt ctgcaccggt cgt 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P2

<400> 4

ctctcttcgt tacataatgt agtgcc 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P3

<400> 5

acgggcttat tccaagtcct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P4

<400> 6

acgcttctga aggcagactc 20

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物NLR1-V-BamHI-F

<400> 7

ggagagaaca cgggggatcc atgtctgcac cggtcgtcag 40

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物NLR1-V-StuI-R

<400> 8

aacgtcgtat gggtaaggcc tttaaagtaa aactgggacc acattcatag 50

Claims

1.NLR类基因NLR1-V，来自小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上，其ORF序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的基因NLR1-V编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.NLR类基因NLR1-V的重组表达载体pBI220:NLR1-V。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的NLR类基因NLR1-V的表达载体pBI220:NLR1-V是以pBI220为出发载体，将NLR1-V基因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位点间所得。

5.权利要求1所述的NLR类基因NLR1-V在构建抗白粉病小麦品种中的应用。

6.权利要求3或4所述的NLR类基因NLR1-V的表达载体pBI220:NLR1-V在构建抗白粉病小麦品种中的应用。