CN110229833B

CN110229833B - 一个簇毛麦cerk1-v基因及其所编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN110229833B
Application number: CN201910545899.8A
Authority: CN
Inventors: 王秀娥; 樊安琪; 王宗宽; 刘佳; 韦璐阳; 王雅嘉; 张鑫; 袁春霞; 王海燕; 肖进
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-06-23
Filing date: 2019-06-23
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2039-06-23
Also published as: CN110229833A

Abstract

本发明公开了一个簇毛麦CERK1‑V基因及其所编码的蛋白和应用。CERK1‑V的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。通过单细胞瞬时表达技术将CERK1‑V基因超表达载体pBI220‑CERK1‑V转化感病小麦品种扬麦158，结果表明瞬间超表达CERK1‑V可以降低扬麦158的吸器指数。超表达CERK1‑V转基因植株，其CERK1‑V的表达量是扬麦158表达量的2‑12倍，其对小麦白粉病表现出中高抗性水平。因此，CERK1‑V可望用于基因工程育种，将其超表达载体pBI220‑CERK1‑V导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。

Description

一个簇毛麦CERK1-V基因及其所编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦CERK1-V基因及其所编码的蛋白和应用。

背景技术

由专性寄生真菌小麦白粉病菌(Blumeria graminis DC f.sp.tritici)引起的小麦白粉病在我国是小麦(Triticum aestivum L.,2n＝6x＝42,基因组AABBDD)3大真菌病害之一，严重威胁我们小麦安全生产。该病在小麦整个生育期都可发生，并且可侵害小麦地上植株各个部分，以叶片和叶鞘为主，其发病可导致15-30％的产量损失。

随着栽培制度、耕作方式以及气候条件变化的影响，特别是我国大部分栽培品种含有的抗性基因Pm8的抗性丧失，因此近年来我国小麦白粉病危害呈加重趋势。白粉病虽能用杀菌剂防治，但化学防治必然增加人力、物力投入，而且还会引起环境污染等生态问题，因此发掘抗病基因、培育抗病品种是防治小麦白粉病的有效措施。明确小麦抗白粉病的机制，克隆抗病相关基因，可以为小麦白粉病防治、小麦抗白粉病育种提供重要的理论和物质基础。

植物在与病原菌的长期协同进化中，进化出了一套先天免疫系统。位于植物细胞膜上的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)，可以识别病原菌保守的病原物相关分子模式(pathogen association molecular patterns,PAMPs)，触发PTI(PAMPstriggered immunity)反应。病原菌可以分泌效应因子(effectors)干扰或阻碍PTI反应，降低植物的抗病性。植物体外编码NBS-LRR类蛋白可以识别病原菌效应因子，从而触发ETI(effectors triggered immunity)反应，往往伴随着强烈的细胞程序性坏死反应。

目前在小麦克隆的白粉病抗性基因有Pm2，Pm3，Pm8，Pm21以及Pm60均为NBS-LRR类抗性基因。生产的实践发现NBS-LRR类抗性基因一般提供垂直抗性，这种抗性在生产中容易被新的病原菌毒性小种所克服。因此在育种利用中，要结合PTI和ETI的抗性特性，提高抗性的持久性，提高作物的抗谱。

几丁质为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖，是真菌细胞壁结构组成成分。植物体内几丁质受体LysM类PRRs识别几丁质后能触发免疫反应。LysM-RK类PRRs蛋白(CERK类型)存在2个胞外LysM结构域(参与几丁质的识别)、一个跨膜结构域和一个胞内的激酶结构域(参与信号转导)；LysM-RP类PRRs蛋白(CEBiP类型)存在2个胞外LysM结构域(参与几丁质的识别)，在该类蛋白的C末端存在一个GPI(Glycosylphosphatidylinositol)位点，协助其定位于细胞膜上。在拟南芥和水稻基因组中克隆到的多个LysM-RK以及LysM-RP参与几丁质的识别及下游免疫反应。

栽培小麦的近缘物种在长期进化和自然选择过程中，保留了大量的抗病虫害、抗逆、优质等有益基因，是普通小麦品种改良的重要基因来源，因此，研究和利用亲缘物种抗病基因，是改良小麦抗病性的重要途径。簇毛麦(Haynaldia villosa L.,2n＝2x＝14,基因组VV,)是普通小麦的二倍体近缘物种，具有高抗白粉病的优良性状，有望从中获得抗白粉病的功能基因。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一个LysM类受体蛋白激酶基因CERK1-V。

本发明的另一目的是提供该基因的超表达载体。

本发明的又一目的是提供该基因和超表达载体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

CERK1-V，来自二倍体簇毛麦。其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

该基因编码的蛋白质CERK1-V，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

所述的含有权利要求1所述的CERK1-V基因的超表达载体，优选以pBI220为出发载体，将权利要求1所述的CERK1-V基因全长(SEQ ID NO.1)正向插入pBI220载体的BamHI和Stu I酶切位点间所得。

所述的CERK1-V基因的超表达载体在抗白粉病小麦品种中的应用。

有益效果

本研究拟通过分析簇毛麦LysM类受体蛋白基因家族的表达模式，克隆了与白粉病抗性相关的LysM类受体蛋白基因CERK1-V。通过单细胞瞬时表达实验初步证明CERK1-V正向调控小麦白粉病抗性。进一步利用小麦农杆菌的遗传转化技术，将CERK1-V基因的超表达载体pBI220-CERK1-V转化小麦品种扬麦158中，获得转基因阳性植株，分子鉴定和抗性鉴定结果表明，超表达该基因可以提高白粉病抗性，表明该基因在小麦白粉病抗性中发挥正向调控功能，可用于基因工程育种，提高小麦对白粉病的抗性。

附图说明

图1CERK1-V在二倍体簇毛麦白粉菌诱导后的叶片中的实时荧光定量RT-PCR分析X轴：0h、1h、3h、8h、12h、18h、24h、36h分别表示簇毛麦叶片受白粉菌诱导的不同时间段；Y轴：CERK1-V基因在不同样品中受白粉菌诱导前后的表达倍数。

图2 CERK1-V基因超表达载体构建图谱

图3利用单细胞超表达技术研究CERK1-V抗白粉病效应

图4 CERK1-V基因超表达载体转化扬麦158的T₁代阳性转基因植株PCR分子鉴定结果泳道1-10依次为阳性转化植株OE-CERK1-T₀-1、OE-CERK1-T₀-10、OE-CERK1-T₀-22、OE-CERK1-T₀-23、OE-CERK1-T₀-26、OE-CERK1-T₀-34、OE-CERK1-T₀-40、OE-CERK1-T₀-44、OE-CERK1-T₀55、OE-CERK1-T₀-62。

图5 CERK1-V基因超表达载体转化扬麦158的T₁代阳性转基因植株qPCR分析结果

X轴：扬麦158、以及上述10棵转基因阳性植株；Y轴：CERK1-V基因在转基因植株中相对于扬麦158的表达倍数。

图6 CERK1-V基因超表达载体转化扬麦158的T₁代阳性转基因植株白粉病离体鉴定

具体实施方式

实施例1 CERK1-V基因克隆及受白粉菌诱导的表达特征

设计了同源克隆引物P1(ATGGAAGCTCCGCTCCTC,SEQ ID NO.3)以及P2(TCATCTCCCGGACATG,SEQ ID NO.4)在簇毛麦叶片受白粉菌诱导后的cDNA中克隆得到1866bp序列，该序列如SEQ ID NO.1所示。该序列编码621个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示，将该基因命名为CERK1-V。

把抗白粉病的簇毛麦种子(参考文献：齐莉莉，陈佩度，等，小麦白粉病新抗源—基因Pm21，作物学报，1995，21(3):257-262)播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵(周围用圆柱状透明塑料片隔离，顶端用滤纸封闭，形成无白粉菌的环境)。待三叶期，把在感病品种苏麦三号上培养的南京本地混合白粉菌新鲜孢子轻轻抖落在簇毛麦的幼苗上。接种白粉菌后的簇毛麦在16℃继续培养。接种0h、1h、3h、8h、12h、18h、24h、36h取样，置于-70℃冰箱内保存备用。用TRIZOL(Invitrogen)提取受白粉菌诱导的簇毛麦叶片的RNA，利用AMV酶(Takara)合成反转录第一链，得到反转录产物。

应用能特异扩增CERK1-V的特异引物P3(GGGAGCAATAGCAGGAGGT,SEQ ID NO.5)和P4(TGATCGGACAATGGCATCT，SEQ ID NO.6)，对该基因在受白粉菌诱导样品中进行qPCR分析。PCR反应在qPCR仪(Roche Light Cycler 480，Roche)上扩增。20μl PCR反应体系中含2μlcDNA,10μl 2×SYBR EX Taq TM(TakaRa)，0.4μl引物P1(10μM)和P2(10μM)。扩增参数为：95℃5min，然后95℃10s、60℃30s，72℃15s，共41个循环。反应结束后，计算相对表达量：根据得到的CT值计算目标基因在处理后的不同时间点相对于未处理的相对表达量，即

其中，△△C_T＝(C_T.Target-C_T.Tublin)_{Time x}-(C_T.Target-C_T.Tublin)_{Time 0}。Time x表示任意时间点，Time 0表示未处理点。结果表明：在簇毛麦叶片受白粉菌诱导18h后表达水平达到诱导高峰，为31.3倍。qPCR的结果表明，CERK1-V可能正向调控小麦白粉病抗性(附图1)。

实施例2 CERK1-V基因超表达载体沉默载体的构建

利用上述CERK1-V基因克隆载体pMD18T-CERK1-V，以可特异扩增CERK1-V基因片段(SEQ ID NO.1)的引物对P5(CGGGATCCATGGAAGCTCCGCTCCTC,SEQ ID NO.7)和P6(GAAGGCCTTCTCCCGGACATGAGGTTC，SEQ ID NO.8)进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和StuI双酶切将扩增目标片断插入到载体pBI220(参考文献：Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile genefusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6:3901-3907)的35S启动子后面的多克隆位点BamHI和StuI之间。由此获得CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V(附图2)。

实施例3利用单细胞瞬时表达技术将CERK1-V基因超表达载体转入小麦叶片

单细胞瞬时表达技术是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(参考文献：Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the FunctionalAssessment of Defense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654)。本研究利用单细胞瞬时表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒轰击到小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击后的GUS细胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。

载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：

制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中，加入1ml 70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使金粉完全沉淀。12,000rpm离心1min后弃上清。加入1ml ddH₂O，涡旋混匀后，离心弃上清(重复3次)。最后加入500μl 50％甘油涡旋混匀，备用。

包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA(总量应为1μg，如质粒浓度较大不够5μl的用ddH₂O稀释成5μl/1μg的浓度)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl 2.5M CaCl₂，然后加入20μl 0.1M亚精氨(现配现用)，涡旋3min。

静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl 70％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入140μl 100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl 100％酒精，充分涡旋，以备使用。

实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25(参考文献：ChristensenAH,Quail P H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression ofselectable and/or screenable marker genes in monocotyledonousplants.Transgenic Research,1996,5:213-218)的质粒DNA与钨粉包裹；实施CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V与GUS基因共转化时，将含有CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V质粒DNA与含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。GUS基因与CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V进行共转化，Marker基因GUS转入的细胞也是CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经GUS染色后整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色细胞作为CERK1-V基因表达的细胞。

基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：0.1molL Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.0)，含10mmolL EDTA，5mmolL铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1％Triton X-100，20％甲醇，)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。

白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，细胞会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞，其吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(公知公用,Schweizer,Pokorny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment ofDefense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions.1999,12:647-654)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。

当单独转化GUS基因时，感白粉病小麦品种扬麦158中的吸器指数为62.58％；当GUS基因与CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V共转化感白粉病小麦品种扬麦158后，扬麦158的吸器指数显著下降至38.26％(附图3)。该结果说明，瞬间超表达CERK1-V可以显著地降低吸器指数，CERK1-V对小麦抗白粉病具有正向调控作用。

实施例4 CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V稳定遗传转化及基因功能研究

利用基因枪介导的遗传转化方法(邢莉萍.小麦/簇毛麦抗白粉病相关基因的转化及功能鉴定[D].南京农业大学，2007)将pBI220-CERK1-V转化感病品种扬麦158的幼胚愈伤组织。挑取预培养7d的约2500个扬麦158幼胚愈伤组织，轰击前在高渗培养基(MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上预处理6–8h，将CERK1-V基因超表达载体pBI220-CERK1-V通过基因枪轰击法转化到扬麦158愈伤组织中，轰击后在高渗培养基上继续培养16h。之后将愈伤组织转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+4mg/LBialaphos，pH5.8)，筛选培养4周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺l mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％，pH5.8)中，至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2d，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共86棵。提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用基因跨内含子内部引物P7(TCCGTCGCTGCCAACCATA，SEQ IDNO.9)和水稻内含子序列特异引物P8(GCGTCCTGTTTCGCCTTTC，SEQ ID NO.10)进行PCR扩增，鉴定阳性转基因植株。PCR程序：50-100ng/ul基因组模板，10μM的P7和P8各0.5μl；2.5μl10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg²⁺；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃45s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测，其中10株可以扩增736bp的目的条带，鉴定为阳性植株，株系编号依次为：OE-CERK1-T₀-1、OE-CERK1-T₀-10、OE-CERK1-T₀-22、OE-CERK1-T₀-23、OE-CERK1-T₀-26、OE-CERK1-T₀-34、OE-CERK1-T₀-40、OE-CERK1-T₀-44、OE-CERK1-T₀55、OE-CERK1-T₀-62(附图4)。提取了这10棵阳性植株的RNA，利用qPCR鉴定各个阳性植株中CERK1-V基因的表达情况。结果表明：OE-CERK1-T₀-1、OE-CERK1-T₀-10、OE-CERK1-T₀-22、OE-CERK1-T₀-40、OE-CERK1-T₀-44、OE-CERK1-T₀55、OE-CERK1-T₀-62这7棵转基因阳性植株的CERK1-V的表达量为扬麦158的4-12倍。OE-CERK1-T₀-23、OE-CERK1-T₀-26、OE-CERK1-T₀-34、，3棵转基因植株的CERK1-V的表达量为扬麦158的1.5-3倍(附图5)。

苗期白粉病抗性采用江苏南京地区田间采集的白粉病菌混合菌种，对所有PCR鉴定的T₀代阳性植株以及扬麦158的离体叶片进行白粉病抗性鉴定。苗期白粉病抗性鉴定标准采用“0-5级”白粉病抗性反应型的分级标准，0-1级为高抗、2-3级为中抗、4-5级以上为感病。成株期抗性采用江苏南京地区田间采集的白粉病菌混合菌种在田间接种T0代阳性植株以及扬麦158并进行白粉病抗性鉴定。成株期白粉病抗性鉴定标准采用“0-9级”白粉病抗性反应型的分级标准，0-2级为高抗、3-4级为中抗、5-6级为中感、7-9级以上为高感。苗期离体白粉病抗性鉴定以及成株期白粉病抗性结果表明：扬麦158在苗期和成株期都表现为高感，而OE-CERK1-T₀-1、OE-CERK1-T₀-10、OE-CERK1-T₀-22、OE-CERK1-T₀-23、OE-CERK1-T₀-26、OE-CERK1-T₀-34、OE-CERK1-T₀-40、OE-CERK1-T₀-44、OE-CERK1-T₀-55、OE-CERK1-T₀-62转基因阳性株系的抗性显著高于扬麦158(表1，附图6)。

表1

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一个簇毛麦CERK1-V基因及其所编码的蛋白和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1866

<212> DNA

<213> 簇毛麦(Haynaldia villosa)

<400> 1

atggaagctc cgctcctccc cctgctcctc ctcctcctgg ccgcggcggc ggccaccgcg 60

gcgagggacg gctgcacctc gggctgcgac ctcgcgctcg gctcctacta cgtcgcgtcc 120

aaccagaacg tcacctacat cgccgccctc ttcgggttct ccgactaccg agtgctcggc 180

aggtacaacc cggggatccg caacctcgac ttcgtcgccg ccggggaacg cctcaacgtc 240

tacttcccct gcccatgcct cgcgagcctg tctgacccgg cctccacctt cctcgccgcc 300

cccatcaact acaaagtcac caccggagaa acctacatca gcatcgccga caacttcaac 360

aacctcacca cccccgcctg gctgcaggcc accaacacct acccggccag taacatcccc 420

gacgtcggca ccgtcaacgt caccgtcaac tgctcatgcg gcgacgccgg aatctccacg 480

gaatacggcc tcttcctcac atacccgctc agagacagag agacgctggc ctccgtcgct 540

gccaaccata gcttctcgtc gccggagcag atggacctgc tcagaaagta taaccccggg 600

atggatggtg tcaccgggag cggcatcgtt tatatcccag ccaaagatcc gaatggaagc 660

taccttcctc tggaatcaca agggaaaaaa agttcaacgg gagcaatagc aggaggtgtt 720

gtggctggtg tagttgcact agtcctgggt gtcgtgttat tcttgtttta taggcgaaga 780

aaggcgaaac aggacgcttt gcttccatct tctgaagaat ctacccgtct agccagtgca 840

gtatccatgc aaaaggtgac accatcaagc agtcaagctg acggagcttc accagctgct 900

ggcattacag ttgacaaatc agtcgagttc tcatatgaag aactttttaa tgctacagaa 960

ggctttaaca taattcataa aattggacaa ggtggttttg gtgctgtcta ttatgctgag 1020

cttagaggcg agaaagctgc cataaaaaag atggacatgc aggctactca agagttcctt 1080

gctgagttaa aagttttgac acatgttcat catcttaatc tggtgcgctt gattggttat 1140

tgcacggaga gttctttgtt ccttgtctac gaatttatcg agaatggcaa cttaagccag 1200

catttgcgtg ggactggtta tgagcctctt tcttgggttg aaagagttca gattgcacta 1260

gattcagcaa gaggtcttga gtacattcat gagcatactg ttccagtgta catacatcgg 1320

gacatcaaat ccgcaaacat cttgatagac aagaacaccc gtgcaaaggt tgcagatttt 1380

ggtctaacaa aacttacaga agttggtggt ggtacatctt tgcaaacacg tgttgttggt 1440

acattcggtt acatgcctcc agaatatgcc cgatacggtg atgtttctcc taaggttgac 1500

gtctatgcct ttggtgttgt cctgtacgaa ctcatttcag ccaaagatgc cattgtccga 1560

tcagctgaat ctgccagtga ttcaaaggga ttggtttatc tgtttgagga ggctctgaat 1620

gcaccggatc cgaaggaagg cctcaagagg ctgatcgatc caaagctggg agacgattac 1680

cccatcgacg ccattctcaa gatgacgcac ctggcgaacg catgcacaca ggaggacccc 1740

aagctgaggc cgacaatgag atccgtggtg gtggcgctga tgacgctgtc ctccacgagc 1800

gagttctggg atatgaacgc cctctacgaa aacccgggct tggtgaacct catgtccggg 1860

agatga 1866

<210> 2

<211> 621

<212> PRT

<213> 簇毛麦(Haynaldia villosa)

<400> 2

Met Glu Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Thr Ala Ala Arg Asp Gly Cys Thr Ser Gly Cys Asp Leu Ala

20 25 30

Leu Gly Ser Tyr Tyr Val Ala Ser Asn Gln Asn Val Thr Tyr Ile Ala

35 40 45

Ala Leu Phe Gly Phe Ser Asp Tyr Arg Val Leu Gly Arg Tyr Asn Pro

50 55 60

Gly Ile Arg Asn Leu Asp Phe Val Ala Ala Gly Glu Arg Leu Asn Val

65 70 75 80

Tyr Phe Pro Cys Pro Cys Leu Ala Ser Leu Ser Asp Pro Ala Ser Thr

85 90 95

Phe Leu Ala Ala Pro Ile Asn Tyr Lys Val Thr Thr Gly Glu Thr Tyr

100 105 110

Ile Ser Ile Ala Asp Asn Phe Asn Asn Leu Thr Thr Pro Ala Trp Leu

115 120 125

Gln Ala Thr Asn Thr Tyr Pro Ala Ser Asn Ile Pro Asp Val Gly Thr

130 135 140

Val Asn Val Thr Val Asn Cys Ser Cys Gly Asp Ala Gly Ile Ser Thr

145 150 155 160

Glu Tyr Gly Leu Phe Leu Thr Tyr Pro Leu Arg Asp Arg Glu Thr Leu

165 170 175

Ala Ser Val Ala Ala Asn His Ser Phe Ser Ser Pro Glu Gln Met Asp

180 185 190

Leu Leu Arg Lys Tyr Asn Pro Gly Met Asp Gly Val Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ile Val Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Pro Asn Gly Ser Tyr Leu Pro Leu

210 215 220

Glu Ser Gln Gly Lys Lys Ser Ser Thr Gly Ala Ile Ala Gly Gly Val

225 230 235 240

Val Ala Gly Val Val Ala Leu Val Leu Gly Val Val Leu Phe Leu Phe

245 250 255

Tyr Arg Arg Arg Lys Ala Lys Gln Asp Ala Leu Leu Pro Ser Ser Glu

260 265 270

Glu Ser Thr Arg Leu Ala Ser Ala Val Ser Met Gln Lys Val Thr Pro

275 280 285

Ser Ser Ser Gln Ala Asp Gly Ala Ser Pro Ala Ala Gly Ile Thr Val

290 295 300

Asp Lys Ser Val Glu Phe Ser Tyr Glu Glu Leu Phe Asn Ala Thr Glu

305 310 315 320

Gly Phe Asn Ile Ile His Lys Ile Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ala Val

325 330 335

Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg Gly Glu Lys Ala Ala Ile Lys Lys Met Asp

340 345 350

Met Gln Ala Thr Gln Glu Phe Leu Ala Glu Leu Lys Val Leu Thr His

355 360 365

Val His His Leu Asn Leu Val Arg Leu Ile Gly Tyr Cys Thr Glu Ser

370 375 380

Ser Leu Phe Leu Val Tyr Glu Phe Ile Glu Asn Gly Asn Leu Ser Gln

385 390 395 400

His Leu Arg Gly Thr Gly Tyr Glu Pro Leu Ser Trp Val Glu Arg Val

405 410 415

Gln Ile Ala Leu Asp Ser Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Ile His Glu His

420 425 430

Thr Val Pro Val Tyr Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Ala Asn Ile Leu

435 440 445

Ile Asp Lys Asn Thr Arg Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Thr Lys

450 455 460

Leu Thr Glu Val Gly Gly Gly Thr Ser Leu Gln Thr Arg Val Val Gly

465 470 475 480

Thr Phe Gly Tyr Met Pro Pro Glu Tyr Ala Arg Tyr Gly Asp Val Ser

485 490 495

Pro Lys Val Asp Val Tyr Ala Phe Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Ile

500 505 510

Ser Ala Lys Asp Ala Ile Val Arg Ser Ala Glu Ser Ala Ser Asp Ser

515 520 525

Lys Gly Leu Val Tyr Leu Phe Glu Glu Ala Leu Asn Ala Pro Asp Pro

530 535 540

Lys Glu Gly Leu Lys Arg Leu Ile Asp Pro Lys Leu Gly Asp Asp Tyr

545 550 555 560

Pro Ile Asp Ala Ile Leu Lys Met Thr His Leu Ala Asn Ala Cys Thr

565 570 575

Gln Glu Asp Pro Lys Leu Arg Pro Thr Met Arg Ser Val Val Val Ala

580 585 590

Leu Met Thr Leu Ser Ser Thr Ser Glu Phe Trp Asp Met Asn Ala Leu

595 600 605

Tyr Glu Asn Pro Gly Leu Val Asn Leu Met Ser Gly Arg

610 615 620

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaagctc cgctcctc 18

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcatctcccg gacatg 16

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggagcaata gcaggaggt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgatcggaca atggcatct 19

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggatccat ggaagctccg ctcctc 26

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaggccttc tcccggacat gaggttc 27

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccgtcgctg ccaaccata 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgtcctgtt tcgcctttc 19

Claims

1.一、种簇毛麦CERK1-V基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1 所述的CERK1-V基因所编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的CERK1-V基因的超表达载体。

4.根据权利要求3所述的CERK1-V基因的超表达载体，其特征在于以pBI220载体为出发载体，将权利要求1所述的CERK1-V基因正向插入pBI220载体的BamHI和StuI酶切位点间所得。

5.权利要求1所述的CERK1-V基因在培育抗白粉病小麦品种中的应用。

6.权利要求3或4中任一项所述的CERK1-V基因超表达载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。