CN106754378A - 一种水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法 - Google Patents

一种水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法 Download PDF

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谭清群
杨学辉
陈小均
吴石平
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李定超
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明公开了一种水稻稻曲病菌长期干燥密闭保存方法，该方法的技术要上是利用稻曲病菌在完全干燥的稻谷胚乳中能长期存活的特性，采用稻谷作为载体，人工接种稻曲病菌到无菌谷粒上，让菌丝长满谷粒胚乳组织并在28℃条件下让谷粒完全干燥后，采用干燥保存。该方法的技术步骤如下：1)采用厚坦孢子单孢分离方法获得纯化的稻曲病菌菌株；2)浸泡谷粒，使胚乳完全吸满水，装试管，灭菌；3)接种至无菌谷粒上培养，使菌丝长满胚乳组织内部，直至谷粒完全干燥后，将试管保存在装有变色硅胶的干燥器中长期保存，用凡士林涂抹封闭。本发明的优点是：稻曲病菌保存时间超过5年；成活率高；菌种被污染率低；操作方便，占用空间少；成本低，不消耗能源；对环境无污染、无残留。

Description

一种水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法
技术领域
本发明涉及一种稻曲病菌的长期干燥保存方法，属于微生物的生物学特性与防治研究领域。
背景技术
水稻是最主要的粮食作物，长期受到水稻病害对产量和质量的影响。随着遗传背景相对单一的杂交水稻长期推广种植和氮肥的大量施用，稻曲病已经从过去的次要病害上升为主要的水稻病害，影响和制约着水稻产业的发展，稻曲病菌还能产生对人畜有毒的毒素，因此该病害的发生对水稻的产量和质量都有比较严重的影响。但由于水稻稻曲病菌的常规保存方法在长期保存过程中容易被其它微生物污染，存活时间短，制约了对不同年度间稻曲病菌生物学特性、遗传多样性分析、致病性变化特点的相关研究。
因此，建立一套稻曲病菌长期保存方法，可以将过去保存多年的稻曲病菌进行系统研究，探索不同年度间的稻曲病菌生物学特性变化特点、稻曲病菌的遗传变异趋势、以及不同年度间的病原菌致病性分化特点，从而为稻曲病的综合防治研究提供理论基础，保障水稻的产量和质量安全。
发明内容
本发明目的是提供一种水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法，从而能够长期保存稻曲病菌，以便为稻曲病菌的研究提供足够的样本。
本发明的技术方案：
本发明是一种水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法，它主要包括如下步骤：采用厚坦孢子单孢分离方法获得纯化的稻曲病菌菌株，将稻曲病菌接种到试管中的无菌谷粒上，将试管在恒温暗室中培养使菌丝生长布满谷粒及胚乳组织，待稻谷完全干燥后，将试管保存在装有变色硅胶的干燥器中，并用凡士林涂抹封闭。
优选的，先将稻谷浸泡于60～80℃的水中72h～96h，使稻谷胚乳充分吸满水，然后将稻谷装入15×100mm的试管中，用棉塞封口，在121℃高压湿热灭菌20min，冷确后再将稻曲病菌转接到稻谷上。
优选的，试管在恒温暗室中培养过程中，保持恒温暗室内的温度为28℃。
详细的，本发明的这种方法包括如下步骤：首先在恒温箱内将稻谷用60～80℃水浸泡72～96h，每12h换一次清水，使稻谷完全吸满水后将其装入15×100mm玻璃试管中，每管装40-50粒，体积为试管的1/4～1/5，用棉塞塞住试管口，经121℃高压湿热灭菌20min，冷却后将稻曲病菌接种到试管内的稻谷表面，然后搅拌使菌丝均匀分布于稻谷上，置于28℃的恒温暗室培养，每隔2～3天摇一次试管，待菌丝生长布满谷粒及胚乳组织，且谷粒完全干燥后将试管放于装有变色硅胶的干燥器中，用凡士林涂抹于干燥器口进行封闭。
本发明具有如下优点：稻曲病菌保存时间超过5年；成活率高；菌种被污染率低；操作方便，占用空间少；成本低，不消耗能源；对环境无污染、无残留。
因此，本发明的保存方法能够提高稻曲病菌菌种保存的时间，减少菌种被污染的问题，延长稻曲病菌的保存时间，降低稻曲病菌保存的工作量和成本。本发明使用后能使稻曲病菌长期保存，减少常规保存方法中稻曲病菌易被污染的问题，为开展不同年代的稻曲病菌研究提供了技术基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
1材料与方法
1.1实验材料
稻曲病菌标样从贵州省各水稻种植区采回，采用厚坦孢子单孢分离方法获得不同地方的稻曲病菌菌株；选择未霉变的稻谷，准备15×100mm的试管、干燥器、变色硅胶、凡士林和恒温培养箱。
1.1.2供试配方
每管装浸满水的稻谷40-50粒，干燥器(高220mm、直径300mm)、1只干燥器内装1kg变色硅胶、用于干燥器封口的凡士林。
1.2实验方法
首先用60～80℃水浸泡96～120h(置于恒温箱内)，使稻谷完全吸满水后将其装入15×100mm玻璃试管中，每管装40-50粒，体积为试管的1/4～1/5，用棉塞塞住试管口，经121℃高压湿热灭菌20min，冷却后将稻曲病菌接种到试管内的稻谷表面，然后搅拌使菌丝均匀分布于稻谷上，置于28℃的恒温暗室培养，每隔2～3天摇一次试管，待稻谷完全干燥后将试管放于装有蓝色的变色硅胶的干燥器(高220mm、直径300mm)中，用凡士林涂抹于干燥器口进行封闭。
2.结果与分析
实验于2012年1月实施，利用上述方法将稻曲病菌进行保存，然后分别于2013年1月、2013年12月、2014年12月、2015年6月、2015年12月、2016年6月和2016年12月分别对保存的菌株进行复活培养，明确各个保存时期的存活与被污染的菌株数量，其中，成活率分别为100.00％、100.00％、100.00％、100.00％、98.75％、98.13％和98.13％，被污染的菌株比率分别为0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.32％、0.32％和0.64％(表1)。
表1不同保存时期稻曲病菌菌株的污染与成活情况
以上结果表明，采用稻谷干燥密闭保存稻曲病菌的原料为稻谷、玻璃器皿，变色硅胶。成活期可以超过5年，菌株被污染率很低，操作方便，成本较低，，对环境无污染。
以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法，其特征在于包括如下步骤：采用厚垣孢子单孢分离方法进行稻曲病菌的菌株分离与纯化；浸泡谷粒，使胚乳充分吸满水，灭菌；将稻曲病菌接种到无菌稻谷上，用棉塞封口，培养使菌丝生长并布满稻谷及胚乳组织，直至完全干燥后保存于装有变色硅胶的干燥器中，用凡士林涂抹封闭，稻曲病菌在完全干燥的胚乳内可以长期存活。
2.根据权利要求1所述的水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法，其特征在于：先将稻谷浸泡于60～80℃的水中72h～96h，使胚乳充分吸满水，然后将稻谷装入15×100mm的试管中，用棉塞封口，在121℃高压湿热灭菌20min，冷确后转入稻曲病菌。
3.根据权利要求1所述的水稻稻曲病菌干燥密闭保存方法，其特征在于包括如下步骤：每试管40-50粒，体积为试管的1/4～1/5，接种稻曲病菌后置于28℃的恒温暗室培养，每隔2～3天摇一次，使菌丝完全布满谷粒胚乳组织，待稻谷完全干燥后将试管放于装有变色硅胶的干燥器中，用凡士林涂抹封闭。
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