CN106714855A - 原位组织工程 - Google Patents

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法布里雅尼·费恩·罗赫尔·达曼尼克
汤姆·拉维瑞森
马丁金·安东尼厄斯·约翰内斯·考克斯
安东尼厄斯·约翰内斯·拉贝尔林克
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Leiden Academic Hospital
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Abstract

本发明涉及原位组织工程，更具体地涉及旨在提供可用作例如血管代用品或在血液透析中作为插管部位的血管的组织结构的原位血管组织工程。特别地，本发明涉及围绕皮下植入合成杆的组织结构的形成。此外，本发明涉及生产所述合成杆的方法。

Description

原位组织工程
技术领域
本发明涉及原位组织工程领域，更具体地涉及旨在提供可用作例如血管、输尿管和/或血液透析过程中的插管部位的组织结构的原位组织工程。
背景技术
在动脉旁路手术和血液透析血管通路中，需要血管移植物。然而，由于先前所得或先前存在的血管疾病，自体血管并不总是可用的，并且由于感染、狭窄和血栓形成，合成血管通常具有差的通畅率。
因此，最近的方法旨在例如通过体外方法、使用随时间被宿主细胞和基质替代的支架或通过原位血管组织工程提供完全生物血管。
原位血管组织工程在20世纪70年代首次提出，使用所谓的火花芯轴(Sparksmandrill)来产生围绕多孔涤纶网形成的组织囊(Sparks 1969Ann Thorac Surg Aug；8(2):104-13；Sparks 1970Ann Surg Nov；172(5):787-94)。将这个芯轴(mandrill)在肌肉中植入了几个月。然而，移植物由于血栓形成和动脉瘤形成而大部分失效(Hallin 1975AmSurg Sep；41(9):550-4；Hallin and Sweetman 1976Am J Surg Aug；132(2):221-3；Roberts and Hopkinson1977Nov 5；2(6096):1190-1)。
其他小组也研究了原位组织工程方法，但该方法使用腹膜(Campbell et al1999Circ Res Dec 3；85(12):1173-8)或皮下袋(Sakai et al 2009J of BiomedicalMaterials Research Part B:Applied Biomaterials:Vol90B(1):412-410；Watanabe etal 2011J of Biomedical Materials Research B:Applied Biomaterials Vol90B(1):120-126)作为生物反应器。然而，腹膜内植入和随后的收集是相当有侵入性的，并引起粘连形成的风险，这可能阻碍成功的临床实施。此外，并非所有植入物都被包封了(Campbell etal 1999CircRes Dec 3；85(12):1173-8)，因此必须植入若干装置。Sakai和Watanabe的方法也留下了优化例如植入物和所产生组织的特性的空间。本发明规避和/或解决了与早期方法相关的一些问题，且目的在于改进原位组织工程(特别是原位血管组织工程)的方法。
发明内容
本发明涉及一种不同的方法，其中使用人或动物体的皮下空间作为生物反应器，在原位快速产生完全生物组织工程化血管。使用皮下空间作为生物反应器具有容易实现以及存在组织工程化血管所需的大多数组分(例如胶原、弹性蛋白、成纤维细胞和大血管网络)的优点。此外，在一些临床环境例如血液透析血管通路中，就是需要血管移植物的位置。
此概念利用针对合成模具(例如圆柱形聚合物杆)的异物反应，所述聚合物杆将引起炎症反应，导致其被组织结构包封。这种管状组织结构可以形成组织工程化血管的基础。
本发明人发现，通过调节植入材料特性，即材料类型、表面改性和生物活性涂层，可以改善皮下植入的合成杆周围的组织结构形成。与旨在引起尽可能少的组织反应的大多数研究相比，本发明的原位组织工程方法的目的在于故意引起显著的组织反应，这对细胞类型、基质形成、所产生组织的排列和分布有特定要求。
此外，本发明人克服了关于制造具有合格特性、用于人或更大动物(>50kg)、由聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物组成的大直径杆(例如30-100mm)的问题。使用由两个半部(halves)组成的模腔设计新的压模原理，所述模腔的两个半部可以分离以使杆无损移除。
详细描述
本发明提供了一种装置，其(至少部分或全部)采用直径为3-20mm的杆的形状，其中装置的表面包括能够引起异物反应的缓慢生物降解的材料或不可生物降解材料，其含量为例如以装置的重量计，至少0.5wt％、5wt％、10wt％或20wt％。外层的表面，即装置的(外)表面的均方根粗糙度(Rq)为至少100nm，优选至少125nm，更优选至少150nm。不排除Rq可以为至多300nm、500nm、1000nm、2000nm、5000nm或甚至更多。
如即将阐明的，表面材料不应当快速降解，并且当被皮下插入人体或动物体内时能够引起异物反应，即在将装置皮下插入人或动物体之后例如6周内，组织结构将包封该装置。在本发明中，缓慢生物降解或不可生物降解意指当存在于人或动物体的皮下空间时，在例如6周的时间内，少于10wt％的材料随时间降解。此外，装置可以完全由所述材料组成，或者只有装置的外层可以包括所述缓慢生物降解的材料或不可生物降解的材料。例如，外层可以包括占所述外层总重量的至少50wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％的缓慢生物降解的材料或不可生物降解的材料。在本发明中，术语“层”不旨在表示必须与装置的内部具有不同组成或以其他方式与装置的内部明显区别开的部分。该术语仅指装置的外面(外周)部分，比如具有1-20mm的厚度。例如，外层可以形成整个装置，但是也可以预见装置的芯是中空的或具有不同组成，其中所述芯被外层包围。在特定实施方案中，装置包括比PEOT/PBT300/55/45(稍后描述)更刚性(更不柔性)的内芯(例如，具有1-20mm的直径)以减少装置在使用过程中断裂的机会。
均方根粗糙度(Rq)可以使用例如PicoScan Controller 2500–QuadrexedMultimode(美国Molecular Imaging公司)经由原子力显微镜(AFM)测定，扫描尺寸为(约)100μm2(10×10μm)并使用模式。优选地，使用Nanoscope软件(版本：2002，Digital Instrument Veeco)通过调整不同的参数(即积分增益和比例增益)处理图像以优化表面扫描。
技术人员清楚，粗糙度分析可包括Ra、Rq和Rmax的测量(Gadelmawla et al 2002；Journal of Materials Processing Technology 123:133–145)。Ra是最普遍使用的。Ra是算术平均高度参数或中心线平均值，且被定义为“在一个采样长度上相对于平均线的粗糙度不规则性的平均绝对偏差。它沿着评估长度将所有峰和谷(孔)进行平均，给出表面的大致描述，并中和特异点。Rq是对应于Ra的均方根粗糙度参数。Rq代表“表面高度分布的标准偏差”，并且对偏离平均线的大偏差比Ra更敏感：
Rq可以使用扫描探针图像处理器和SPIPTM(版本4.2.2.0，或更新版本)软件来确定，其中可以分析即测量图像的表面粗糙度，例如，通过点击“分析粗糙度”来测量。如上所述，可以在100μm2的表面积上进行粗糙度测量。有关Rq测量的更多细节，请参见Gadelmawlaet al 2002；Journal of Materials Processing Technology 123:133–145。
此外，在本发明内，杆(形状)意指(大致为)圆柱体(形状)，其中尽管外周也可为椭圆形或另一弯曲形状，但优选圆形。而且，尽管外周形状优选对称，但外周形状不一定必须对称。可以进一步将杆(形状)在任何地方沿其纵向方向弯曲(例如具有S形)，和/或一个或两个纵向端部的边缘为圆形使得至少部分边缘(边)棱角较少。此外，杆形状可以包括在一个或两个端面中的凹部(或凹口)。还将阐明的是，装置作为一个整体不一定必须具有杆形状，只要装置的一部分具有杆形状即可。可以为每个患者制作定制杆，所述定制杆具有针对所需应用的形状(即长度和直径)。杆的直径决定了要获得的组织结构的内径。这样组织结构可以与患者的原生血管吻合。
优选地，能够引发异物反应的(表面)材料是(或包含一种或多种)聚合物，例如聚酯、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚酐、聚磷腈、聚羟基链烷酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯富马酸酯、聚对苯二甲酸酯或上述一种或多种的共聚物；或基于聚环氧烷和对苯二甲酸酯的共聚物，或更优选聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，后者优选由式A/B/C表示，其中
-A是指在共聚物反应中使用的初始聚乙二醇(PEG)的(平均)分子量，其为200-400，优选275-325，更优选290-310；
-B是指共聚物中聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)的重量百分比(wt％)，其为40-70，优选50-60，更优选53-57；以及
-C是指共聚物中聚(对苯二甲酸丁二醇酯)的重量百分比，其为30-60，优选40-50，更优选43-47。
最优选的PEOT/PBT嵌段共聚物是300/55/45(从荷兰格罗宁根PolyVation B.V.获得)。此外，材料优选不包含硅酮和/或(聚)丙烯酸酯。
该装置可以具有30-800mm的长度和/或2-100mm或3-20mm的直径，优选40-300mm或50-150mm的长度和/或6-10mm的直径。这些尺寸的优点是提供的组织结构将具有与人类自然血管相似的尺寸。
如前所述，可以根据其粗糙度(Rq)充分描述装置的外表面，因为粗糙度是在特定的细胞类型组成、基质形成、所产生组织的排列和分布的情况下引起所需异物反应响应的决定因素。然而，除了粗糙度(Rq)之外，装置的(外层)表面可以进一步通过其多孔结构来表征。所述表面可以具有能够如下定义的多孔结构：
-孔密度为每100μm2 10-80个孔，优选20-60个孔，更优选25-50个孔，甚至更优选每100μm2 35-45个孔；
-平均孔径为0.4-1.8μm，优选为0.6-1.3μm，更优选为0.8-1.0μm，甚至更优选为0.85-0.95μm。
孔密度可以通过对从各自表面随机选择的(至少)9个25000μm2(放大率500×)的部分中的孔数(表面中的微小的谷/孔)取平均值来测定，正如基于扫描电子显微镜图像(例如，使用Philips XL30ESEM-FEG SEM)所测定的那样。优选地，对具有至少0.025μm2的直径的孔进行计数。
类似地，平均孔径可以通过从对各自表面随机选择的(至少)9个25000μm2(放大率500×)的部分中找到的所有孔的直径取平均值来确定(例如，通过SEM)。对于孔密度和孔径，可以使用ImageJ 1.46r(或更新版本)分析图像以提供孔尺寸测量，优选通过应用阈值并进一步反转图像从而仅测量孔，其中比例尺线用作参照。优选地，平均直径为具有至少0.025μm直径的孔的平均直径。
此外，本发明的装置可以具有(外层)表面，该表面的润湿性特征在于根据捕泡法测定的接触角为至少75°，优选至少80°，最优选至少90°。捕泡法是本领域技术人员公知的，且涉及使用液滴形状分析测量2μL水滴与表面之间的接触角(参见实施例2)。
根据本发明将显而易见的是，所述装置(外层)表面所需的均方根粗糙度(Rq)、润湿性和/或孔可通过化学蚀刻获得，优选通过将所述装置表面暴露于卤化碳溶剂或有机溶剂(如氯仿和/或二氯甲烷)以获得所需特性，例如将装置浸入所述溶剂中。技术人员将清楚，装置外表面的至少一部分，不一定是整个表面，应当具有所述的Rq、润湿性和/或孔结构。
本发明特别优选的实施方案涉及一种装置，其包括在一个或两个纵向端部的30mm内、优选10mm内的凹部。优选地，装置的一个或两个端面包括凹部(例如参见图2B)。尽管这样的凹部最初作为制造误差出现，但是我们发现其可以有利地用于将装置缝合至装置所插入的皮下空间的(周围)组织，以避免装置的迁移。如在实施例1中可以看到的，在没有缝合装置的情况下，可能发生装置迁移并且在收获时装置不再在原位，即不再在装置所插入的皮下空间内。
换言之，所述凹部可用于缝合装置使得装置在预期的时间段停留在预期的位置。例如，针可以插入到凹部中并且容易地仅穿入装置直径的一部分。在没有凹部的情况下，所述针将必须穿入整个直径，或者穿入靠近装置边缘的部分，这可能造成不期望的装置损坏。
此外或可选地，装置的一个或两个纵向端部处的边缘(边)可以是圆形的，例如使得边缘(边)的至少一部分没有棱角或棱角较少(参见例如图2A)。当然，在这方面圆形不是指边缘的圆状或椭圆状外周形状，而是指从装置的一个或两个端面(基部)到其纵向表面的圆形过渡。这可以通过相应地调整生产该装置的方法中使用的模腔的杆形状来实现。已经发现以这种方式可以防止或减少患者褥疮溃疡的发生，并且可以减少装置从患者身体自然挤出的可能性。
在任选地可与前述实施方案组合的另一优选实施方案中，装置在一个或两个纵向端部(沿其纵向方向)的50mm以内弯曲，或优选40mm以内、30mm以内，或更优选20mm以内或10mm以内弯曲，优选其中该装置具有S形(沿纵向方向)，这意味着弯曲方向(基本)相反。当然，这可以通过调整生产该装置的方法中使用的模腔的杆形状来实现。所述弯曲和/或S形将导致具有类似形状的组织结构，该具有类似形状的组织结构的优点为当用于血液透析手术中的血管通路时，其可以更容易和牢固地连接到患者的动脉和/或静脉。
准备血管通路是开始血液透析之前的重要一步。血管通路是在透析期间血液被移除并返回的身体部位，即插管部位。为了最大化在血液透析治疗期间清洁的血液的量，血管通路应当允许每时间单位内的高血流体积。这可以通过使用本发明的用于将动脉连接到静脉的组织结构来实现。S形组织结构是有利的，因为组织结构的两个纵向端部的边可以更加容易且牢固地连接到动脉和静脉，如图10所示。这防止组织结构从动脉和/或静脉松动。
本发明的装置还可以任选地至少部分地涂覆有细胞外基质蛋白例如胶原和/或生长因子(例如TGF-β)，以便当装置被皮下插入人或动物体中时进一步调节组织反应。
本领域技术人员将清楚，本发明的装置适合于皮下植入。优选地，该装置不包括毒性物质，即导致急性或迟发性疾病的物质，或者已知导致这些疾病的患病率增加至少10％的物质。同时或可选地，当将该装置皮下插入人体或动物体内时，该装置能够引起异物反应，即当该装置皮下插入人或动物体内例如1-6周时，其将被组织结构包封。
虽然本发明特别关注(至少部分)呈杆形状的装置，但是其它形状也是可能的，例如片形(例如1mm、2mm、3mm、4mm或5mm厚)、球形或其它形状，使得装置在皮下空间中的植入产生具有所需形状的组织结构，例如类似于待替换的患者的(患病的)中空器官的中空组织结构，所述待替换的患者的(患病的)中空器官例如血管、输尿管、膀胱等。
本发明还提供用于生产该装置的方法，特别是具有特定表面粗糙度(Rq)的杆形状的装置。该方法包括以下步骤：
a)提供模塑设备，其包括：
-模腔，其至少部分地呈至少一个杆的形状，所述杆的直径为3-20mm，其中所述杆形状由至少两个模具部件(的U形内表面)限定；
b)任选地通过使用压制装置，使流体(例如熔融的、液体的)聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物填充至少一个杆形状的模腔的至少一部分；
c)使共聚物固化；
d)将所述至少两个模具部件与固化的共聚物分离以获得至少一个直径为3-20mm的杆形状装置；
e)将所述至少一个获得的装置暴露于氯仿和/或二氯甲烷5-15秒以获得至少一个直径为3-20mm的杆形状装置，其中所述装置包括聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，并且其中所述装置的外表面的均方根粗糙度(Rq)为至少100nm，优选至少150nm，甚至更优选至少175nm，最优选至少180nm。
在步骤a)中，提供模塑设备，例如其可以是压缩模塑设备，如实施例3和图1中的压缩模塑设备。模塑可以被视为使用称为模具的刚性框架来使液体的或柔软的原材料成型。与此相应，本发明的模塑设备具有模腔，该模腔至少部分地具有该方法的产品的形状，即直径为3-20mm，优选为4-15mm，更优选为6mm-10mm的至少一个杆形状。
从图1中可以看出，模腔可以包括多个杆形状的子腔，例如1-10、1-20或10-100个，或者图1的实施例中的恰好10个。这些杆形状的子腔可以连接到腔室，该腔室可用于提供模塑材料或在其中存储模塑材料，随后允许模塑材料由腔室流入或压入杆形状的子腔中，任选地通过使用与腔室相适的诸如冲头的压制装置。通过在设有液体或可模塑的模塑材料的腔室内沿着杆形状空腔的方向移动冲头，所述空腔将填充有模塑材料。
模腔的至少一个杆形状由至少两个(优选刚好两个)模具部件的U形内表面限定。换言之，所述模具部件的这些内表面至少部分地遵循(follow)杆形状的外周，优选地两个模具部件各自覆盖外周的40-60％，更优选地约50％。杆的纵向端部不需要由模具部件的内表面限定，即杆形状的纵向端部可以终止于(另一个)子腔中或可以是开放的。
在步骤b)中，允许流体聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物(PEOT/PBT，从荷兰格罗宁根PolyVation B.V.获得)填充至少一个杆形状的模腔的至少一部分。这可以通过例如加热共聚物到至少高于其熔化温度的温度以获得流体可模塑共聚物，然后使流体可模塑共聚物填充至少一个杆形状的模腔来完成，任选地通过使用诸如冲头的压制装置来进行上述操作。使用压制装置具有减少最终产品中气泡出现的优点。
优选地，聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物由式A/B/C表示，其中
-A是指在共聚物反应中使用的初始聚乙二醇(PEG)的(平均)分子量，其为200-400，优选275-325，更优选290-310；
-B是指共聚物中聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)的重量百分比，其为40-70，优选50-60，更优选53-57；以及
-C是指共聚物中聚(对苯二甲酸丁二醇酯)的重量百分比，其为30-60，优选40-50，更优选43-47。
最优选的PEOT/PBT嵌段共聚物是300/55/45(从荷兰格罗宁根PolyVation B.V.获得)。
在步骤c)中，使共聚物在模腔内固化。这可以通过使共聚物冷却至低于其熔化温度的温度来进行。
在步骤d)中，将至少两个模具部件与固化的共聚物分离以获得至少一个杆形状的装置。进一步优选的是所述至少两个模具部件不用于将模塑材料压至模腔中和/或在步骤d)之前不分离所述至少两个模具部件，因为这可以使用冲头来完成。该装置可以连接到另外的固化共聚物，该固化共聚物不一定是杆形的。
使用至少两个模具部件(每个都具有U形内表面)形成至少一个杆形状的独特优势是其允许移除至少一个装置而不对其造成损坏。如果杆形的腔是固定的，装置只能通过从其一个端部拉动或按压来移除，那么损坏所述装置的可能性会更大。
在步骤e)中，将至少一个获得的装置暴露于卤化碳或有机溶剂优选氯仿和/或二氯甲烷中，以上操作以获得所需特性(例如Rq)的方式进行和/或持续一段时间以获得所需特性(例如Rq)。这可以通过将装置浸渍、浸没或沉浸在氯仿和/或二氯甲烷中指定的时间来进行。这样将获得具有所需表面特性和直径的杆形状的至少一个装置，其中当皮下插入时，该装置能够引起异物反应。
在一个优选的实施方案中，所述装置完全由PEOT/PBT嵌段共聚物组成，或者包含相对于装置总重量至少70wt％、80wt％、90wt％、95wt％，甚至99wt％的所述材料。装置的外表面具有至少100nm的均方根粗糙度(Rq)，优选至少125nm，更优选至少150nm，甚至更优选至少175nm，最优选至少180nm，和/或至多300nm、1000nm或3000nm的均方根粗糙度(Rq)。
该方法允许生产至少一个装置，例如杆状合成模具，当其插入人或动物体的皮下空间1-6周时，将引起异物(或炎症)反应，导致组织结构包封模具。该组织结构可以形成组织工程化血管的基础。
本发明还提供了一种用于提供组织结构的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将本发明的装置插入人或动物体的皮下空间中1-6周，优选2-4周的时间，以在装置上形成组织结构；
b)优选从皮下空间移除装置以及任选地在其上形成的组织结构。可在从皮下空间移除之前或之后分离装置和组织结构；
c)优选地，用生物可降解片材覆盖所述组织结构；
d)优选地，将组织结构连接到静脉、动脉和/或人工肾(该步骤可以在步骤c)之前或之后)。
例如，步骤a)中，例如在上肢(上臂或前臂)中，形成约1cm的小切口后可形成纵向皮下袋，并且装置可插入所述袋中。可以闭合切口以防止感染，仅1-6周或2-4周后，可以通过例如制作一个切口来制作通向皮下袋的通路。然后，可以移除装置和任选地在其上形成的任何组织结构(步骤b)。因此，组织结构可能(原位)保留在皮下空间中，然后可以将组织结构的一端连接到例如动脉，另一端连接到例如静脉。
还提供了通过该方法获得的组织结构。
类似地，本发明提供了通过手术或疗法对人或动物体进行治疗中使用的物质，其中所述物质是PEOT/PBT，优选PEOT/PBT为300/55/45，更优选所述物质为本发明的装置(的形状)，其中所述使用包括以下步骤：
a)将所述物质插入人或动物体的皮下空间中1-6周，优选2-4周，以使组织结构形成在所述物质上；
b)优选从皮下空间移除所述物质和任选地在其上形成的组织结构。可以在从皮下空间移除之前或之后分离所述物质和组织结构。而且，这里也可以应用如上所述的步骤c)和/或d)。
如上所述的方法可产生中空管状的(分离的，即在人或动物体外的)组织结构，其特征在于所述组织结构的5μm厚的横截面具有以下免疫组织化学参数：
-相对于总面积的15-25％的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性面积，通过使抗α-SMA的抗体(从荷兰Dako公司得到，1:1000)可视化来测量；
-相对于总面积的90-100％的胶原蛋白阳性面积，通过苦味酸-天狼星红(picrosirus red)染色(例如Polysciences Inc试剂盒)测量；
优选：
-相对于总面积的0-10％的CD45阳性面积，通过使抗CD45的抗体(荷兰Immunologic公司，1:50，热诱导的0.1％胰蛋白酶抗原修复)可视化来测量；和/或
-相对于总面积的0-5％的CD68阳性面积，通过使抗CD68的抗体(例如AbD、Serotec、克隆MAC387，1:10)可视化来测量；和/或
-相对于总面积的50-70％的波形蛋白阳性面积，通过使抗波形蛋白的抗体(荷兰Immunologic公司；1：300，热诱导的蛋白酶K抗原修复)可视化来测量。
横截面优选取自组织结构的中间，其中横截面横切纵向方向。可以使用ImageJ图像处理和分析软件(版本1.33或更新版本，美国国立卫生研究院开发)进行定量，其中特异性染色区域的百分比(例如可视化的抗体特异性结合区域的百分比)可相对于横截面的总面积进行测定。基于表示所述横截面面积的至少10％的图像进行量化也是足够的。
组织结构的组成可以包含壁，所述壁包括周向排列的αSMA阳性、肌间线蛋白阴性的肌成纤维细胞，和周向排列的波形蛋白阳性、αSMA阴性的成纤维细胞；和细胞外基质，所述细胞外基质包括周向排列的I型和III型胶原以及糖胺聚糖，并进一步包括任意白细胞和/或异物巨细胞。在组织结构纵向长度的至少80％上壁厚度可以是0.5-5mm或1-4mm。
我们发现本发明的具有上述参数和/或组成的组织结构具有根据ISO7198准则(优选其中的第一方法)测定的至少1700mmHg，优选至少2000mmHg的平均爆裂压力，这对于植入动脉循环中而言是足够用的。此外，我们发现根据ISO 7198准则测定的缝合强度为至少2.5N，优选至少3N，更优选至少3.5N，并且我们发现根据ISO 7198测定的顺应性为至少5％/100mmHg，优选6％/100mmHg，更优选7.5％/100mmHg。不受理论的束缚，本发明人相信胶原在组织结构中的(高)交联水平允许具有高的平均爆裂压力和缝合强度。
组织结构可以转分化为功能性血管，这可以通过将组织结构暴露于血流和血压而引发。因此组织结构可以用作例如功能性血管和/或用作血液透析手术的插管部位。
还设想将组织结构用作输尿管(将尿从肾引导到膀胱的管)或尿道(将尿从膀胱引导到生殖器的管)。还可以预见，组织结构可用作膀胱和皮肤表面之间的导管，例如像Mitrofanoff手术要达成的目标一样(Mingin and Baskin 2003,Int Braz J Urol 29(1):53–61)。
优选地，组织结构在离一个或两个纵向端部的50mm以内弯曲，或优选40mm、30mm以内，或更优选20mm以内弯曲，优选地，其中装置具有S形。这通过使用特别调整的装置实现，该装置如前文所述在离一个或两个纵向端部的50mm以内弯曲，或优选40mm以内、30mm以内，或更优选20mm以内弯曲。
本发明还提供了用作(在通过手术或疗法对人或动物体进行的治疗中)血管的组织结构，优选地其中血管用作血液透析的插管部位(即血管通路)。还预见到(在通过手术或疗法对人或动物体进行的治疗中)用作动静脉移植物植入的组织结构。例如，这涉及治疗有需要的患者的方法，所述方法包括植入组织结构，优选皮下植入组织结构。独特的优势在于组织结构对于患者是自体的(供体和受体是相同的)。如果组织结构生长的地方在其预期使用的位置附近(例如，10cm、8cm、5cm、2cm以内或更小的范围内)，组织结构甚至可以是原位的。例如，为了替换患病血管(如在动脉旁路手术中)或创建用于血液透析的插管部位(即血管通路)而实现这一点。
用可生物降解的片材(例如从Xeltis获得的弹性聚合物，如厚度小于3mm、2mm或1mm的聚己内酯，即PCL)(至少部分地)覆盖组织结构可能是有利的。片材的厚度可以为200-800μm，优选300-500μm。同样参见图11。当组织结构用于患者承压的部位时，该片材可以给予组织结构进一步的支撑，以便进一步防止可能导致出血的结构撕裂。使用片材还可以刺激弹性蛋白形成。在本发明中，可生物降解是指当片材存在于人或动物体的皮下空间时会随时间降解，使得其可以在一段时间(例如1、2或3个月)内消失。
此外，设想组织结构可以通过例如(人造或聚合物)管连接到(可佩戴的)人造肾。这使得血液透析可在医院外进行，例如在家进行。此外，设想组织结构可以连接到外周动脉从而例如为患有外周动脉阻塞性疾病的患者(例如在腿中)创建动脉旁路移植物。
本发明的方法允许身体产生自己的组织工程化血管，得到了与例如由使用以接种有血管细胞的合成支架的体外方法组成的现有技术组织工程方法相比，费力较少且耗时短的方法。
附图说明
图1：传递模塑设备，其包括冲头(1)、室(2)、十个直径为8mm的杆形状的模腔(3)，其中所述杆由两个半模(4)的内表面限定。A：侧视图；B：没有冲头的俯视图，显示表示两个半模之间的边界的中间虚线。
图2：A：在纵向端部具有圆形边(边缘)的本发明的杆。B：在杆的纵向端部表面上具有凹部的杆。
图3：不同表面处理和曝光时间之前和之后PA300、PA1000和PCL的3D AFM图像(扫描尺寸为1μm2，CHCl3除外，CHCl3的扫描尺寸为25μm2)。
图4：不同孵育时间(1s、5s、10s)后氯仿蚀刻杆的SEM图像。比例尺：20μm(除了左上的比例尺为2μm)。
图5：附着到经历不同表面处理的PA300杆上的大鼠真皮成纤维细胞(RDF，左)和巨噬细胞(右)的DNA测定分析。
图6：(a)经过不同处理的杆的AFM粗糙度定量(扫描尺寸1μm时的Rq)。处理时间如下：X＝未改性；Ar＝氩30分钟；Ox＝氧5分钟；CHF3＝三氟甲烷2.5分钟+NaOH＝氢氧化钠10分钟；CHCl3＝氯仿10秒。每个经处理的杆的粗糙度增加倍数显示在其条状图的上方。(b)亲水处理(70-40°)由Ar、O2和NaOH组成，而疏水处理(85-110°)由CHF3和CHCl3组成)。(c)蛋白质吸收测定：未改性杆对预选的改性杆。
图7：A的量化：胶原的绝对量，B：α-SMA(即肌成纤维细胞)的绝对量，C：α-SMA的百分比，即与围绕未改性Pa300杆形成的组织囊中的肌成纤维细胞相比，围绕经改性(Ar 30分钟；Ox 5分钟；CHF3 2.5分钟；NaOH10分钟；CHCl3 10秒)和涂覆的杆形成的组织囊中的肌成纤维细胞。
图8：在猪中皮下植入氯仿处理的杆表现出了主要由胶原、肌成纤维细胞和残余炎性细胞组成的厚组织囊。
图9：将图8的组织囊作为颈动脉插入移植物植入猪中。血管移植术后4周，87％的移植物保持通畅。如图9所示，在组织学水平上，α-SMA阳性细胞的量显著增加。
图10：连接动脉(左，A)和静脉(右，B)的S形组织结构。箭头表示血流的方向。可以将插管透析针插入组织结构中。在优选的实施方案中，可以使用生物可降解片材(例如，由PCL制成)覆盖(S形)组织结构的外周。
图11：皮下放置杆形状的装置。数字描述：1.头静脉；2.杆形状装置；3.桡动脉；4.尺骨；5.桡骨。异物反应过程：a.蛋白沉积在装置上；b.粒细胞和巨噬细胞附着在装置上；C.成纤维细胞的流入；d.通过成纤维细胞合成胶原以及炎性细胞分解(resolution)。
实施本发明方法中使用的常规技术的方法对本领域技术人员是显而易见的。
实施例1原位血管组织工程
本实施例描述了产生自体的完全生物组织工程化血管(TEBV)的原位血管组织工程方法。研制了聚合物杆，其在植入时引起炎症反应，最终被管形纤维细胞组织囊包封，所述组织囊可形成TEBV的基础。通过调节植入材料特性，可以定制组织反应以优化组织囊形成。将由聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(PEOT/PBT)和聚乙二醇(PCL)组成的杆以及经气体等离子体处理、经化学蚀刻且涂覆有生长因子的杆皮下植入大鼠中，并测试其改变组织反应的能力。3周后，收获并分析周围形成有组织囊的杆。组织囊主要由周向排列的胶原和肌成纤维细胞组成。实际上，不同的植入材料导致组织囊形成的明显差异。通过改变植入材料特性，可以定制组织囊组成、细胞分布和组织排列，从而产生TEBV的合格基础。
材料和方法
杆的制作
采用快速原型装置(Moroni et al 2006Biomaterials Mar；27(7):974-85)(德国Envisiontec,GmbH)作为熔融挤出机制造直径为1.75mm、最小长度2cm、由弹性共聚物聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(PEOT/PBT，荷兰IsoTis OrthopaedicsSA)组成的实心圆柱形杆。在该共聚物的制造期间，可以改变PEOT/PBT的比例和所使用的初始PEG的分子量，使得能够调节材料性质例如润湿性(Deschamps et al 2002J ControlRelease Jan 17；78(1-3):175-86)和蛋白质吸附(Mahmood et al 2004Exp Cell Res Dec10；301(2):179-88)。简言之，将加载到注射器的PEOT/PBT颗粒加热至180-200℃。施加4-5巴的氮气以挤出熔融的聚合物。使用两种不同组成的PEOT/PBT：PEOT/PBT重量百分比为55/45(Polyactive/Pa300)和PEOT/PBT重量百分比为70/30PEOT/PBT(1000/Pa1000)，共聚物反应中使用的初始聚乙二醇(PEG)的分子量分别为300g/mol和1000g/mol。采用因其生物相容性而众所周知的聚-ε-己内酯(PCL)为对照使用熔融挤出机(Axon mini-extruder，瑞典Axon AB Plastmaskiner公司)制造相似尺寸的杆。将PCL粒料(Purasorb PC 12，荷兰Purac Biomaterials公司)加热至170℃并搅拌(0.6cc/转)直至PCL完全熔融。随后将其在25巴的压力下通过毛细管挤出以制造圆柱形杆。
植入材料的改性
为了进行氯仿蚀刻，将未改性的Pa300杆浸没在氯仿(荷兰Merck Millipore)中10秒，并剧烈空气干燥以使剩余的氯仿蒸发。然后在超纯水中洗涤杆，在42kHz下超声处理15分钟，两次，以确保完全除去氯仿，随后空气干燥。对于氧气等离子体处理，用100豪托的氧气在30W或100W下处理未改性的Pa300杆5分钟(反应离子蚀刻，Teske，荷兰特文特大学)。所有改性的和未改性的杆通过γ辐射(Isotron，荷兰)以>25kGy的剂量灭菌。此外，在无菌条件下于流动箱中，将无菌的100W氧处理的Pa300杆在TGF-β溶液中浸渍1分钟。TGF-β溶液由在无菌I型大鼠胶原(5mg/mL，英国Culturex公司)中混合的活化TGF-β3(英国R&D Systems公司)组成，得到的TGF-β浓度为10ng/mL胶原。作为对照，将类似的氧处理的Pa300杆在不含TGF-β的I型大鼠尾胶原中浸涂1分钟。将杆空气干燥并直接用于植入。
大鼠模型
将十五只13周龄的雄性Wistar大鼠(法国Charles Rivers)饲养在标准实验室笼中，Wistar大鼠随意摄取食物和水。所有操作在异氟烷吸入麻醉下进行。将4个杆植入每只大鼠腹部区域的皮下空间。植入5次作为对照的未改性的PCL杆，并且将所有未改性的PA300和Pa1000杆以及所有改性并经涂覆的Pa300杆植入9次。在约1cm的小水平切口形成后，形成纵向皮下袋并将杆插入该袋中。随后，使用4-0薇乔(vicryl)缝线(荷兰Johnson&Johnson公司)闭合切口。大鼠通过术前注射对乙酰氨基酚(perfalgan，200mg/kg)直接接受术后镇痛。此外，在手术后至多一天，将对乙酰氨基酚(2.7mg/mL)加入到饮用水中。三周后，收获在其周围形成有组织囊的杆，并处死动物。
组织囊的分析
将组织囊固定在4％多聚甲醛中，加工并包埋在石蜡中。制备每个组织囊两个部分的5μm连续横切片(cross-sections)用于组织学分析、免疫组织化学分析和形态计量分析。所有样品用苏木精-焰红染料-藏红花(haematoxylin-phloxine-saffron，HPS)常规染色。为了表征细胞外基质，每个组织囊的连续切片使用用于胶原的苦味酸-天狼星红、用于糖胺聚糖的阿尔新蓝(pH2.5)和用于弹性蛋白的weighert’s弹性蛋白染色。切片用茜素红染色以评估潜在的钙化。使用自发荧光显影弹性蛋白，蓝光激发弹性蛋白，并用光谱显微镜(Nuance Fx，美国)进行去混和(unmix)。使用明视野显微镜和偏振光分析苦味酸-天狼星红染色的切片以区分I型胶原和III型胶原。将组织囊的所有切片与天然大鼠主动脉中间层的类似切片进行比较。使用免疫组织化学来表征组织囊的细胞组成，采用抗α-平滑肌肌动蛋白的抗体(α-SMA，荷兰Dako公司；1:1000)表征肌成纤维细胞，采用波形蛋白(荷兰Immunologic公司；1:300，热诱导蛋白酶K抗原修复)表征成纤维细胞，采用肌间线蛋白(荷兰Immunologic公司；1:250，热诱导的0.1％胰蛋白酶抗原修复)表征收缩性平滑肌细胞，采用CD45(荷兰Immunologic公司；1:50，热诱导0.1％胰蛋白酶抗原修复)表征白细胞，采用Von Willebrandfactor(荷兰Dako公司，1:300，热诱导0.1％胰蛋白酶抗原修复)表征内皮细胞，并用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显影。如其他地方所述(Roy-Chaudhury et al 2007AmJ Kidney Dis Nov；50(5):782-90)，区分成纤维细胞、肌成纤维细胞和收缩平滑肌细胞。使用同种型抗体获得阴性对照。此外，在从组织囊挤出杆后，用亚甲基蓝对杆进行染色以确定是否有任何组织粘附到杆上。
组织形态学
使用全景载片扫描仪(匈牙利3D Histec公司)获得染色切片的明视野图像。使用ImageJ进行定量。使用苦味酸-天狼星红和α-SMA染色的切片分别定量总胶原面积和总肌成纤维细胞面积(μm2)。使用α-SMA染色切片的DAB染色面积(μm2)除以5μm2横截面载玻片的总组织囊面积来测量α-SMA阳性面积百分比。
统计分析
数据表示为平均值±SEM。所有数据采用SPSS用单向方差分析(ANOVA)试验进行分析。进行Tukey事后分析以比较所有不同杆的表面粗糙度灰度值和所有未改性杆的组织形态计量结果。进行Dunett事后分析以比较所有改性并经涂覆的Pa300杆与未改性的Pa300杆的组织形态计量结果。P值<0.05被认为在统计学上是显著的。
结果
植入材料
SEM图像证实所有未改性的杆具有完全平滑的表面，而通过氧气等离子体处理和氯仿蚀刻进行的表面改性确实导致表面形貌的显著改变，产生不同的均匀图案化的表面。而氯仿蚀刻导致形成0.5-5μm的孔以及一些罕见的10-20μm的较大的孔。氧处理导致尖峰，与30W氧气等离子体处理相比，100W氧气等离子体处理的深度更大。伽玛辐射不影响表面形貌(未给出数据)。在从组织囊挤出后对杆进行的亚甲基蓝染色显示没有组织残留在未改性杆上，几乎没有任何组织残留在表面改性并经涂覆的杆上(未给出数据)。
一般组织囊形成
一个Pa1000杆在收获时不再位于原位。在所有其他情况下，皮下植入后三周成功收获所有杆。杆由充分血管化的组织囊完全包封，在杆的边缘处具有更显著的组织反应。组织囊与周围皮下组织一体化，但可容易地收获且随后从杆上平滑地挤出。组织学显示围绕不同类型的杆形成的组织囊特别是在胶原和肌成纤维细胞含量的相对比例上具有可辨别的变化。总体上，组织囊的基质主要由周向排列的I型胶原和III型胶原和糖胺聚糖(GAG)组成，组成与天然大鼠动脉相当。然而，与天然血管相比，弹性蛋白仅以极少量局部存在。在细胞组成方面，组织囊主要由周向排列的α-SMA阳性、肌间线蛋白阴性的肌成纤维细胞组成。剩余的细胞主要是周向排列的波形蛋白阳性、α-SMA阴性的成纤维细胞。成纤维细胞/肌成纤维细胞比率在不同类型的杆之间不同。在所有组织囊中，仅存在很少的肌间线蛋白阳性的平滑肌细胞。CD45阳性的白细胞几乎不存在(<1％)，并且在接触表面处没有异物巨细胞形成。茜素红染色显示在所有组织囊中都没有钙化的迹象(未给出数据)。围绕组织囊的皮下空间中的胶原部分地与组织囊结盟(co-align)，形成具有松散排列的胶原、一些成纤维细胞和小血管的外膜层。
围绕未改性的杆形成的组织囊
首先，评价三种类型的未改性的杆在植入后影响组织反应的能力，此能力导致组织囊组成的显著差异(p<0.05)。尽管生物相容性PCL杆被具有少量肌成纤维细胞的、薄壁的、相对脱细胞组织囊包封，但Pa1000和Pa300杆都被主要由肌成纤维细胞组成的更厚的富含细胞的组织囊包封。与PCL相比，在Pa300(分别p＝0.048和p＝0.006)和Pa1000(分别p＝0.010和p＝0.013)杆周围形成的组织囊中绝对肌成纤维细胞面积以及肌成纤维细胞的百分比显著更大。在组织学和组织形态计量学方面，在Pa300和Pa1000周围形成的组织囊之间没有明显差异。然而，Pa300杆具有如下优点：其在植入期间不易碎，因此在收获组织囊期间不易破裂，而杆的破裂可损伤组织囊(Pa300相比于Pa1000杆)。因此对由Pa300组成的杆进行表面改性。
表面改性Pa300杆周围的组织囊形成
组织形态计量学显示，与未改性的Pa300杆相比，在所有改性杆周围形成的组织囊具有更大的壁厚，因此具有更高的胶原和肌成纤维细胞含量。如图7所示，对于每种类型的Pa300杆改性，这些量均不同。涂覆胶原的杆引起组织囊中最大的胶原增加(p<0.05)，而涂覆TGF-β的杆趋向于增加胶原的量(p＝0.07)。尽管在改性杆周围形成的组织囊中α-SMA(即肌成纤维细胞)的绝对量增加，但是涂覆胶原的杆和涂覆TGF-β的杆以及氧处理的杆中α-SMA(即肌成纤维细胞)的百分比与未改性的对应物相比较低。相比之下，氯仿蚀刻的杆形成了α-SMA(即肌成纤维细胞)百分比增加的组织囊(图7)。由于这些定量不能解释组织囊的不均匀性和形态，还评价了组织囊的整体外观和其成分分布。我们观察到不同类型的杆之间形态学上的显著差异。氧处理的杆形成了具有相当厚的壁但更松散地排列的组织囊。与未改性的杆相比，涂覆胶原的杆和涂覆TGF-β的杆都导致密集排列的厚组织囊。然而，与未改性的杆相比，肌成纤维细胞的相对比例较低，在整个组织囊壁中肌成纤维细胞相对随机分布。另一方面，氯仿处理的杆产生相当厚的组织囊，其具有均匀分布的壁厚度。此外，组织囊几乎完全由密集排列的均匀分散的肌成纤维细胞组成。
使用异物反应产生组织工程血管构建体
产生的组织囊主要由GAG、周向排列的胶原和肌成纤维细胞组成。即使诱发的反应本质上是炎症反应，组织囊中几乎不存在任何白细胞或异物巨细胞。这可能取决于植入时间的长度。异物反应是动态的，从由嗜中性粒细胞和巨噬细胞主导的急性炎症期开始，在几周内随着(肌)成纤维细胞的流入和基质形成，在更加纤维化的反应中炎症反应消失(resolves)。经过一段时间后，相当脱细胞的胶原组织囊保留下来。基于后者并与我们的结果相对应，三周的植入期对于在大鼠中获得基质和富含细胞的非炎性组织囊来说似乎是最佳的。
通过改变植入材料特性调节异物反应
本研究清楚地表明植入物性质可以在形态和组成方面有利地影响组织反应。与常规PCL相比，在Pa300和Pa1000杆周围形成的组织囊在组成上显著不同。但是通过表面处理和生物活性涂层获得了在组织的组成和形态方面更显著的差异。我们证明，与其未改性的对应物相比，氯仿蚀刻和氧等离子体处理的表面导致组织囊中肌成纤维细胞和胶原含量的增加。氯仿处理产生了粗糙度显著增加的图案化表面。植入物表面特性和形貌的后续差异影响在植入材料周围形成的组织的组成和形态。有趣的是，氯仿蚀刻的表面和氧等离子体处理的表面之间的形貌结构和粗糙度的明显变化引起组织排列的显著差异。虽然氧处理的杆导致厚的组织囊，但是松散的排列对血管构造体是不利的。相比之下，氯仿蚀刻杆的植入导致最均匀分布的、强壁的、胶原和成肌纤维细胞丰富的组织囊。因此，我们认为这些杆最有利于为TEBV产生合格的基础。
通过材料的生物活性涂层调节异物反应
除了纯粹的表面改性，改性的杆还用胶原和胶原/TGF-β涂覆。TGF-β诱导成纤维细胞向成肌纤维细胞分化。与未改性的杆相比，单独用胶原涂覆杆和用胶原/TGF-β涂覆杆都导致胶原形成和壁厚度的最大增加。然而，与单独的胶原涂覆相比，胶原/TGF-β涂覆没有导致显著不同的组织囊，这表明结果仅仅归因于胶原。尽管胶原涂覆的杆和胶原/TGF-β涂覆的杆导致最大的壁厚度，但是较低的肌成纤维细胞百分比及其随机分布使得在我们看来这些涂层与例如产生富含肌成纤维细胞、均匀分布的组织囊的氯仿处理的Pa300杆相比不太有利于作为血管组织工程的生物活性模具。
结论
我们得到的组织囊形成TEBV的基础，所述TEBV的基础一旦移植到脉管系统可能进一步重塑。事实上，肌成纤维细胞(存在于组织囊中的主要细胞类型)是具有收缩装置的可塑细胞，并且如果被刺激可以合成细胞外基质。重要的是，流动和循环应变是基质合成甚至肌成纤维细胞向平滑肌细胞分化的强大刺激因素。因此，当移植入脉管系统并暴露于高流动时，这些组织囊可能及时分化并向更加血管样的表型发展。
该研究说明，通过利用针对圆柱形聚合物杆的组织反应可以产生用于TEBV的管状基础。通过改变植入材料特性可以调整组织反应，从而为TEBV产生合格的基础。
实施例2不同表面处理后杆的表面表征
制作Pa300、Pa1000和PCL杆。简言之，将聚合物颗粒装载到不锈钢注射器中并通过固定在设备的移动X轴臂上的热固性盒单元在T＝180-200℃的温度下加热。在熔融态，通过加压帽将4-5巴的氮气施加到注射器。将纤维排列模型加载在Bioplotter计算机辅助制造软件(CAM，瑞士PrimCAM公司)上。选择外径(OD)为2.2mm的针以获得1.75mm的杆。采用氮气清洁所述杆。气体等离子体杆在真空室中孵育。使用Harrick等离子体清洁器(PDC-002；美国纽约Harrick Plasma Ithaca公司)在0.133mbar和高设置(740V DC，40mA DC，29.6W)下进行氩等离子体处理，处理时间分别为30、45和60分钟。使用反应离子蚀刻(RIE)系统(EtchRIE Tetske，Nanolab，特文特大学)在100毫托和30W下进行5分钟、10分钟和15分钟的氧和三氟甲烷处理。在1M和4M浓度下进行5分钟、10分钟和15分钟的氢氧化钠蚀刻。二氯甲烷或氯仿蚀刻的杆暴露1秒、5秒或10秒(浸渍)。在无机和有机蚀刻后，将杆用MilliQ水漂洗一次，并进一步超声处理2次，每次15分钟，以除去残余物。
原子力显微镜(AFM)-表面粗糙度和3D图像
为了进行AFM分析，将样品固定在具有双面胶带的磁盘上。经由AFM使用具有超锐TESP悬臂的Tapping 1模式(PicoScan Controller2500，美国Molecular Imaging公司)进行表面粗糙度分析，Tapping 1模式：42N/m、320kHz、2-5nm ROC，无涂层(Bruker AFM探针)。使用扫描探针图像处理器和SPIPTM(版本4.2.2.0)软件确定粗糙度测量结果(Ra、Rq和Rmax)。对于纳米尺度结构(X、Ar、O2、CF3和NaOH)，Rq测量在1μm2表面积上进行，对于微米结构(CHCl3)，Rq测量在10μm2的表面积上进行。记录聚合物表面的高质量三维(3D)图像，并在随机不同的表面位置重复三次以验证观察到的特性的再现性，并取其平均值。
接触角和x射线光子光谱
使用捕泡法通过静态水接触角测量进行润湿性测量。使用基于录像机的光学接触角测量仪OCA 15(德国菲尔德尔斯塔特DataPhysicsInstruments GmbH)进行测量。通过使用电子调节的Hamilton注射器和针在膜上施加水泡(2μL)来测定水接触角。使用SCA20软件(德国菲尔德尔斯塔特DataPhysics Instruments GmbH)计算接触角。随后，将杆转移到XPS室。XPS室(Omicron Nanotechnology GmbH)具有低于1×10-10毫巴的基础压力。使用单色AlKα(XM 1000)X射线源和EA 125电子能量分析仪进行测量。所有光谱在恒定分析器能量(CAE)模式下获得。XPS谱线由喷射电子的壳识别(1s、2s、2p等)。
细胞培养和增殖
将购自Tebu-bio(R106-05n，Cell Application，Inc)的新生大鼠真皮成纤维细胞(RDF)用包含α-MEM(Gibco)、10％胎牛血清(Lonza)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素(Gibco)的基础培养基培养。RDF在基础培养基中以3000个细胞/cm2的初始接种密度扩增并每2-3天补给一次。在用胰蛋白酶消化进行细胞接种前，在80-90％融汇下收获细胞。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得大鼠肺泡巨噬细胞细胞系NR8383，并保持在巨噬细胞培养基中，该培养基包括不含酚红的α-MEM，添加有L-谷氨酰胺(Gibco)、15％胎牛血清(Lonza)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素(Gibco)，最佳细胞接种密度为200000个活细胞/ml。通过将培养基转移到另一个烧瓶中进行继代培养。通过用细胞刮刀(德国Sigma-Aldrich)刮擦进行细胞收集。所有细胞实验在37℃下5％CO2潮湿气氛中进行。
成纤维细胞和巨噬细胞的单一培养细胞接种
将改性的和未改性的杆切成每个样品1cm的杆并用70％乙醇灭菌。将杆在培养基中预孵育4小时，所述培养基包括不含酚红的α-MEM，添加有L-谷氨酰胺(Gibco)、10％胎牛血清(Lonza)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素(Gibco)。将琼脂糖模具(3％wt/v)放置在杆的下面以防止细胞附着到48孔板上并用于最佳的静态细胞接种。将RDF(以50000个细胞的细胞接种密度)和巨噬细胞(以100000个细胞的细胞接种密度)接种在500μl体积中。用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Invitrogen Life Technologies)冲洗样品，并在第1天和第3天收集样品用于DNA测定，用亚甲基蓝(MB)和扫描电子显微镜(SEM)成像。
细胞增殖测定
使用CyQuant细胞增殖测定试剂盒(Molecular Probes)测量总DNA以评估细胞粘附和增殖。简言之，吸出培养基，并用PBS轻轻洗涤样品。然后将样品收集到500μleppendorf管中，并在-80℃冷冻。在冷冻-融化三次后，室温(RT)下向样品中加入250μl裂解缓冲液(1:20裂解缓冲液20×)，处理至少1小时，再加入裂解缓冲液Rnase处理1小时。随后，将细胞裂解物和CyQuant GR染料(1x)在白色96孔板中1:1混合，并在黑暗中孵育15分钟。使用分光光度计(VICTOR3Multilabel Plate Reader Perkin Elmer)分别在480nm和520nm的激发波长和发射波长下测量荧光。
亚甲基蓝染色、免疫染色和扫描电子显微镜
从细胞培养物样品(n＝4)中吸出培养基，用PBS洗涤细胞，并在室温下用新制备的10％甲醛的PBS溶液固定30分钟。用PBS冲洗后，将样品(n＝2)在1％亚甲蓝的PBS溶液中孵育1-2分钟，并再用PBS冲洗以除去非特异性染色。在Olympus SZ-III-立体显微镜中检查样品以观察样品上的细胞分布。对于其他固定样品(n＝2)，在用PBS冲洗后，用0.1％TritonX-100的PBS溶液的在4℃下透化15分钟，并在室温下用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。细胞用Vincullin-FITC(1:400)、鬼笔环肽-德克萨斯红(Phalloidin-Texas Red，1:100)和Dapi(1:100)染色，其间包括3×洗涤步骤。通过荧光显微镜(Nikon Eclipse E600)获得图像。然后，所有染色的样品(n＝4)经历70％-80％-90％-100％的脱水步骤，每步的孵育时间为30分钟。100％脱水后，将样品储存在浸没在100％乙醇中的组织袋中，并转移至临界点干燥器室(CPD 030临界点干燥器，Leica)。在4℃下，将100％乙醇与液体二氧化碳交换，液体二氧化碳在40℃下转变为气态。在1毫巴压力下排出二氧化碳气体。在除去所有气体之后，样品准备好在40mA的电流和100毫托的分压下进行30秒的金溅射。使用Philips XL30ESEM-FEG扫描电子显微镜(SEM)在10kV和10mm的工作距离下研究细胞的形态。
TGF-β1、IL-1β、IL-6和IL-10的酶联免疫吸附测定(ELISA)
在不同的点收集细胞培养基，并根据制造商的说明书(DuoSetELISA显影试剂盒，R&D Systems Europe Ltd.)使用ELISA测定法定量TGF-β1、IL-1β、IL-6和IL-10的细胞因子分泌。简言之，用每孔100μL捕获抗体包被96孔微孔板，并在室温下温育过夜。每个孔用洗涤缓冲液洗涤三次，并用封闭缓冲液封闭至少1小时。将100μL样品、标准品或对照品在室温下温育2小时。根据制造标准品制作标准曲线。然后洗涤该板，加入100μL检测抗体，并在室温下温育2小时。冲洗后，加入100μL链霉亲和素-HRP并在室温下温育20分钟。再次洗涤该板，并在室温下加入100μL底物溶液，孵育20分钟。最后，向每个孔中加入50μL终止溶液。使用酶标仪在450nm和540nm波长下进行测量。
用于胶原和弹性蛋白表达的Sircol和Fastin测定
通过胶原和弹性蛋白染色测定测量在培养4和7天后合成并沉积在杆上的弹性蛋白和胶原的量。使用冷酸胃蛋白酶(0.1mg/ml 0.5M乙酸)对样品(n＝4)进行胶原提取，并在4℃下放置过夜。在加入Sircol染料试剂之前进一步分离和浓缩胶原。根据基于苦味酸-天狼星红的比色SirColTM胶原染料结合测定试剂盒(Biocolor Ltd.)进行测定，并使用酶标仪在540nm下测量。首先将用于弹性蛋白定量的杆(n＝4)在100℃下加热1小时并用0.25M草酸提取α-弹性蛋白。使用Fastin弹性蛋白测定试剂盒(Biocolor Ltd)并使用酶标仪在513nm进行测量来进一步定量弹性蛋白。
统计分析
所有生化测定用一式三份的生物样品进行。除非图例中另有说明，否则用Tukey多重比较检验(p<0.05)通过双向方差分析(ANOVA)进行统计分析。误差条表示标准偏差。对于所有的图，以下限定均适用：*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。
结果
从图3可以看出：不同表面处理和曝光时间之前和之后PA300、PA1000和PCL的3DAFM图像(扫描尺寸为1μm2，CHCl3除外，CHCl3的扫描尺寸为25μm2)。图5：附着到PA300杆上的大鼠真皮成纤维细胞(RDF，左)和巨噬细胞(右)的DNA测定分析。未改性(X)杆经受氩等离子体处理30分钟、45分钟和60分钟(Ar30-45-60，从左到右的柱)、氧气或三氟甲烷等离子体处理2.5分钟、5分钟、10分钟(O2 2.5-5-10，CHF32.5-5-10，从左到右的柱)。其它未改性的杆使用1M或4M浓度的氢氧化钠湿法蚀刻5至10分钟(NaOH：1M：5-10，NaOH：4M：5-10，从左至右的柱)或使用氯仿或二氯甲烷湿法蚀刻1秒、5秒或10秒(CHCl3：1-5-10s，CH2Cl2-10s，从左到右的柱)。第3天时增加的倍数可以在单个柱上方看到。除了CHF3 5-10样品，所有处理的RDF附着均在统计学上有所增加。在Ar、Ox和CHCl3处理后巨噬细胞附着在统计学上有所增加。星号(*，P<0.05)表示每种处理类型的最佳参数。因此，在所有表面改性的杆中观察到细胞粘附的增加，而与其它聚合物类型相比，Pa300显示出最显著的增加。
从图6可以看出：(a)AFM粗糙度定量(扫描尺寸为1μm时的Rq)。处理时间如下：X＝未改性；Ar＝氩30分钟；Ox＝氧5分钟；CHF3＝三氟甲烷2.5分钟+NaOH＝氢氧化钠10分钟；CHCl3＝氯仿10秒。每个处理杆的粗糙度增加倍数显示在其柱的上方。(b)亲水处理(70-40°)由Ar、O2和NaOH组成，而疏水处理(85-110°)由CHF3和CHCl3组成)。(c)蛋白质吸收测定：未改性杆对预选的改性杆。改性杆中的蛋白质吸收通过未改性杆中的蛋白质吸收来归一化，从而显示不同处理之间的倍数差异。蓝色星号(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)表示与未改性杆(X)相比的统计学上显著的值，黑色星号表示每种处理间的相互比较。
结果进一步表明，CHCl3处理(10秒)的杆提供了最大量的TGF-β1、IL-β1、IL-6和IL-10，并在递送增加的胶原和弹性蛋白分泌间具有理想的平衡，而这种平衡决定了组织生成和功能的最终结果。对未改性杆和预选的改性杆的XPS测量显示可以看到氧含量2倍增加的组(Ar、Ox、NaOH和CHCl3)和5倍减少的组(CHF3)。
实施例3概念研究在猪中的证明
对于猪模型，需要大直径PEOT/PBT 300杆(4.2mm)。不幸的是，使用快速成型(例如使用Bioplotter装置，Envisiontec GmbH)不可能生产这些大直径杆。熔融挤出产生了不期望的宏观表面粗糙度，因而也是不利的。压缩模塑似乎是最好的生产方法，其中将聚合物粒料放置在模腔中，之后通过顶部力闭合此腔，将模具加热至高于聚合物的熔点的温度。然后可以在模具冷却后移走产品。
在预实验中，使用两个加热夹具、热电偶和具有温度设定点和读数的控制装置直接加热单腔压缩模具。在短时间范围内，聚合物熔融并流过模腔。然而，由于PEOT/PBT材料的高粘性，无法在不损坏杆的情况下移走杆。因此，设计了新的压缩模具原理，其使用由两个可彼此分离的半部组成的模腔以允许杆的无损移除(参见实施例3)。
按照上述方法制作的PA300杆。随后，这些杆按照与植入大鼠中的较小杆相同的处理方法用氯仿处理10秒。在猪中皮下植入这些棒显示出更厚的组织囊，其主要由胶原、肌成纤维细胞和残余炎性细胞组成(图8)。这些组织囊的机械评估显示平均爆裂压力>2000mmHg，足以植入动脉循环中。接下来，将这些组织囊作为颈动脉插入移植物植入猪体内。血管移植术后4周，87％的移植物保持通畅。在组织学水平上，α-SMA阳性细胞的量大大增加(图9)。令人惊讶的是，在血管移植后4周，组织囊壁大部分由肌间线蛋白阳性平滑肌细胞填充。插管研究显示移除透析针后平均止血时间<2分钟。
实施例4支撑片材
制作由聚ε-己内酯(PCL，荷兰Purac Biomaterials)组成的外部静电纺丝片材，其纤维厚度为10±2μm，孔隙率为90±3％且总厚度为约400μm。使用配备有50N测力传感器的单轴拉伸台(Mecmesin，MultiTest1-i)测量440μm厚的γ-灭菌片材(n＝3)的拉伸强度。以10mm/min的速度拉伸样品，记录时间、位移和力。杨氏模量由应力/应变曲线的线性部分确定。作为参考，测量了绵羊肺动脉的样品(n＝18)。使用>25kGy的γ辐射(荷兰SynergyHealth)对杆和片材进行灭菌。使用SEM评价γ辐射对氯仿蚀刻的杆和PCL片材的表面的影响。与肺动脉的1Mpa拉伸强度相比，我们发现PCL片材(n＝3)的拉伸强度为9MPa。通过使用片材覆盖组织结构，即将片材固定在组织结构周围，该片材可用于支撑本发明的组织结构。

Claims (15)

1.至少部分为杆形状的直径为2-100mm的装置，其中所述装置包括能够引起异物反应的材料，并且其中所述装置的表面的均方根粗糙度(Rq)为至少100nm，优选至少150nm。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述能够引起异物反应的材料选自聚酯、聚碳酸酯、聚(原酸酯)、聚磷酸酯、聚酐、聚磷腈、聚羟基链烷酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯富马酸酯、聚对苯二甲酸酯或上述一种或多种的共聚物；或聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，其优选由式A/B/C表示，其中
-A是指在共聚物反应中使用的初始聚乙二醇(PEG)的分子量，其为200-400，优选275-325；
-B是指共聚物中聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)的重量百分比，其为40-70，优选50-60；以及
-C是指共聚物中聚(对苯二甲酸丁二醇酯)的重量百分比，其为30-60，优选40-50。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的装置，其中，所述装置的外表面具有孔，其中优选
-孔密度为每100μm2 10-100个孔；和/或
-平均孔径为0.3-2.0μm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的装置，其中所述装置的外表面具有以通过捕泡法测量的至少75°的接触角为特征的润湿性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的装置，其中所述均方根粗糙度(Rq)、润湿性和/或孔可通过化学蚀刻获得，优选通过将所述装置的表面暴露于卤化碳或有机溶剂优选氯仿和/或二氯甲烷获得。
6.根据权利要求1-5所述的装置，其中所述装置包括在一个或两个纵向端部的30mm以内优选10mm以内的凹部，和/或其中所述装置的一个或两个纵向端部的边缘是圆形的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的装置，其中，所述装置在一个或两个纵向端部的50mm以内优选30mm以内弯曲，优选其中所述装置具有S形。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的装置，其中所述装置至少部分地涂覆有细胞外基质蛋白和/或生长因子。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的装置，其中所述装置具有30-800mm的长度和/或3-20mm或4-15mm的直径，优选50-150mm的长度和/或6-10mm的直径。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的装置，其中所述装置适于皮下植入和/或其中所述装置在皮下插入人体或动物体内时能够引起异物反应。
11.用于制造装置的方法，其中所述方法包括：
a)提供一种设备，其包括：
-模腔(2,3)，其至少部分为至少一个杆的形状，所述杆的直径为3-20mm，其中所述杆形状由至少两个模具部件(4)的U形内表面限定；
b)使流体聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物填充至少一个杆形状的所述模腔(2,3)的至少一部分，任选地通过使用压制装置(1)进行；
c)使共聚物固化；
d)将所述至少两个模具部件(4)与固化的共聚物分离以获得至少一个直径为3-20mm的杆形状装置；
e)将至少一个获得的装置暴露于氯仿和/或二氯甲烷5-15秒以获得至少一个直径为3-20mm的杆形状装置，其中所述装置包括聚(对苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，并且其中所述装置表面的均方根粗糙度(Rq)为至少100nm，优选至少150nm。
12.用于提供组织结构的方法，其中所述方法包括以下步骤：
将权利要求1-10中任一项所述的装置放置在人或动物体的皮下空间中1-6周，优选2-4周，以在所述装置上形成组织结构。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法还包括用生物可降解片覆盖所述组织结构的步骤。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述组织结构连接到静脉、动脉和/或人工肾的步骤。
15.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括采用所述组织结构作为输尿管、尿道或血管的步骤，优选地其中所述血管用作血液透析的插管部位。
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