CN116536246B - 三维人工管状组织及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种三维人工管状组织及其制备方法与应用，属于组织工程技术领域。本发明方法包括以下步骤：(1)可卷曲支架的制备；(2)支架上种植细胞；(3)卷曲成三维管状结构并进行体外培养。本发明根据不同的管状组织结构设计支架的三维拓扑结构，实现细胞的三维立体生长，能够使得种植的细胞直接在三维拓扑结构中实现优良的三维立体生长效果，并使得支架在卷曲过程中，每一周卷曲的支架即可作为当前细胞组织提供足够的组织厚度，使得同种组织间不会存在空腔，细胞可以进行更好的黏附和生长。本发明方法很好解决了现有人工三维管状组织存在的无法消除细胞层之间的空腔，容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，以及存在引起动脉瘤的风险。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种三维人工管状组织及其制备方法与应用。
背景技术
组织工程(tissue engineering)是通过材料工程学和生命科学来研究生物组织的结构、功能和生长的机理，以期开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门交叉学科。组织工程在生物医学方面极具发展前景，实现受损组织的修复和再生是组织工程的主要目标，基于此，如何在体外培养出具有高度仿生结构的细胞支架结构物，并保证其在移植到体内后能够顺利重建出具有优良结构和功能的人工组织和器官，成为这门学科的关键。
人体内广泛存在着具有管状结构的生物系统，主要包括血管系统、消化系统、呼吸系统、神经系统和生殖系统。常见的管状组织有气管、血管、淋巴管、食道管、神经导管、尿道管、肠道和生殖道等，这些中空的器官和组织驱动着身体的各种功能，发挥着各自不同的功能。因此，三维人工管状组织也存在各种各样的结构和功能，利用组织工程构建各类仿生管状组织时，需要考虑各种管状组织的结构差异和功能差异。
为了更好制备出各种具有类似真实结构和功能的仿生人工管状移植物，首先需要对各种人体管状组织和器官的结构进行全面了解。以下主要从血管系统、消化系统、呼吸系统和神经系统进行分别介绍。
血管系统的主要作用是将血液以相对较高的速度运输到全身，对血管壁产生显著的流体剪切应力。血管主要由内皮层、中膜层和外膜层三层被膜构成，其轴心为中空的腔体。血管内皮具有相对的渗透性，允许生化因子在某些疾病状态下通过血管壁甚至细胞运输。血管中膜由周向致密的平滑肌细胞(VSMCs)和弹性蛋白组成，其主要功能是承受血液流动时造成的扩张力及冲击力。血管外膜主要由胶原蛋白和成纤细胞组成，该层为疏松的结缔组织，其功能为包裹血管和支撑血管，同时赋予血管一定的抗张强度。血管中的胶原蛋白赋予其一定的强度，弹性蛋白使血管富有弹性。血管大小从直径只有几微米的毛细血管和微血管到直径可达30mm的静脉和动脉。小的毛细血管，如构成血脑屏障的毛细血管，只由一个细胞组成，包裹在自身上形成内部管腔。因此，血管的不同管状直径及结构差异使得组织工程血管的构建变得较为复杂，目前主要制备出了大口径的人工血管组织，而小口径的人工血管组织仍有待进一步攻克。
消化系统主要是胃肠道，胃肠道的每个部分都由四层组成，从管腔内层开始，包括黏膜、黏膜下层、固有肌层和浆膜。黏膜包含肠上皮细胞，具有吸收、分泌和保护功能。肠上皮是一个紧密的屏障系统，可以将管腔内部内容物与周围组织隔开，肠上皮组织具有复杂的3D结构，与管腔突出(称为绒毛)和中间内陷(称为隐窝)，这种3D结构使内部表面积最大化，有助于营养的吸收。黏膜下层有一系列的免疫细胞、神经和淋巴细胞，这一层被固有肌层包围，它通过肌肉细胞提供蠕动泵，执行肠道运动的关键功能。最外层是浆膜(或外膜)，它在胃肠道周围形成一个屏障。肠道还拥有一系列复杂的神经，称为肠神经系统，包括两个平行的神经丛、粘膜下神经丛和肌肠神经丛。因此，胃肠道的复杂结构进一步使得人工消化道组织的设计变得极为复杂化。
呼吸系统包括上呼吸道和下呼吸道，其中气管是吞咽、说话和呼吸的基础，位于上呼吸道(鼻腔、咽喉、咽部)下方，是下呼吸道(气管、支气管、细支气管、肺泡)的一部分。气管主要由以下四层组成：粘膜、粘膜下层、透明软骨和外膜。粘膜含有假分层上皮，排列在管腔内，包含多种细胞类型。粘膜下层是结缔组织层，包含粘膜下腺体，有助于粘液的分泌。软骨层由马蹄形透明软骨环组成，纤维弹性组织与之连接，纤维弹性组织后方由纵向定向的平滑肌组成的膜状结构闭合。最后，外膜由结缔组织组成，软骨和外膜层都是形成气管独特结构和力学特性的基础。外膜还包含许多其他类型的细胞，如成纤维细胞、脂肪细胞、神经和与血管系统的连接，这是满足血液、营养和代谢需求所必需的。与血管系统和肠道的体外模型不同，气管容易受到感染、狭窄、塌陷或癌症导致的一系列气道紊乱的影响，到目前为止，气管组织工程主要关注用于气管置换的可植入支架。
神经系统对人体至关重要，负责机体生理功能活动和内环境的调节，分为中枢神经系统和周围神经系统。中枢神经系统主要为人体的综合行为提供指令；周围神经系统主要指导人体感知和运动。神经系统受损将会造成视觉、听觉、嗅觉等感知能力的丧失，或是咀嚼、行走、抓握等运动能力的丧失，以及痴呆、眩晕、失忆等意识障碍，会对人体健康带来极大冲击。构成神经系统的主要成分是神经组织，而神经组织由神经元和神经胶质细胞组成。与生物体内普通细胞不同，神经元的长短不一，从几微米到一米不等，该现象归因于神经元的两个特殊突起结构(轴突和树突)。神经胶质在神经组织中的占比较大，细胞体也有不规则突起，其主要作用为支撑神经元、信号绝缘、提供营养和保护等。整个神经呈现出三层结构，神经截面呈现扁平状。因此，要实现组织工程神经支架的高度仿生，首先要从模拟神经组织的组成结构开始。
虽然人类对各种生命系统和组织早就有所了解，然而人类在体外培养细胞并尝试构建人工组织和器官仍然经历了漫长的发展历程。自从1885年Willhelm Roux从鸡胚中分离细胞，就首次建立了体外细胞培养的思路。起初传统的细胞培养方法一直是在二维平面上培养，并经历了很长一段时间的发展。然而人们发现，这种细胞单层培养方式，由于体外环境的改变，细胞增殖过程中逐渐丧失了原有的性状，和体内的情况有所不符，在三维组织中生长的细胞与单层结构细胞、悬浮细胞有着明显的差别。
大量研究表明，细胞在真实三维组织中的环境和行为要比二维平面上更为复杂。与二维平面培养相比，三维立体培养的细胞在形态学、生物化学、蛋白质、基因表达等很多方面都有高度复杂性，体外三维培养环境比二维培养环境更有利于细胞功能的保持和发挥，让细胞在空间立体环境下生长，能够更接近于体内生长模式，更有利于形成与体内组织类似的结构，从而发挥其功能。因此，细胞的三维培养技术应运而生，到目前为目已经经过了几十年的发展。
三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture，TDCC)是指将具有三维结构的不同材料载体与不同种类的细胞在体外共培养，使细胞能够在载体的三维结构中生长和迁移，最大程度地模拟体内细胞生长环境，使细胞更接近于体内生长模式。在20世纪上半叶，学者Holtfreder及其同事创造性的建立了体外三维细胞培养方法，为后来的三维培养技术奠定了基础。到20世纪50年代，学者Moscona及其同事率先采用了三维培养方法来研究癌细胞的增殖、分化和聚集。近几十年来，三维培养技术得到了广泛研究和发展，并已经大量应用于肿瘤研究领域。
人工组织的构建一般涉及三大要素：种子细胞、支架材料和细胞与材料的体外构建。然而，由于真实人体管状组织的生理结构十分复杂，种类也较多，各种管状组织发挥着不同的功能，因此需要结合各种因素才能产生所需组织的近似模型，这对人工管状组织的开发带来了极大的挑战。
首先，必须考虑细胞的来源和类型，任何管状系统都需要上皮细胞的来源，然而这些细胞的确切行为取决于所涉及的不同组织。上皮细胞通常与产生细胞外基质(ECM)的细胞如成纤维细胞或平滑肌细胞共同培养，但即使是基质生产细胞的类型也会因应用的不同而不同。例如，气管需要使用软骨细胞或沿软骨形成途径分化的间充质干细胞。另一方面，不同的组织也需要不同的支持细胞，例如，原生肠上皮含有分泌粘液的杯状细胞，原生血管和肠道都有一层肌肉组织，需要获取适当的肌肉细胞。
其次，支架的设计同样具有挑战性。首先需要创建一个支持细胞生长的结构，然后才能创建所需的组织，且不能影响合成后的整体功能。这些挑战在管状系统的设计中尤其突出，管状支架不仅需要为细胞的营养获取、生长增殖和分化代谢提供必要的三维支撑结构，还需要为细胞提供适当的化学、形态和拓扑结构信息，以引导细胞形成目标功能组织，另外还需要为细胞分泌细胞外基质并最终形成相应组织或器官提供良好的生理微环境。因此，管状支架需要具备适当的孔径和孔隙率以为营养代谢物质的输送和种子细胞的长入创造有利条件，并具备一定的力学强度，以保证再生过程中的新生组织能够保持适当的形态，使其不易为外力所破坏，且不对周边原有组织造成机械损伤。此外，支架材料本身还应该广泛易得并具备较好的生物相容性、不易引起凝血、炎症和免疫排斥等不良反应，并具有一定的可灭菌性、良好的可塑性和适宜的降解速率以适应不同组织和细胞的生长和增殖速率，从而为组织的再生提供足够的空间。这无疑为组织工程支架的开发带来诸多困难。
第三，细胞与支架材料之间的结合也是极为困难的，其原因主要在于：支架内存在空气、支架内存在界面力和表面张力、支架材料具有亲疏水特性以及支架形状复杂等，这些结构导致种植的细胞在支架上分布不均匀，种植位置不可控，种植效率低等问题。另一方面，管状组织的复杂结构导致细胞在支架上的生长变得更为困难。例如，上皮或内皮屏障的形成和持续完整性确保了必需满足营养物质和代谢副产物的选择性渗透，同时防止有害或致病化合物的进入。如果没有成功的屏障形成和对其特性的描述，这些模型的功能甚至细胞生存都将受到限制。
随着组织工程研究的不断发展，人们发现，管状组织虽然功能各异，但在结构上也有统一的特征。在这些管状组织的管腔内部有一组形成屏障的细胞，称为上皮细胞(血管系统中为内皮细胞)，其作用是将管腔的内部内容物从周围组织和器官中分离出来，同时允许选择性的渗透和运输穿过上皮细胞。基于这一点，在生产适用于不同组织工程应用的管状支架时，首先需要产生完整的管状开口和形成半透性上皮或内皮。
管状支架的首要要求是能够形成相邻的上皮或内皮内衬，采用细胞在二维(2D)非多孔表面或在可注射介质(如水凝胶)中均匀播种是最有效的途径。然而，管状支架通常是三维的，而非二维的，因此在3D表面上均匀播种细胞显得十分必要。有研究人员将细胞播种在平面膜上，然后将这些平面膜卷曲成管状；也有研究人员采用动态方法，依靠细胞通过旋转或加压驱动均匀地附着在周围的壁上。然而由于支架的孔隙结构使得相邻上皮的形成更为困难。另外一些研究通过分层方法将产生ECM的细胞或沉积细胞填充回孔，以辅助上皮细胞的形成；许多植入驱动的研究也依赖于体内的细胞浸润，然而这些方法都存在一定的局限性。
经过20余年的发展，组织工程支架的制备已获得了长足的进步，人们基于管状组织结构的特点，开发出了各种方法来生产管状支架，包括有纤维粘结法(Fiber bonding)、溶剂浇铸-颗粒沥滤法(Solvent casting/particulate leaching)、相分离法(Phaseseparation)、原位聚合法(Site polymerization)、乳化/冻干法(Emulsion freezedrying)、气体发泡(Gas foaming)、快速成型(Rapid prototyping)、自组装(self-assembly)和静电纺丝法(Electrospinning)等。
上述制备方法已经大量开展并用于各类三维组织的制备，然而这些方法仍然存在诸多问题无法解决。
如大孔径、无纺管状可降解支架培养得到的血管，其管状支架无法控制三种细胞的精准空间分布，从而无法实现更为仿生的三层结构，无法构建小于6毫米直径、且具有多层细胞结构的小口径血管。
如传统细胞3D种植方法，只是将一个三维拓扑结构的支架浸润在一定细胞浓度的细胞悬液中，并对其进行包括旋转、震荡在内的动态刺激培养。这种种植方法无法很好地在特定拓扑结构处实现特定细胞的培养和分化，导致无法实现类似于真实组织的特性。
如基于3D打印和显微镜技术研发的细胞3D打印机，融合了高分子基质和细胞的溶液喷涂重叠，可以实现打印3D结构的目的。然而为了保证打印机喷头的流畅性，细胞3D打印机使用的支架材料多为水凝胶，这导致打印出的支架很难形成具有一定机械强度的组织。另一方面，受制于水凝胶材料的限制，其无法实现诸如毛细血管或绒毛等生物结构的仿生制备。另外，该方法也无法实现大通量的组织打印。
在细胞种植方面，现有方法也存在细胞种植率低和细胞在支架内分布不均匀的缺点。人们虽然尝试了采用各种方法来提高细胞种植的效率和均匀性，例如灌注种植、搅拌瓶反应器种植等方式，然而这些技术在实际应用上的效果有限，在组织工程领域并未被广泛使用。
例如，在对天然血管多层结构的仿生化设计中，支架中结构的取向性、腔内内皮层的形成和将细胞向支架内部定殖仍然存在巨大的挑战。如何提高组织工程血管支架的远期通畅率和顺应性；如何开发具有良好生物活性以减少血栓和感染出现的生物材料；如何在支架材料机械强度、降解速率和组织形成速率三者间找到最佳的平衡点以及如何解决种子细胞来源少、体外构建自体血管时间较长的问题，均有待进一步研究。
为了克服上述缺陷，研究人员进行了大量工作，开发出了一系列先进的三维管状组织的构建方法，并取得了以下成果。
专利文献CN 102884172 B提供了一种用于无菌分离、收集细胞和将细胞种植到支架或组织移植物上的系统。该系统能够从目标分离和收集细胞，并将这些细胞种植到生物相容性的三维支架或组织移植物上，这些支架或移植物能够在用于培养、输送、存储、测试的系统内例如作为组织移植物(例如血管移植物)培育和/或植入到目标内，以在体内、体外或离体地再生和/或修复组织。然而该系统结构极为复杂，且并不适用于所有细胞的收集培养和种植，在组织工程领域仍有较大的局限性。
专利文献CN 106085847 B提供了一种基于3D打印技术的支架内细胞种植平台及方法，包括三维运动平台、控制系统、支架、图像采集系统、图像处理系统、上位机和双喷头系统。然而该细胞种植平台基于的支架材料仍然主要是水凝胶，其存在精细结构不可控以及支架的力学性能不强的缺点。
专利文献CN 108653815 B公开了一种三维卷曲结构，其采用先进行二维细胞图案化，然后进行自卷曲的方法构建人工血管。然而该结构无法很好完成细胞的三维种植与构建，当支架为致密结构时，种植的细胞难以渗透致密的支架，导致最终形成的管状组织的单层厚度无法达到应有的厚度；当支架材料为疏松结构时，细胞会在早期形成非必要的、层与层之间的过度迁移，从而造成多种细胞的混合，导致无法精准控制细胞在三维支架材料中的分布与增殖。更为重要的是，采用该专利方法得到的不同细胞层，层与层之间存在较为明显的空腔，同一细胞组织在进行卷曲之后，存在无法很好融合的缺陷。
分析现有的制备工艺在生产管状支架时，内皮细胞的间隙往往较大，这使得血管平滑肌细胞或生长因子进入内皮下间隙的几率增加，从而引起内膜增生。这些人工管状组织的制备工艺无法消除细胞层之间的空腔，导致出现渗血和动脉夹层的概率较高，血液通过内膜进入血管壁，造成管腔狭窄闭塞，并引起动脉瘤的产生。
根据相关文献(DOI:https://doi.org/10.7461/jcen.2020.22.3.127,Clinicalanalysis of young adult patients with ruptured intracranial aneurysms:asingle-center study of 113consecutive patients,JCerebrovasc EndovascNeurosurg.2020；22(3):127-133.Published online September 21,2020)报道，关于颅内动脉瘤针对年轻群体(<＝40周岁)的一项研究表明，动脉瘤的平均大小在6.6±3.7mm区间。但是在年轻群体中，小于5mm的动脉瘤即可引发病症，该研究指出年轻群体相较于中老年群体，小型动脉瘤破裂的风险更高，其中94.2％的动脉瘤破裂发生在小于10mm的动脉瘤，而在这其中更有47.6％的破裂发生在小于5mm的动脉瘤上。更值得注意的是，青年患者动脉瘤发生破裂的时间节点也相较于中老年更为靠前。当动脉瘤初步成型式，构成空腔的血管壁厚度还没有达到可以支撑其自体的机械强度，此时若经常暴露在高压以及高强度的生活环境下极易导致动脉瘤的破裂。不仅仅是动脉瘤的大小，其形状对于破裂的几率也有较大影响，在该文献中指出，长条形或者其他不规则形状的动脉瘤更易发生破裂。与此同时吸烟作为动脉瘤的一大诱因，在当下，电子烟的流行导致吸烟群体的年龄结构整体下沉，动脉瘤也随之呈早发态势。
然而，由于目前的支架制备工艺无法解决细胞层之间出现空腔的问题，一旦出现动脉夹层并引起动脉瘤，就只能进行手术治疗，常用的方法是颅动脉瘤夹闭术或血管内介入治疗术，这会给组织工程的应用造成严重限制，并给患者带来二次痛苦。
因此，如何改善现有管状组织工程支架的制备工艺，解决目前的工艺存在的细胞层之间出现空腔，容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，以及存在引起动脉瘤的风险，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种三维人工管状组织及其制备方法与应用。本发明的技术目的在于，解决现有制备方法获得的三维人工管状组织无法消除细胞层之间的空腔或间隙，使得制备的组织工程支架在体内容易出现渗血和动脉夹层，并容易引起动脉瘤的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种三维人工管状组织的制备方法，其包括以下步骤：
一种三维人工管状组织的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备可卷曲的支架；
(2)在支架上种植细胞；
(3)将步骤(2)所得物卷曲成三维管状结构并进行体外培养，即得所述三维人工管状组织；
其中，所述可卷曲的支架的制备方法包括以下任一种：
方法一：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为两个不同的细胞种植区域，控制两个不同的细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够包裹内层的管状层；并控制两个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚为1:2～80；
方法二：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够依次包裹位于内层的管状层；卷曲后的最外层包裹中间层，中间层包裹最内层，并控制三个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚依次为1:2～80:2～3000；
方法三：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为四个不同的细胞种植区域，控制四个不同细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够依次包裹位于内层的管状层；卷曲后的最外层包裹次外层，次外层包裹中间层，中间层包裹最内层，并控制四个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚依次为1:2～80:2～700:2～3000。
需要说明的是，本发明中提及的多个不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，分别指的是如下情形：两个不同的细胞种植区域经卷曲后各自形成外层和内层的管状层，且外层包裹内层；三个不同的细胞种植区域经卷曲后各自形成外层、中间层和内层的管状层，且外层包裹中间层、中间层包裹内层；四个不同的细胞种植区域经卷曲后各自形成外层、次外层、中间层和内层的管状层，且外层；且外层包裹次外层、次外层包裹中间层、中间层包裹内层。
另外，本发明中的各层形成至少一圈完整的管状层指的是其卷曲后并不限于只形成1圈管状层，比如也可以是内层形成1.5圈或2圈或2.5圈的管状层，然后外层包裹住内层，此时外层也可以是形成大于1圈的管状层，如外层同样形成1.5圈或3圈管状层等；上述情形也同样适用于三层和四层结构，只需要满足卷曲后处于外层的细胞种植区域形成的管状层能够依次包裹住紧挨着的内层即可。
本发明提供的上述三维人工管状组织的制备方法，是在支架制备过程中进行三维拓扑结构的设计，通过控制不同的支架厚度比，从而能够将细胞二维图案化直接替换为细胞三维图案化，使得种植的细胞直接在三维拓扑结构中实现三维立体生长，从而在后续的卷曲过程中，每一周卷曲的支架即可为当前细胞组织提供足够的组织厚度，使得同种组织间不会存在空腔，细胞可以更好的黏附和生长。本发明方法通过在三维拓扑结构设计过程中很好控制各不同细胞种植区域的厚度比，解决了现有方法存在的无法消除细胞层之间的空腔，容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，以及存在引起动脉瘤的风险。
本发明三维拓扑结构的设计，可以通过多层铺膜针扎梳理，或者静电纺丝及融喷等不同工艺进行制备，只要是按照本发明方式控制相应的厚度比，形成特定的三维拓扑结构，即能很好保证细胞的三维立体生长，从而达到消除细胞层之间的空腔，解决人工管状组织容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，且不会引起动脉瘤。
本发明经卷曲形成的三维组织结构分为孔隙率、孔隙大小和纤维直径不一的两层、三层以及四层结构。其中两层结构用于神经组织，三层结构用于血管组织、尿道组织以及输精管，四层结构用于肠道组织、食道组织、气管组织以及输卵管。本发明能够很好制备出各种结构和功能各不相同的三维管状组织结构。
本发明对于现有技术的贡献在于：提供了一种层与层之间没有空腔的三维人工管状组织，这种人工管状组织在植入使用过程中不会出现渗血和导致动脉夹层，也不存在引起动脉瘤的风险。而现有的三维人工管状组织，均存在层与层之间的空腔问题，这种空腔容易导致出现渗血和动脉夹层，并存在引起动脉瘤的风险。
进一步的是，本发明的支架包括致密支架和疏松支架，所述疏松支架的孔隙率和孔径大小均大于所述致密支架。本发明通过将三维拓扑结构的支架设计成由致密支架和疏松支架组成，发现该支架结构能够很好防止细胞不同层之间的迁移，并为细胞提供充足的生长空间，使得细胞能够在支架上充分生长。通过对支架进行上述结构的设计，发现播种的细胞可以轻松侵入疏松层支架，并均匀分布在支架空隙中，其优点在于细胞不止单单停留在支架表面，而是能够使形成的组织与此疏松支架拥有相同的厚度；其次，播种的细胞由于无法穿透致密层支架，致使在卷曲过程中支架重叠部分的细胞不会在致密层降解前发生层与层间的迁移，这样就能充分保证细胞培养后形成的组织厚度，使得培养得到的组织有可以调控的厚度，且能拥有由不同功能细胞构成的多层组织。
例如，在构建三维人工血管时，细胞在此种支架上培养的结果是，细胞悬液可以快速渗透进入疏松层，同时细胞又不会在细胞播种的过程中通过空隙落入播种用器皿底部，悬液中的内皮细胞可以快速聚成细胞团，成团后的细胞可以贴合平整的致密层生长，且不会迁移至平滑肌层，形成的内皮组织可以更为光滑，脱细胞后的产物更有利于植入后自体血管细胞的向内皮细胞分化。
进一步的是，本发明所述疏松支架的厚度为20-5000μm，孔隙率为90％以上，孔径大小为20-1000μm，纤维直径为0.05-30μm；所述致密支架的厚度为1-200μm，孔隙率为59-90％，孔径大小为0.05-500μm，纤维直径为0.05-30μm。
进一步的是，所述疏松支架和致密支架的制备工艺包括浇筑、微注塑成型、吹筑、挤筑、压延、吹膜挤压、旋转成型、浸涂、2D打印、烫印、熔喷、水纺、针纺、静电纺丝、熔融纺丝、融喷纺丝、热粘合、化学粘合、水刺或针刺的非织造工艺中的任一种或多种。
进一步的是，所述疏松支架和致密支架采用的材料包括PGA、PLA、PCL、PLC、PPDO、PHBV、HA、PU、PET、PP、PE、PA、PMMA、PTFE、PES、PEEK、PS、PP、PMMA、PC、PGA-TMC、PGA-CL、壳聚糖或胶原蛋白中的至少一种，或是它们的共聚物材料。
在上述基础上，首先，本发明提供了一种由双层结构组成的人工管状组织。
具体的，本发明提供的双层结构的三维人工管状组织为神经组织，其支架的制备方法包括：于所述支架上划分为两个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制两个不同区域的支架厚度比由薄至厚为1:20～50。
进一步的是，该神经组织的支架还包含双层神经捆扎成束的结构，捆扎成束的神经由两层外皮组织包裹，从卷曲起始到卷曲末端控制捆扎成束的神经支架厚度比由薄至厚为1:12～24。
进一步的是，于神经支架位于卷曲起始端的区域内还设有沿轴向分布的棱状突泡，所述棱状突泡的分布密度为10-15个每毫米，长度为5-20毫米，每个棱状突泡间相互独立，由1-8微米的致密层相互分割。
由车祸、事故以及自然灾害等导致的外周神经创伤使得患者的感觉信号无法传送至大脑和脊髓，同时来自大脑的运动指令也无法顺利传送到目标器官。失去神经系统协调动作和感知的患者将在在日常生活中失去自理能力，对生活造成极大困扰。当前两种主流治疗方案，一为使用自神经移植，二为使用同种异体脱细胞神经进行移植。前者需要二次手术并且需要患者其他部位神经。后者需要器官或遗体捐赠以提取外周神经故无法大规模量产，并且较难进行标准化。使用本发明提及的技术构建人工神经组织支架，并通过在支架上播种从细胞库内扩增的神经细胞、神经胶质细胞以及施万细胞，并使用电刺激，引导神经轴突延管状支架延伸，生产的组织工程人工外周神经，经过脱细胞处理后可很好用于外周神经创伤的修复。本发明方法构建的人工神经组织层与层之间不会存在空腔，从而不会出现渗血和导致动脉夹层的问题，也不会存在引起动脉瘤的风险。
另外，本发明提供的双层结构的三维人工管状组织还包括中口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为两个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制两个不同区域的支架厚度比由薄至厚为1:3～75。
其次，本发明还提供了一种由三层结构组成的人工管状组织，具有三层结构的人工管状组织包括以下几类：
具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织包括中口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:3～58:3～60。
具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括小口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～25:3～48。
具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括中口径静脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～38:3～70。
具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织包括小口径静脉血管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:5～50:7～66。
具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括女性尿道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:5～27:8～60。
具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括男性尿道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4～28:10～66。
具体的，本发明提供的三层结构的三维人工管状组织还包括输精管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4～700:16～1000。
另外，本发明提供了四层结构的三维人工管状组织，具有四层结构的人工管状组织包括以下几类：
具体的，本发明提供的四层结构的三维人工管状组织包括肠道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～4:2～30:3～35。
具体的，本发明提供的上述肠道组织包括小肠，于小肠支架位于卷曲起始端区域内还设有在轴向呈高度为4-7mm，宽度为2-3mm的突起。
进一步的是，所述突起包括绒毛和隐窝，其中，绒毛径向长度为1200-1600μm，轴向宽度为300-600μm；隐窝颈口直径为2-10μm，腔内直径为40-50μm。
具体的，本发明提供的上述肠道组织还包括大肠，于大肠支架位于卷曲起始端的支架区域内设有隐窝，所述隐窝在内层的分布密度为100个每平方毫米，隐窝径向深度为1500-2200μm，直径为400-500μm。
具体的，本发明提供的四层结构的三维人工管状组织包括食道组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～100:5～600:20～1000。
具体的，本发明提供的四层结构的三维人工管状组织包括气管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4～9:15～38:25～56。
进一步的是，在气管组织支架从卷曲起始端起第三个细胞种植区域内，还包含一部分为由机械强度高于5～10MPa的高分子材料或者软骨细胞制成。
进一步的是，机械强度高的区域呈环状，并且有至少一处开口。
具体的，本发明提供的三维人工管状组织包括输卵管组织，其支架的制备方法包括：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2～150:3～300:20～1000。
进一步的是，于输卵管组织支架靠近卷曲起始端的细胞种植区域内还设有绒毛结构，所述绒毛结构为在轴向呈高度为10-11μm，直径为0.2-0.3μm的突起。
本发明的目的之二是提供由如上任一方法制备得到的三维人工管状组织。
具体的，所述三维人工管状组织包括人工神经、人工动脉血管、人工静脉血管、人工小肠、人工大肠、人工食道、人工气管、人工尿道、人工输卵管和人工输精管。
进一步的是，所述人工动脉血管包括中口径动脉血管和小口径动脉血管。
进一步的是，所述人工静脉血管包括中口径静脉血管和小口径静脉血管。
进一步的是，所述人工尿道包括男性尿道和女性尿道。
本发明的目的之三是提供由如上任一方法制备得到三维人工管状组织的应用，其是将所述三维人工管状组织作为受损组织的替代物或体内植入物。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种三维人工管状组织的制备方法，该方法通过控制支架上不同细胞种植区域之间的厚度比，很好实现了对支架进行三维拓扑结构的设计，促进了细胞的三维立体生长，使得支架在卷曲过程中，每一周卷曲的支架即可为当前细胞组织提供足够的组织厚度，使得同种组织细胞层之间不会存在空腔，细胞在同一支架上可以进行更好的黏附和生长；同时，本发明通过设置疏松层和致密层支架，能够防止不同层之间的细胞发生迁移。
(2)本发明提供的管状组织的制备方法很好解决了现有方法存在的无法消除细胞层之间的空腔，容易出现渗血和导致动脉夹层的问题，以及存在引起动脉瘤的风险。
附图说明
图1为实施例1中人工血管的制备方法示意图；
图2为人工血管的组织结构表征图；(A)由本专利实施例1的方法制备的人工血管经脱细胞处理后，使用Masson三色染色法染色，蓝色处为主要由胶原蛋白构成的细胞外基质，红色箭头处为内皮层；(B)人体自体血管经脱细胞处理后，使用Masson三色染色法染色，蓝色处为主要由胶原蛋白构成的细胞外基质；(C)在2017年由成诗宇及其团队报告的三层卷曲制备的人工血管，使用Masson三色染色法染色，蓝色处为主要由胶原蛋白构成的细胞外基质，红色箭头所指处为有多层卷曲方式制备血管所形成的空腔；(D)在1997年由Nicolas L’heureux及其团队报告的多层结构人工血管，使用Masson三色染色法染色，蓝色为胶原蛋白为主的细胞外基质，深红色处为细胞核，红色箭头所指处为有多层卷曲方式制备血管所形成的空腔；(E)在2011年由Marissa Peck及其团队报告的多层结构人工血管LifelineTM，棕色处为CD31的免疫染色，蓝色为细胞核的对比染色，黑色箭头处为内皮细胞，红色箭头所指处为有多层卷曲方式制备血管所形成的空腔。EM：Endothelial membrane内表皮层；IM：Internal membrane内皮层；M：Media中间层；A：Advertia外层；
图3为使用本发明方法制备的人工血管的实物图；
图4为对本发明方法制备的人工血管的轴向拉伸性测试；
图5为对本发明方法制备的人工血管的辐向延展性测试；
图6为本发明方法制备的人工血管与乳腺内动脉和合成材料人工血管的杨氏模量测试结果；
图7为不同方法制备的人工血管的爆破压力测试结果；
图8为不同方法制备的人工血管的缝合强度测试结果；
图9为不同方法制备的人工血管的顺应性测试结果；
图10为不同方法制备的人工血管的断裂伸长率测试结果；
图11为不同方法制备的人工血管的长期通畅率测试结果；
图12为机械刺激培养开始前采用不同方法制备的人工血管的横截面照片。
图13为经过两个月机械刺激后脱细胞处理前的各人工血管的中段内壁切片图。
图14为从各人工血管培养初期直至血管完成脱细胞处理后的共三个阶段的空腔率演化图。
图15为本发明实施例和对比例制备的人工血管在培养初期直至血管完成脱细胞处理后的共三个阶段的空腔率演化图。
图16为各人工血管植入后第三个月的造影图像。
图17为本发明实施例2-7的方法制备的人工血管在植入后第三个月的造影图像。
图18为本发明中对比例1-9的方法制备的人工血管在植入后第三个月的造影图像。
图19为本发明支架中采用的致密层和疏松层结构与仅采用疏松层结构的组织细胞密度对比结果。
图20为支架中采用的致密层和疏松层结构与仅采用疏松层结构在培养2周、4周和6周后的切片染色后各层组织细胞分布密度统计。
图21为本发明的人工肠道中设计的肠道隐窝和绒毛结构图。
图22为本发明的人工神经中设计的棱状突泡结构图。
图23-30为现有技术一至七中记载的人工血管组织中的空腔结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
3毫米口径人工血管的制备方法，包括以下步骤：
(1)支架的制备；
(2)支架上种植细胞；
(3)卷曲成三维管状结构并进行体外培养。
该3mm口径人工血管产品所使用的细胞支架拥有三个细胞种植区域：内皮细胞种植区域、平滑肌细胞种植区域和成纤维细胞种植区域。三个区域间可以通过包括针扎的方式将纤维进行互相穿插，或者使用可降解缝合线，或者使用静电纺丝/熔融纺丝重合纺丝，或者超声焊接的方法进行对接，构成的血管内半径为1.5mm，长度为12cm。控制该细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、400μm和500μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：4：5。
内皮细胞种植区域的支架拥有双层结构，由致密层与疏松层结构组成。其中的致密层支架的材料优选使用较小纤维直径为8μm，较小的空隙直径为3μm，较薄支架厚度为5μm，宽度为12.6mm，优选平整且均匀的支架，支架材料可以在4-6周内降解。此致密层可以通过编织、熔喷或静电纺丝方法制备。其中的疏松层支架的材料优选拥有纤维直径为5μm，较大空隙直径为30μm，支架厚度为95μm。上述致密层和疏松层结构之间通过生物胶等方式粘合。在此种细胞支架上培养细胞的结果是：细胞悬液可以快速渗透进入疏松层，同时细胞又不会在细胞播种的过程中通过空隙落入播种用器皿底部，悬液中的内皮细胞可以快速聚成细胞团，成团后的细胞可以贴合平整的致密层生长，且不会迁移至平滑肌层，形成的内皮组织可以更为光滑，脱细胞后的产物更有利于植入后自体血管细胞的向内皮细胞分化。
平滑肌细胞种植区域同样拥有双层结构，其中的致密层和疏松层在参数、特点及功能上与内皮细胞区域有所不同，其中的致密层优选的拥有较小纤维直径为5μm，空隙直径为3μm，支架厚度为10μm，宽度为13mm，优选的支架材料可以在2-5周内降解；此致密层可以通过编织、熔喷或静电纺丝等方法制备。其中的疏松层优选的拥有纤维直径为2μm，较大空隙直径为10μm，支架厚度为390μm，优选平整且均匀的支架，且可以在2-5周内降解；上述两层结构间通过生物胶等方式粘合。在此种细胞支架上培养细胞的结果是：平滑肌细胞悬液可以快速渗透进入疏松层，悬液中的平滑肌细胞可以快速聚成细胞团，形成平滑肌组织，在不同力度轴向机械刺激下分泌不同量的弹性蛋白以及胶原蛋白，有利于植入后自体血管细胞向平滑肌细胞分化。
成纤维细胞种植区域的支架由单层疏松支架构成，优选的其参数为拥有较小纤维直径为2μm，较大空隙直径为12μm，较厚支架厚度为500μm，宽度为26mm，优选平整且均匀的支架，且可以在2-5周内降解的支架材料制成。在此种细胞支架上培养细胞的结果是：成纤维细胞悬液可以快速渗透进入疏松层，悬液中的成纤维细胞可以快速聚成细胞团，形成成纤维组织，分泌不同量的弹性蛋白，纤连蛋白以及胶原蛋白，在培养过程中为血管组织交换物质并且提供营养。
上述提及的致密层和疏松层支架采用的材料可以包括PGA、PLA、PCL、PLC、PPDO、PHBV、HA、PU、PET、PP、PE、PA、PMMA、PTFE、PES、PEEK、PS、PP、PMMA、PC、PGA-TMC、PGA-CL、壳聚糖或胶原蛋白中的至少一种，或是它们的共聚物材料。
列举具体的支架制备方法如下：将PGA-CL、PLGA或PLC通过熔喷工艺梳理成疏松结构，使用静电纺丝工艺将同种或不同材料溶解在有机溶剂中，通过电场喷纺在疏松结构上，形成致密疏松相结合的支架结构。使用的电场控制在10-30kV，喷嘴直径使用0.1-0.8mm之间，高分子挤出速度控制在0.1至20ml/min，溶解的高分子浓度在5-50％之间，喷头与收集器之间的距离控制在2-30cm之间。可以使用包括滚筒，平板在内的收集器。也可以使用PLA或PHB作为粘合剂，在疏松层与致密层间涂抹3g/cm2，后重叠静止20分钟至8小时等待其粘合固定。同理较薄支架也可使用此方式与较厚支架融合。或将较薄支架与较厚支架重叠处使用超声焊接的方式通过超声波原位加热高分子材料，每1-10cm2设置一个焊接点，每次焊接0.1ms至1s，使得两层结构结合。又或者通过将两层需要结合的支架使用高压水刺的方式进行纺织，水刺使用喷嘴压力控制在70-180Pa，采用的喷嘴一般在0.15至0.3mm之间，水流量控制在0.2至2升/分钟，水刺密度设定在2-10/cm2。
待支架制备完成后，通过点胶的工艺，向目标区域内每10mm2点种200μl细胞。种植完细胞的支架沿一根洁净的1.5mm半径不锈钢杆紧密卷曲，卷曲完过后使用手术缝合线在管状支架两头将重叠的多层缝合固定，并且从金属杆上取下。
将上述完成卷曲后的管状生物组织在持续的周期性机械脉冲刺激下，于37℃的培养液中培养8周，此过程中培养液每72小时进行一次更换。完成培养的血管，支架材料已经完全降解，组织经过脱细胞处理后浸润在含有肝素钠以及内皮生长因子等修饰性蛋白的保存溶液中超过24小时后即可以用于临床治疗，或是长期储存。
使用上述方法制备的小口径人工血管，其内皮层光滑，拥有和自体血管相匹配的辐向以及轴向延展性，其顺应性强，不会轻易在旋扭或者弯曲下发生管腔闭折。
上述制备方法中支架上不同细胞种植区域的划分和在不同区域上种植细胞，以及待细胞种植完成后按卷曲起始端到终止端进行卷曲成血管的操作示意图如图1所示。
实施例2
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、500μm和700μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：5：7。
实施例3
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、1000μm和4000μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：10：40。
实施例4
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、200μm和300μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：2：3。
实施例5
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、200μm和210μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：2：2.1。
实施例6
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、2500μm和4800μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：25：48。
实施例7
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、800μm和5000μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：80：500。
实施例8
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、500μm和660μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：50：66。
对比例1
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、180μm和500μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：1.8：5。
对比例2
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为1μm、40μm和3200μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：40：3200。
对比例3
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为100μm、150μm和2000μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：1.5：20。
对比例4
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、12μm和3000μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：1.2：300。
对比例5
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、180μm和3100μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：1.8：310。
对比例6
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、820μm和3000μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：82：300。
对比例7
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、850μm和2500μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：85：250。
对比例8
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、1000μm和4000μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：100：400。
对比例9
参照实施例1的方法，不同之处在于，控制细胞支架上三个细胞种植区域的支架厚度由薄至厚依次为10μm、18μm和4800μm，即支架厚度比由薄至厚依次为1：1.8：480。
对比例10
现有技术一：参照文献(Stankus J J,Soletti L,Fujimoto K,etal.Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs throughelectrohydrodynamic atomization[J].Biomaterials,2007,28(17):2738-2746.)中的方法制备的人工血管，该文献中记载的人工血管切片存在空腔的情形(如图23)，按照后续本专利中的空腔率计算方法，该血管在植入动物体内三个月后的空腔率为15％。
对比例11
现有技术二：参照文献(Zheng W,Wang Z,Song L,et al.Endothelializationand patency of RGD-functionalized vascular grafts in a rabbit carotid arterymodel[J].Biomaterials,2012,33(10):2880-2891.)中的方法制备人工血管，该文献中记载的人工血管切片存在空腔(如图24)，该血管在植入动物体内三个月后的空腔率为12％。
对比例12
现有技术三：参照文献(Teebken O E,Haverich A.Tissue engineering ofsmall diameter vascular grafts[J].European journal of vascular andendovascular surgery,2002,23(6):475-485.)中的方法制备人工血管，该文献中记载的人工血管切片存在空腔(如图25)，该血管在植入动物体内三个月后的空腔率为10％。
对比例13
现有技术四：参照文献(Kim M J,Kim J H,Yi G,et al.In vitro and in vivoapplication of PLGAnanofiber for artificial blood vessel[J].MacromolecularResearch,2008,16:345-352.)中的方法制备人工血管，该文献中记载的人工血管切片存在空腔(如图26)，该血管在植入动物体内三个月后的空腔率为14％。
对比例14
现有技术五：参照文献(Wang W,Hu J,He C,et al.Heparinized PLLA/PLCLnanofibrous scaffold for potential engineering of small-diameter bloodvessel:Tunable elasticity and anticoagulation property[J].Journal ofBiomedical Materials Research Part A,2015,103(5):1784-1797.)中的方法制备人工血管，该文献中记载的人工血管切片存在空腔(如图27)，该血管在植入动物体内三个月后的空腔率为13％。
对比例15
现有技术六：参照文献(L'Heureux N,Dusserre N,Konig G,et al.Humantissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization[J].Nature medicine,2006,12(3):361-365.)方法制备人工血管，该文献中记载的人工血管切片存在空腔(如图28和29)，该血管在植入动物体内三个月后的空腔率为10％。
对比例16
现有技术七：参照文献(Talacua H,Smits A IP M,Muylaert D E P,et al.Insitu tissue engineering of functional small-diameter blood vessels by hostcirculating cells only[J].Tissue Engineering Part A,2015,21(19-20):2583-2594.)中的方法制备人工血管，该文献中记载的人工血管切片存在空腔(如图30)，该血管在植入动物体内三个月后的空腔率为9％。
实验例1
参照本发明实施例1的方法制备小口径3毫米的人工血管为例，在经过脱细胞处理后，采取血管的横截面，使用Masson三色染色法进行组织结构表征。
从图2可以很明显地观测到制备的人工血管具有由三种细胞组成的结构。其中，由内皮细胞分泌制成的内表皮层相较由平滑肌细胞制成的内皮层以及中间层更为致密，且只有单个细胞的厚度。平滑肌细胞形成了内皮层以及中间层两种结构，其中内皮层细胞外基质呈环向分布，中间层细胞外基质沿轴向分布。外层由成纤维细胞的细胞外基质构成，相较其他三层结构最为松散。上述这些特征都与人的自体血管高度吻合。通过本发明制备的人工血管拥有与本体相类似的致密的内皮层。
实验例2
人工血管的机械指标关键在于其机械性能是否能和人类自体血管匹配，同时具有更好的韧性，可以维持更长时间的工作。例如本发明提到的小口径动脉血管，非线性的弹性常数可以使血管在血流量突增血管内径增加的形况下拥有较大的应力，阻止其进一步膨胀；同时在正常脉动下，血管可以自由缩胀，减小血管中的压力。一根单一材料制成的人工血管会因其线性的弹性曲线，导致无法和嫁接处的自体血管匹配，加速内膜增生和血栓的形成。
本实验分别对6cm长的组织工程人工血管(3毫米内径，N＝6)，合成材料血管(3毫米内径，PU，N＝5)以及脱细胞后的人体乳腺内动脉(～2.8毫米，N＝7)进行了以下机械性能测试。
(一)环形/长度拉伸试验：
本实验使用一个单轴拉伸装置，将一个血管组织延横截面拉至断开，然后记录估算其最大拉伸强度以及断裂伸长率。
首先，截取一段5毫米长的血管放在两个直径为1.2毫米的不锈钢丝制成的平行钩上，然后以35毫米/分钟的速度拉开钩子，直到组织断开，使用LabView数据采集系统采样。
另外，截取一段20毫米长的血管将两端分别固定在两个长度为60毫米的不锈钢丝夹子上，然后以45毫米/分钟的速度拉开钩子，直到组织断开，使用LabView数据采集系统采样。
(二)缝合强度测试：
进行缝合强度测试时，截取长度约为15毫米的血管段插管到一个垂直的金属支撑轴上，并将其与电子秤连接。用BV-1针头使用5-0缝合线完成一个针点间隔2毫米的单纯简短缝合，并以120毫米/分钟的恒定速度拉出，直至断开，使用LabView数据采集系统进行采样。
(三)爆破压力测试：
将截取长度约为5厘米的血管两端插管，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以80至100毫米汞柱/秒的速度加压，直至组织爆裂，使用LabView数据采集系统以及一个电子压力表进行采样。
(四)顺应性测试：
顺应性测试需要测量血管在静止状态以及在加压状态下的不同内径的差与所受压强差的比值。使用长约5厘米的血管段被拉紧至0.460牛顿，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)加压，直到50与300毫米汞柱高为止，拍摄高清图像用于测量外径。在测试之前，将来自同一血管的横截切面固定在福尔马林中，以便从组织学截面上获得静止时的几何形状。
实验结果如图3～图11所示。
图3为使用本发明实施例1的方法制备的人工血管，发现该人工血管柔软、光滑，且组织生长均匀。图4为使用镊子对人工血管两端进行拉伸，发现可以拉伸至约其自身长度的两倍，表明使用本专利方法制备的人工血管具有优秀的轴向拉伸性。图5为使用镊子将人工血管内径撑开，发现可以伸展至约其自身内径1.5倍，表明使用本专利方法制备的人工血管拥有优秀的辐向延展性。
从图6-图11的机械性能对比可知，本发明制备的人工血管在机械性能上能够与自体血管高度相似。
进一步研究发现，使用本专利方法制备的组织工程人工血管，其内皮层没有空腔。然而，现有技术中通过其他卷曲方法制备的多层血管，如在同一区域内使用多层卷曲叠加的方式会在该区域内造成多处大小不一的空腔，这些空腔的存在会大大降低圆周方向的机械强度，并且为植入后血管自身创伤修复造成困难，极大地提高了术后内皮增生，平滑肌细胞迁移，动脉瘤形成地风险。
另外，本专利方法制备的人工血管在其杨氏模量，以及顺应性方面可以与植入后的上下游自体血管相契合，远优于现有的其他合成材料血管。同时，使用本专利方法制备的血管在其长期通畅性方面效果更佳，在植入式不易发生弯折，缝合处血液动力学相匹配，进一步降低了内皮增生地风险，提高了长期通畅率(具体可参见实验例3)。
实验例3
组织工程人工血管空腔率的测试
根据文献(DOI:https://doi.org/10.7461/jcen.2020.22.3.127,Clinicalanalysis of young adult patients with ruptured intracranial aneurysms:asingle-center study of 113consecutive patients,J Cerebrovasc EndovascNeurosurg.2020；22(3):127-133.Published online September 21,2020)报道，年轻群体(<＝40周岁)颅内动脉瘤的平均大小在6.6±3.7mm区间，然而在年轻群体中，小于5mm的动脉瘤即可引发病症，该研究指出年轻群体相较于中老年群体，小型动脉瘤破裂的风险更高，其中94.2％的动脉瘤破裂发生在小于10mm的动脉瘤，而在这其中更有47.6％的破裂发生在小于5mm的动脉瘤上。
当动脉瘤初步成形时，构成空腔的血管壁厚度还没有达到可以支撑其自体的机械强度，此时若经常暴露在高压以及高强度的生活环境下，就极易导致动脉瘤的破裂。不仅仅是动脉瘤的大小，其形状对于破裂的几率也有较大影响，在该文献中指出，长条形或者其他不规则形状的动脉瘤更易发生破裂。
从上述结果可以得出，若人工血管自身管壁间存在空腔，特别是靠近内壁部分存在间隙，该内皮细胞层在经过脱细胞处理后极易在血液的冲刷下破裂，导致血液涌入平滑肌层形成动脉瘤。因此，成品人工血管间的空腔应被控制在最小或者没有，任何形状和大小下的空腔与间隙都将为患者埋下隐患。本发明人以健康血管为基准，经过统计共300张人体桡动脉切片染色图，发现空腔率为2±0.6％，因此本实验设定人工血管的管壁空腔率须至少小于2％。
上文所述的动脉瘤原理同样作用于其他人工管状组织，如肠道组织或尿道组织，管壁的层间存在空腔也会导致消化液，气体或尿液涌入中层组织形成囊状瘤。其在压力的作用下同样会导致破裂威胁到患者生命。因此，人工管状组织的管壁内部应不存在任何意义上的空腔以及任何形态下的间隙。
如当血管植入物中存在空腔时，这种空腔可以导致血管发生不同形式的病变并最终导致坏死和堵塞。其中最常见的病变是血管瘤。当包裹空腔的血管壁发生破裂时，血液会灌入空腔，撕裂血管壁并使空腔膨胀，形成假腔。膨胀的假腔壁会阻止血液流向正确的方向，从而导致血液逆流和血管堵塞。
另一方面，当自体细胞尝试修复空腔时，也可能导致血栓的形成。一旦血流渗入血管壁并流入空腔，血小板和胆固醇会在此堆积形成血栓。血栓的形成会进一步降低血管机械强度和柔韧性，从而更易发生破裂。持续堆积的血栓会使血管内腔更加狭窄，阻碍血液的正常流动，导致流速下降甚至堵塞。当血栓掉落时，在血管内游离的血块也会引发下游血管的堵塞。
与此同时，空腔会降低血管自身的强度，使其爆破压降低，更易引发血管内皮破裂。血管中层的平滑肌细胞会迁移至血管内壁，导致内皮增生，进而使血管内径狭窄发生堵塞。
除了上述病变，空腔更易堆积感染源并引发炎症，从而导致的结缔组织增生也会致使血管狭窄和堵塞。总之，血管内部的空腔可能会导致多种血管病变，包括血管瘤、血栓形成、血管内皮破裂、内皮增生等，并最终导致血管堵塞。上述病变同时也是人造血管前期发生堵塞需要干预治疗的最大成因。
本专利的发明人在该前提下对于所有此前制备的人工管状组织进行研究，就空腔的数量以及大小进行了统计。人工血管样本的制备方法分别参考下列方法：(a)通过使用传统多层卷曲叠加的方法构建多层管状血管(A completely biological tissue-engineered human bloodvessel，1998，NICOLASL’HEUREUX et al.)；(b)通过使用自卷曲方法构建三层管状血管(CN108653815B，国家纳米科学中心)；(c)使用本专利方法制备组织工程人工血管。
相比于上述方法(a)和方法(b)制备的人工血管，本专利方法(c)制备的人工血管通过对层间厚度的控制，能够在保证血管机械性能以及生理结构的同时尽可能减少了空腔的形成，使制备完成的血管不会因为空腔导致出现上述病变，极大地增加了血管植入物的通畅性，并在三个月的动物实验中取得了很好的效果。
(一)实验方法如下：
按照实施例1的方法制备4mm内径12cm长血管，每种样本数各30根，分四个阶段采样。第一阶段在细胞种植并卷曲后机械刺激培养开始前取出五根血管进行横截面拍摄；第二和第三阶段分别在培养八周后脱细胞处理以前以及以后各取十根血管；第四阶段分别将五根血管取5cm植入新西兰兔体内进行桡动脉替换术后三个月观察其通畅性。
第一阶段因管壁内层与层之间的连接关系尚未建立，切片的过程中易导致层与层的剥离，且此时的空腔肉眼可见，故只采用拍摄横截面的方式对血管壁内空腔进行评估。评估时每根血管会在两头(3cm)和中间处(6cm处)分别取样，以观察其层间融合的均匀性。第二、第三及第四阶段的血管经处理后送专业机构切片并染色，每根血管会在两头(3cm)和中间处(6cm处)分别取样，以观察其层间融合的均匀性。具体的切片染色过程参照公开的常规方法，此处不做详解，但为了减少切片对血管管壁结构的影响，在准备样本时对血管进行以下处理：
1)取总长度为12cm的血管2根，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中浸泡，清洗干净血管中残留的培养基；
2)选取12cm血管正中间部分，与从左/右往另一端方向3cm处，以及9cm处，分别使用医用剪刀截断；
3)用一次性手术刀修整血管截面上的不规整处，从横截面外沿入刀，对不规则区域进行旋切，切除时始终保持刀刃与切除中的血管壁以及垫板接触，避免对血管进行辐向挤压；
4)两根处理后的血管分别命名为a和b；对血管a进行脱细胞处理，血管b作为空白对照组；
5)将血管a和b分别放入独立的装有多聚甲醛固定液的离心管中，使多聚甲醇溶液淹没血管，然后送检。
由于使用不同制备方法所制成的血管在内径上存在差异，为了更加客观的量化对比不同血管的层间空腔，使用以下公式对空腔率进行定义：
空腔率％＝(空腔面积/管内面积)×100％。
空腔面积为照片或者切片图中所有大于细胞直径的空间之和。
(二)实验结果：实验所得结果如图12-15所示。
图12为机械刺激培养开始前的人造血管横截面照片，其中：(a)使用传统多层卷曲叠加方法制备的人工血管；(b)使用自卷曲方法制备的人工血管；(c)使用本专利方法制作的人工血管。从图12可以看出，使用传统多层卷曲叠加的方法制备的人工血管在机械刺激培养前培养前，层与层之间会出现较多空腔，原因在于虽然使用生物胶水固定，但较多层的材料自身始终会因重力原因形成一定塌陷导致空腔。使用自卷曲方法制备的人工血管，因材料自身的张力培养前空腔率得到一定改善，但一致的厚度使得卷曲后无法达成与自体血管相适配的厚度比。然而使用本专利方法制备的血管可以在成型后自然形成合适的厚度比，并且不会因塌陷导致空腔增大，在培养前期便可使层与层间贴合促进血管壁融合成型。
图13为经过两个月机械刺激后脱细胞处理前的血管的中段内壁切片图，其中：(a)使用传统多层卷曲叠加方法制作的人工血管；(b)使用自卷曲方法制作的人工血管；(c)使用本专利方法制作的人工血管；(d)大鼠动脉血管切片，箭头处标志了较大的空腔。从图中可以看出，使用传统多层卷曲叠加方法制备的血管空腔小而多，且有较多分布于靠近内皮层位置，极大降低内皮层强度，其没有固定形状但是普遍辐向距离较大。使用自卷曲方法制备的血管空腔出现在层与层的接触面间，其形状多为狭长形，与内皮层的距离由自卷曲材料决定。使用本专利方法制备的血管内壁光滑，结构紧致，无明显空腔，血管内壁表面均匀覆盖了一层血管内皮细胞，最外层的成纤维细胞层和平滑肌细胞在密度上存在明显区别，和字体血管更为接近，同时用于作为支架的高分子可降解材料也已经完全吸收。
图14展示了从血管培养初期直至血管完成脱细胞处理后的共三个阶段的空腔率演化。从图14可以看出，传统多层卷曲叠加方法和自卷曲方法在第一阶段中有近40％的空腔率，经过机械刺激培养后，可降解支架进一步收缩组织层间开始融合，导致空腔减少。在细胞洗脱处理后的第三阶段，未完全形成组织的细胞被剥离形成新的空腔，故空腔率上升。相比之下，使用本专利方法制备的血管空腔率始终保持在较低水平，且在经过脱细胞处理后空腔率并无回升，表明血管壁内部已形成致密组织。
对本发明实施例和对比例制备所得人工血管进行培养，分三个阶段统计其空腔率，结果如表1所示，并绘制空腔率演化图。图15展示了实施例和对比例制备的不同人工血管样品从血管培养初期直至血管完成脱细胞处理后的共三个阶段的空腔率演化。从图15可以看出，在血管培养初期，采用本发明实施例的方法获得的人工血管的空腔率较低，而对比例方法获得的人工血管空腔率较高。经过第二阶段机械刺激培养后，支架发生降解且收缩组织层间开始融合，导致空腔率均减少。在细胞洗脱处理后的第三阶段，对比例未完全形成组织的细胞被剥离形成新的空腔，故空腔率上升；相比之下，本专利实施例提供的方法制备的人工血管空腔率始终保持在较低水平，且在经过脱细胞处理后空腔率并无回升，表明血管壁内部已形成致密组织。
表1
为了进一步对比在第一阶段制备的人工血管的空腔率对后续培养阶段的影响，发明人以自卷曲方法制备的人工血管为例，通过采用在卷曲前在每一层涂抹包括生物明胶，或PEG，或纤维蛋白为主的可降解生物融合剂，经检测使其第一阶段的空腔率为3％，然后进行第二阶段和第三阶段的实验。结果发现，在培养过后仍会出现空腔率上升的情况。采用上述处理方法后，第二阶段的空腔率为2％，但是在第三阶段后空腔率回升至6％以上，表明现有制备工艺即使获得较好的初始空腔率，但仍然容易在后续培养过程中产生大量空腔。
图16对比了将制备完的血管植入动物体内后三个月后的造影图像，其中：(a)使用传统多层卷曲叠加方法制作的人工血管；(b)使用自卷曲方法制作的人工血管；(c)使用本专利方法制作的人工血管；箭头出现的黑色区域为出现逆流的区域。从图中可以明显发现，使用传统多层卷曲叠加方法制备的血管已经完全堵塞，甚至出现逆流，极大可能出现了动脉瘤；使用自卷曲方法制备的血管血流速度明显减缓，血管内可能出现血栓；只有通过本专利方法制备的血管流速始终与刚开始植入时保持一致，证明本专利方法制备的人工血管没有空腔，不会出现血栓或动脉瘤的情形。
本实验还分别将本发明实施例2-7制备的人工血管植入动物体内后三个月进行造影观察，所得造影图像如图17所示，图中a-f分别对应实施例2-7的方法制备的人工血管。从图17可以看出，本发明上述实施例提供的方法制备的人工血管的血液流动一直保持通畅状态，不会出现血栓或动脉瘤的情形。
而当对本发明对比例1-9制备的人工血管植入动物体内后三个月进行造影观察，所得造影图像如图18所示，图中A-I分别对应对比例1-9的方法制备的人工血管样品。从图18可以看出，对比例提供的方法制备的人工血管在植入动物体内三个月后的血液流动均出现阻塞现象，有较大概率出现血栓或动脉瘤。
实验例4
对本专利方法中采用的疏松层和致密层支架结构与只采用疏松层支架进行对比，方法如下：
(一)取疏松支架以及疏松致密复合支架各10张，定点定量种植荧光转染的细胞(5万个细胞/cm2)，培养2天，每过12小时，使用共聚焦显微镜统计在支架上细胞分布密度以及数量，结果如图19所示，实线为使用疏松致密复合支架，虚线为只使用疏松结构的支架，y轴为细胞分布密度，单位为(万个细胞/cm2)，x轴为时间。由图19可知，单单使用疏松层的支架细胞分化的速率小于使用疏松致密复合支架的细胞分化速率，且使用复合支架的细胞分布在同种支架间相比较有更窄的分布区间，更加适合用于大批量生产过程中工艺的标准化。
(二)取播种完细胞的疏松管状支架以及疏松致密复合支架各12根，分别在培养后两周，四周，六周，在各个阶段牺牲4根，切片染色后统计各层组织细胞分布位置。如图20所示，虚线为疏松支架，实线为复合支架，黑色为成纤维细胞层，深灰色为平滑肌细胞层，浅灰色为内皮细胞层。由图20可见，使用复合支架的管状组织层与层之间分布边界更为明显，没有过多的重叠部分，直到四周左右部分致密支架层降解后有少量细胞发生迁移。如此同时，使用单种疏松结构支架所制成的管状组织，细胞分布边界并不明显，有较多部分发生迁移，导致同种细胞较难结合成团生长形成组织，由图可见，培养六周后单种支架细胞密度相较第四周并不明显。且进入内皮层的平滑肌细胞可能增加植入后内皮增生的几率，为病人埋下隐患。
实施例9
本实施例提供了一种人工透析用静动脉瘘的制备方法，其制备方法与实施例1区别仅在于血管口径由3cm增至6cm，故每个区域的宽度也为适配该内径适当增加。该人工透析用静动脉瘘的支架材料可以使用PCL、PLGA、PLC或PLA，支架上种植的细胞包括人体内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，制备方法与实施例1相同，控制支架上三层细胞层种植区域的厚度比由薄至厚依次为1：30：500。
实施例10
一种人工透析用静动脉瘘的制备方法，参照实施例9，不同之处在于，控制支架上三层细胞层种植区域的厚度比由薄至厚依次为1：2：4。
实施例11
本实施例提供了一种人工透析用静动脉瘘的制备方法，其制备方法与实施例1区别在于血管口径由3cm增至6cm，且只拥有两层结构：平滑肌层以及成纤维层，故每个区域的宽度也为适配该内径适当增加。该人工透析用静动脉瘘的支架材料可以使用PGLA、PLC或PLA，支架上种植的细胞为人体内皮细胞和平滑肌细胞，制备方法与实施例1相同，控制支架上两层细胞层种植区域的厚度比由薄至厚为1：20。
实施例12
一种人工透析用静动脉瘘的制备方法，参照实施例11，不同之处在于，控制支架上两层细胞层种植区域的厚度比由薄至厚为1：2。
实施例13
一种人工透析用静动脉瘘的制备方法，参照实施例11，不同之处在于，控制支架上两层细胞层种植区域的厚度比由薄至厚为1：80。
实施例14
一种人工透析用静动脉瘘的制备方法，参照实施例11，不同之处在于，控制支架上两层细胞层种植区域的厚度比由薄至厚为1：40。
实施例15
本实施例提供了一种人工肠道器官的制备方法，其制备方法与实施例1的区别在于：肠道内壁干细胞区域的支架由含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的水凝胶制备。将肠道干细胞嵌入到水凝胶中，通过悬浮培养的方式将干细胞和水凝胶混合在一起，使其均匀分布在凝胶中。使用405nm光照射来降解和软化水凝胶基质，从而控制凝胶的时空特异性。可以通过控制光照的位置和时间来控制干细胞在凝胶中的生长和分化。控制人工肠道支架厚度比由薄至厚依次为1:2:10:35。通过微影技术，将每个凝胶图案化成20μm×300μm的体内隐窝尺寸，并将其置于分化培养基中。培养凝胶中的干细胞。在分化培养基(EGF、Noggin和R-spondin)中诱导分化和隐窝绒毛图案化，使干细胞在凝胶中分化成不同的细胞类型，并形成隐窝绒毛结构。该人工肠道组织的支架材料可以使用PPDO、PHBV、HA或PLC，支架上种植的细胞为肠道干细胞和平滑肌细胞，支架制备方法包括实施例1中的方法，同时还可以采用以下方法：使用微影转印技术将肠道隐窝以及绒毛的图案刻蚀到晶元上。该技术首先使用微影技术将图案通过光刻胶以及光刻机刻蚀到晶元上，然后将图案转印到PDMS磨具上。接下来，磨具倒扣在水凝胶层上，通过挤压和升温固化的方式，将绒毛和隐窝的三维结构转印到支架上。这种技术可以在支架表面精确复制肠道绒毛和隐窝的形态，从而模拟肠道的微观结构。该肠道组织中还设计有微观拓扑结构是由肠道绒毛以及肠道隐窝构成。绒毛径向长度为1200至1600μm，轴向宽度为300至600μm，隐窝颈口直径为2至10μm，腔内直径约为40至50μm(结构如图21)。
实施例16
一种人工肠道器官的制备方法，参照实施例15，不同之处在于，控制人工肠道支架厚度比由薄至厚依次为1:2:500:2000。
实施例17
一种人工肠道器官的制备方法，参照实施例15，不同之处在于，控制人工肠道支架厚度比由薄至厚依次为1:50:300:1000。
实施例18
一种人工肠道器官的制备方法，参照实施例15，不同之处在于，控制人工肠道支架厚度比由薄至厚依次为1:80:700:3000。
实施例19
本实施例提供了一种人工神经的制备方法，其制备方法与实施例1区别仅在于所述人工神经，人工神经支架厚度比由薄至厚为1:50。于所述神经位于卷曲起始端的疏松支架区域设有沿轴向分布的棱状突泡，所述棱状突泡在内层的分布密度为10-15个每毫米，长度为5-20毫米，每个棱状突泡间相互独立，由1-8微米的致密层相互分割。该人工神经支架使用的材料可以是HA、PLGA、PDO或PLC，支架上不同细胞种植区域种植的细胞分别为神经细胞、神经胶质细胞和施万细胞，支架制备方法可以为：使用微印转印技术，先制成有棱状突起结构的晶元，随后将此三维结构转印至水凝胶支架上，随后沿棱状结构的短边方向卷曲，使得其长边与管状组织的轴相平行。也可使用低温烫印技术，将棱状突起间的区域进行低温烫印收缩，使用的烫印模具为与棱状突起相互错开的图案，使用30至180摄氏度，压力在20至100kPa，烫印时间选用10至120分钟。另外，于所述神经位于卷曲起始端的疏松支架区域设有沿轴向分布的棱状突泡，所述棱状突泡在内层的分布密度为10-15个每毫米，长度为5-20毫米，每个棱状突泡间相互独立，由1-8微米的致密层相互分割(结构如图22)。
实施例20
本实施例提供了一种人工气管的制备方法，本人工气管产品直径1.2-2.0cm，长度5-10cm，气管管壁厚度约为1.5mm，并具有纵向延伸性和横向刚度。气管存在四层结构：气管内皮细胞层，平滑肌细胞层，软骨细胞层，以及成纤维细胞层，其中各层厚度比由薄至厚依次为1：9：38：56。
其制备方法与实施例1区别在于软骨细胞层使用复合结构，于厚度0.7mm致密疏松层形成，赋予机械强度较高的高分子波纹支撑结构。高分子材料优选聚-ε-己内酯(PCL)，通过熔积成型法3D打印，或静电纺丝，形成上窄下宽梯形柱，梯形柱上底0.9mm，侧边与垂直夹角35°±1.5°，长度占致密疏松层80％，居中以3mm间隔排列，通过超声焊接的方法进行对接。以高细胞密度构象培养软骨细胞并补充转化生长因子β(TGF-β)，在长时间的机械刺激下，生成软骨结构，并分泌II型胶原蛋白(COL2)和聚集蛋白聚糖(ACAN)，以及软骨ECM。卷曲后制成C形软骨环支架，软骨环实现纵向伸展和弯曲，内部区域受到压缩，而外部区域则承受张力，拉伸平衡模量在1到20MPa之间以适应隔膜收缩、肺膨胀和颈部运动。同时，C型环形结构，实现平滑肌细胞与成纤维细胞区域于空隙区域的迁移，拥有和自体气管相匹配的辐向以及轴向延展性，并实现自体微血管组织的生长浸润。
实施例21
本实施例提供一种人工消化道的制备方法，参照实施例1。对本实施例中的人工消化道作以下具体说明：
1.小肠
本人工小肠内直径为15mm至30mm，该组织存在四层结构：内层、基底层、中层和外层，管壁厚度t与内径d之间存在t约等于d/7的关系。该人工小肠支架的制备方法为：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比为1：2：25：35。
小肠具有较为复杂的内层拓扑结构，以便于播种后肠道干性细胞的分化以及新陈代谢。该拓扑结构可具体归类于微观拓扑结构以及宏观拓扑结构。微观拓扑结构由肠道绒毛以及肠道隐窝构成。绒毛径向长度为1200至1600μm，轴向宽度为300至600μm，隐窝颈口直径为2至10μm，腔内直径约为40至50μm。宏观结构由轴向的褶皱构成类似于自然结构中的克尔克林襞，用于减缓食物在肠道中的移动速度，该结构在轴向呈高度为4至7mm，宽度为2至3mm的突起。这两种拓扑结构可以通过不同方法制备获得。
2.大肠
本人工大肠内直径为40mm至50mm。该组织存在四层结构：内层、基底层、中层和外层，管壁厚度t与内径d之间存在t约等于d/15至d/7的关系。该人工大肠支架的制备方法为：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比为1：4：30：35。
大肠也具有较为复杂的内层拓扑结构，主要由肠道隐窝构成。隐窝在内层的分布密度约为100个每平方毫米。其径向深度为1500至2200μm，直径为400至500μm。该拓扑结构可以通过不同方法制备获得。
实施例22
本实施例提供一种人工食道的制备方法，参照实施例1。对本实施例中的人工食道作以下具体说明：
本人工食道内直径为18至22mm。该组织有四层结构：内层、基底层、中层和外层，管壁厚度t与内径d之间存在t约等于d/4。该人工食道支架的制备方法为：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比为1：2：5：20。
本人工食道的内壁不存在特殊的拓扑结构，其表面光滑，利于自体血管干细胞向血管内皮细胞进行分化。
实施例23
本实施例提供一种人工气管的制备方法，参照实施例1。对本实施例中的人工气管作以下具体说明：
本人工气管直径为10-23mm。这种气管存在四层结构：内层、基底层、中层和外层，同时管壁厚度t与内径d之间存在t约等于d/6的关系。气管管壁厚度约为3000μm，该人工气管支架的制备方法为：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比为1：9：15：26。
值得注意的是，本人工气管的中层两部分组成，圆周的四分之一为疏松高分子支架，另外四分之三是由机械强度较高的高分子材料制成的。此高分子材料的特征在于可以承受5～10MPa的轴向应力而不发生断裂。这段材料用于仿真自体气管的透明软骨。在长时间的机械刺激下，播种的软骨细胞分泌二型胶原蛋白以及硫酸软骨素，促进植入后自体干性细胞在此处向软骨细胞分化。
本人工气管的内壁不存在特殊的拓扑结构，其表面光滑，利于自体干性细胞向气管内粘膜细胞进行分化。然而其中层结构中的高强度区域呈宽度为环状沿轴向分布，每个间距3-9mm，每个环宽约为7-9mm。
实施例24
人工男性尿道的制备，包括如下步骤：
(1)支架的制备；
(2)支架上种植细胞；
(3)卷曲成三维管状结构并进行体外培养；
其中，支架材料及制备工艺按照实施例1中提及的方法。
本人工男性尿道直径为5-7mm。这种尿道存在三层结构：内层、中层和外层，同时管壁厚度t与直径d之间存在t约等于d/1.2的关系。尿道壁厚度约为2-2.6mm，人工男性尿道支架的制备方法为：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比为1：4：10。
值得注意的是，本人工气管的中层由松散且有弹性的高分子材料制成。本人工男性尿道的内壁不存在特殊的拓扑结构，其表面光滑。
实施例25
人工女性尿道的制备，包括如下步骤：
(1)支架的制备；
(2)支架上种植细胞；
(3)卷曲成三维管状结构并进行体外培养；
其中，支架材料及制备工艺按照实施例1中提及的方法。
本人工女性尿道内直径为5-7mm。这种尿道存在三层结构：内层、中层和外层，同时管壁厚度t与内径d之间存在t约等于d/1.5的关系。尿道壁厚度约为2-2.6μm，该女性尿道支架的制备方法为：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比为1：27：60。
本人工女性尿道的内壁不存在特殊的拓扑结构，其表面光滑。
实施例26
人工输卵管的制备，包括如下步骤：
(1)支架的制备；
(2)支架上种植细胞；
(3)卷曲成三维管状结构并进行体外培养；
其中，支架材料及制备工艺按照实施例1中提及的方法。
本人工输卵管直径为5至12mm。该组织存在四层结构：内层、基底层、中层和外层，管壁厚度t与内径d之间存在t约等于d/6的关系。人工输卵管支架的制备方法为：将所述支架划分为四个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制四个不同区域的支架厚度比为1：2：3：20。
输卵管具有较为复杂的内层拓扑结构，以便于播种后干性细胞向粘膜细胞分化。于输卵管组织支架靠近卷曲起始端的细胞种植区域内设有绒毛结构，该绒毛结构在轴向呈高度为10至11μm，直径为0.2-0.3μm的突起。
实施例27
人工输精管的制备，包括如下步骤：
(1)支架的制备；
(2)支架上种植细胞；
(3)卷曲成三维管状结构并进行体外培养；
其中，支架材料及制备工艺按照实施例1中提及的方法。
本人工输精管直径为5至7mm。该组织存在三层结构：内层、中层和外层，管壁厚度t与内径d之间存在t约等于d/6的关系。该人工输精管支架的制备方法为：将所述支架划分为三个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制三个不同区域的支架厚度比为1：4：16。
输精管具有较为复杂的内层拓扑结构，以便于播种后干性细胞向粘膜细胞分化。本人工输精管的内壁不存在特殊的拓扑结构，其表面光滑。
实验例28
人工神经组织的制备，包括如下步骤：
(1)支架的制备；
(2)支架上种植细胞；
(3)卷曲成三维管状结构并进行体外培养；
其中，支架材料及制备工艺按照实施例1中提及的方法。
本人工神经组织存在两层结构，内层和外层。该人工神经组织支架的制备方法为：将所述支架划分为两个不同的细胞种植区域，从卷曲起始端到卷曲末端控制两个不同区域的支架厚度比为1：20。
上述人工神经组织可以有几根双层神经捆扎成束，捆扎而成的人工神经由两层外皮组织包裹，从卷曲起始到卷曲末端控制二个不同区域的支架厚度比为1：12。
本人工神经具有较复杂的拓扑结构，于所述神经位于卷曲起始端的疏松支架区域设有沿轴向分布的棱状突泡，所述棱状突泡在内层的分布密度为10-15个每毫米，长度为5-20毫米，每个棱状突泡间相互独立，由1-8微米的致密层相互分割。
实施例29
血管组织的细胞种植三维图案化
(1)制备该类管状血管组织通常为毡型，有较大的孔隙率同时孔隙具有一定弹性在针头扎入之后有回弹修复孔隙的能力，同时因为操作时其需要被水平固定在细胞种植仪器上，其结构具有一定刚性。制备此类毡型支架时首先使用现有由高生物相容性可降解或不可降解材料做制成的毡布通过蜷曲的方式，形成管状支架并利用针扎的方式将其接缝处的纤维交叉融合。支架的厚度可以通过卷曲的层数进行控制，其厚度在100μm至500μm不等；
(2)支架管的两端对接上由高生物相容性不可降解弹性材料所制成的套筒，其接缝处使用手术缝合线紧密缝合。最外侧两端对接上一组鲁尔快接头的公头部分，通过缝合线与这段接头进行固定。随后这段支架可以通过快接的方式同细胞种植设备进行对接固定；
(3)在开始培养时须确保所有必需补料瓶中的液体有充足的余量，同时细胞悬液和PBS保持在适宜其生长活性的37摄氏度。针头在使用前一直处于清洗槽位置并时刻浸泡在75％酒精中。
(4)内皮细胞种植，种植前，打开内皮细胞悬液器皿中的搅拌装置，这一步是为了使细胞均匀悬浮在液体中，以免种植细胞时针头挤出的细胞分布不匀。首先，将清洗槽中的酒精排空并液路控制补料瓶4使用100-150mL的PBS使用气泵直接向针头输液清洗管路。需要注意的是管路需定时进行清洗灭菌或者跟换，此处的清洗是将针头处的酒精排出洗净以避免有残留酒精杀死种植用细胞。随后使用电磁阀关闭补料瓶4，并打开补料瓶1，将内皮细胞通过气泵向针头传递直到从针头排出的液体从无色变为培养液的玫红色。此时将气泵压力维持在标准大气压稍高0.5至1kPa，使得导管内液体维持在不受外力影响不会被挤出的状态，至此准备工作完成；
(5)通过控制丝杆1和丝杠1将针头移动到与管状支架最左端距离2-3mm处。随后将针头插入支架内壁区域以种植内皮细胞。内壁的位置由不同厚薄的管壁和所需细胞所占的厚度决定。例如现有一根6mm内径500μm厚度的血管，作为内皮细胞需要攀附一层内壁，内壁在此处的定义为离最外侧450μm处。针头将通过距离传感器和丝杆2丝杠2被插入管壁450μm的深度，并在此处通过压电材料挤出1-5μm的内皮细胞。随后抬起针头，疏水性的针头可以保证种植的细胞悬液滴被留在种植的位置。针头向右移动300-500μm并开始同样的操作直到针头完成离管状支架最右端距离2毫米处。此排细胞完成种植后，管状支架通过伺服电机1旋转2度并开始下一轮内皮细胞种植；
(6)当整根支架内壁均已种植上内皮细胞(支架被旋转一周)后，针头移至清洗槽进行超纯水冲洗清洗，关闭电磁夹管阀1打开电磁夹管阀4使用补料瓶4中的PBS对管路进行清洗，停止补料瓶1中内皮细胞的搅拌，并开始补料瓶2中平滑肌细胞的搅拌。关闭电磁夹管阀4打开电磁夹管阀2利用气泵将平滑肌细胞悬液流向针头直到流出液体颜色从无色变为细胞培养液的玫红色。此时将气泵压力维持在标准大气压稍高0.5至1kPa，使得导管内液体维持在不受外力影响不会被挤出的状态；
(7)针头通过丝杆1和丝杠1移至离左侧套桶缝合处5mm区域开始在套筒上方1mm处向下使用气泵向下滴落15-20μL细胞液体，随后向右移动1mm并再次滴落细胞液体，直到针头位于套桶右侧2-3mm处。这一步的目的是为了使平滑肌细胞可以渗透套桶和支架的缝合处，使得初步培养后的血管细胞在接缝处形成致密细胞群落以保证支架在培养后期不会出现渗漏或者因支架溶解而发生的断裂。同理位于右侧的套桶也需完成同样的操作。平滑肌细胞主要分布于血管中层以起到良好的力学性能。所以针头在丝杆2和丝杠2的引导下扎入支架壁的300μm处，通过气泵向支架内部输入平滑肌细胞悬液。每次注射的间隔为500-1000μm。在将支架旋转一周之后进行下一种细胞的种植；
(8)经过相同的换细胞液步骤，针头将成纤维细胞悬液注射分布在距支架壁最外侧100μm的深度，以与上文提及的方法注射10-15μl的成纤维细胞，直至整个支架表面布满成纤维细胞。至此细胞种植完成，针头收入清洗槽进行清洗及保存。准备下一次细胞种植；
(9)值得注意的是本实施例中提及了两种细胞种植的出液方法，当需要小体积出液(μL级)时，使用压电材料驱动。到需要使用较大体积液体(10-100μL)时直接控制气泵进行液体控制；
(10)种植完的组织会被从设备上的母接头取下，进入下一步的培养。
实施例30
肠道组织的细胞种植三维图案化
(1)此实施例的与实施例29中描述的血管三维细胞种植的区别在于肠道的内皮表面需要拥有优选的拓扑结构，例如绒毛和内凹，且相比血管肠道的内径更加大(大于10mm)。针对这两个特点，优先采用先平面种植细胞再三维构成的方法。
(2)与实施例29的具体区别有，使用的细胞种类不同以及分布顺序不同。其分布具体顺序为肠道内皮细胞，成纤维细胞，平滑肌细胞。例如一根长12cm，10mm内径500μm壁厚肠道，需长为140mm平面支架，拥有长32mm肠道内皮细胞，长33mm成纤维细胞，剩余部分为平滑肌细胞。
(3)另有具体区别在于上文描述的拓扑结构需要使用胶型材料(例如水凝胶)构成，其具体构成方法为：在平面支架上放置与水凝胶所需要区域大小一致的PDMS模具，使用上文举例，其大小为32mm×100mm，高5mm壁厚4mm的方框，细胞种植机先将水凝胶注入此模具。随后传送带将带有模具以及水凝胶的支架送至三维结构图案化区域，此区域有通过光刻硅片翻模制成的PDMS印章，在丝杆与丝杠的作用下该印章会下降并在水凝胶上压出如上文所述的绒毛以及内凹结构，同时将水凝胶进行加热完成固化。完成固化后，印章四周的机械钩爪会将PDMS模具从支架上剥离并连同印章一起丢弃。随后支架被传送回细胞种植区域完成与实施例29中类似的细胞种植，以及与实施例29中类似的组织卷曲。至此人工肠道完成细胞种植并可进入下一步培养阶段。
(4)使用本卷曲方法的一大优点是，成纤维细胞极易向其他细胞层迁移容易干涉到肠道内皮细胞从而影响肠道组织的功能，通过卷曲可降解支架，支架本身可以充当培养前期的物理屏障，从而保证培养完成后的肠道功能不受影响。
实施例31
人造肌肉组织的细胞种植三维图案化
(1)为了生成致密肌肉细胞以模拟肉类的质感，本实施例通过对平面支架进行圆角棱状三维平面化后再行卷曲，使得棱与棱间的间隙构成管状空腔以实现培养时的细胞内外物质交换。
(2)本具体实施方案的过程类似于实施例30中所描述的在膜型支架上添加模具灌注水凝胶，水凝胶三维图案化，细胞种植。不同点在于，细胞种植后会进行紧密的三维卷曲，与实施例30的区别在于中间只有一个较组织而言可忽略不计的内腔。同时本实施例中只使用一种牛骨骼肌细胞。例如需要形成一根1.5cm粗10cm长的肌肉组织，需一张长宽36cm×11cm的平面支架。此平面支架上使用一个内部长35cm宽10cm高5mm，壁厚5mm的PDMS模具。随后使用不同的PDMS印章，具体区别在于不同于模拟肠道内壁的印章，该印章可以形成高500μm间隔300μm的圆边棱状凸起。在完成水凝胶支架内部细胞种植之后，整张平面支架将被传送至卷曲装置处，进行如同实施例30中描述的但是内径为0.5mm的卷曲。最后形成的组织如图所示。完成卷曲的组织可进入下一步培养。
(3)使用本卷曲方法构成的三维肌肉组织的优势在于，可以在肌肉组织周围形成可供物质交换的毛细通道，以提高致密肌肉组织在培养过程中整体存活率。
实施例32
皮肤组织的细胞种植及三维图案化
具体方法参照实施例1，皮肤本身作为平面组织不需要进行卷曲，其三维结构具体体现于每层结构中使用的细胞不同，所以相较于在平面支架的不同区域进行细胞图案化，本实施例将在同样区域的不同深度滴注不同细胞以达到三维图案化的目的。例如一张长宽10cm×10cm厚度500μm的皮肤需要一张11cm×11cm厚200μm的膜状支架并在其10cm×10cm的区域内使用与实施例30中描述的水凝胶构成法灌注水凝胶，区别在于此处只需形成一个厚为300μm的水凝胶层，无需三维图案化。在形成水凝胶层后，在不同深度种植不同细胞，250μm深度为成纤维细胞，150μm深度为真皮细胞，100μm深度为表皮细胞。另一个不同点在于，相较于在支架两端缝合弹性不可降解材料，此处的皮肤组织支架在四周缝有弹性不可降解材料，并使用平滑肌细胞对缝合处进行加固。种植完成后的细胞支架将开始其下一步培养。
以上实施例中，只要在本发明保护范围内的支架厚度比设计，均能够很好消除层与层之间的空腔，使得人工组织材料在植入后三个月的空腔率低于2％，但不在本发明保护范围内的支架厚度比设计，均无法很好消除层与层之间的空腔，即使初始的空腔率低于5％，后续第三阶段的空腔率也回升至8-15％，在此发明人不一一列举。
Claims (31)
1.一种三维人工管状组织的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备可卷曲的支架；
（2）在支架上种植细胞；
（3）将步骤（2）所得物卷曲成三维管状结构并进行体外培养，即得所述三维人工管状组织；
其中，所述可卷曲的支架的制备方法包括以下任一种：
方法一：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为两个不同的细胞种植区域，控制两个不同的细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够包裹内层的管状层；并控制两个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚为1 : 2~80；
方法二：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够依次包裹位于内层的管状层；并控制三个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚依次为1 : 2~80 : 2~3000；
方法三：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为四个不同的细胞种植区域，控制四个不同细胞种植区域的宽度沿支架卷曲方向能够使得不同细胞种植区域经卷曲后各自形成至少一圈完整的管状层，且卷曲后位于外层的管状层能够依次包裹位于内层的管状层；并控制四个不同细胞种植区域中支架的厚度比由薄至厚依次为1 : 2~80 : 2~700 : 2~3000。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述支架包括致密支架和疏松支架，所述疏松支架的孔隙率和孔径大小均大于所述致密支架。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述疏松支架的厚度为20-5000μm，孔隙率为90%以上，孔径大小为20-1000μm，纤维直径为0.05-30µm；所述致密支架的厚度为1-200μm，孔隙率为59-90%，孔径大小为0.05-500μm，纤维直径为0.05-30µm。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述疏松支架和致密支架的制备工艺包括浇筑、微注塑成型、吹筑、挤筑、压延、吹膜挤压、旋转成型、浸涂、2D打印、烫印、熔喷、水纺、针纺、静电纺丝、熔融纺丝、融喷纺丝、热粘合、化学粘合、水刺或针刺的非织造工艺中的任一种或多种。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述疏松支架和致密支架采用的材料包括PGA、PLA、PCL、PLC、PPDO、PHBV、HA、PU、PET、PP、PE、PA、PMMA、PTFE、PES、PEEK、PS、PC、PGA-TMC、PGA-CL、壳聚糖或胶原蛋白中的至少一种，或是它们的共聚物材料。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括神经组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为两个不同的细胞种植区域，控制两个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚为1:20~50。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，神经组织的支架还包含双层神经捆扎成束的结构，捆扎成束的神经由两层外皮组织包裹，从卷曲起始到卷曲末端控制捆扎成束的神经的厚度比为1:12~24。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，于神经支架位于卷曲起始端的区域内还设有沿轴向分布的棱状突泡，所述棱状突泡的分布密度为10-15个每毫米，长度为5-20毫米，每个棱状突泡间相互独立，由1-8微米的致密层相互分割。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括中口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为两个不同的细胞种植区域，控制两个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚为1:3~75；或者，在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:3~58:3~60。
10.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括小口径动脉血管组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2~25:3~48。
11.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括中口径静脉血管组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2~38:3~70。
12.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括小口径静脉血管组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:5~50:7~66。
13.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括女性尿道组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:5~27:8~60。
14.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括男性尿道组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4~28:10~66。
15.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括输精管组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为三个不同的细胞种植区域，控制三个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4~700:16~1000。
16.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括肠道组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为四个不同的细胞种植区域，控制四个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2~4:2~30:3~35。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述肠道组织包括小肠，于小肠支架位于卷曲起始端区域内还设有在轴向呈高度为4-7 mm，宽度为2-3 mm的突起。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述突起包括绒毛和隐窝，其中，绒毛径向长度为1200-1600µm，轴向宽度为300-600µm；隐窝颈口直径为2-10µm，腔内直径为40-50µm。
19.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述肠道组织包括大肠，于大肠支架位于卷曲起始端的支架区域内还设有隐窝，所述隐窝在内层的分布密度为100个每平方毫米，隐窝径向深度为1500-2200µm，直径为400-500µm。
20.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括食道组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为四个不同的细胞种植区域，控制四个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2~100:5~600:20~1000。
21.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括气管组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为四个不同的细胞种植区域，控制四个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:4~9:15~38:25~56。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，在气管组织支架从卷曲起始端起第三个细胞种植区域内，还包含一部分为由机械强度高于5~10MPa的高分子材料或者软骨细胞制成。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，机械强度高的区域呈环状，并且有至少一处开口。
24.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述三维人工管状组织包括输卵管组织，其支架的制备方法包括：在可卷曲的支架上从卷曲起始端到卷曲末端依次划分为四个不同的细胞种植区域，控制四个不同细胞种植区域的支架厚度比由薄至厚依次为1:2~150:3~300:20~1000。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，于输卵管组织支架靠近卷曲起始端的细胞种植区域内还设有绒毛结构，所述绒毛结构为在轴向呈高度为10-11µm，直径为0.2-0.3µm的突起。
26.由权利要求1-25任一项所述制备方法得到的三维人工管状组织。
27.根据权利要求26所述的三维人工管状组织，其特征在于，所述三维人工管状组织包括人工神经、人工动脉血管、人工静脉血管、人工小肠、人工大肠、人工食道、人工气管、人工尿道、人工输卵管和人工输精管。
28.根据权利要求27所述的三维人工管状组织，其特征在于，所述人工动脉血管包括中口径动脉血管和小口径动脉血管。
29.根据权利要求27所述的三维人工管状组织，其特征在于，所述人工静脉血管包括中口径静脉血管和小口径静脉血管。
30.根据权利要求27所述的三维人工管状组织，其特征在于，所述人工尿道包括男性尿道和女性尿道。
31.由权利要求1-25任一项所述方法制备得到三维人工管状组织或如权利要求26-30任一项所述的三维人工管状组织在制备成受损组织的替代物或体内植入物方面的应用。
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