CN112891631A - 一种植物源导管及其在修复神经损伤中的应用 - Google Patents

一种植物源导管及其在修复神经损伤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物源导管及其在修复神经损伤中的应用，属于生物材料和组织工程技术领域。本发明所述的制备植物源导管的方法，包括如下步骤：(1)自节节草茎杆节间段导管，用水浸泡；(2)将步骤(1)的导管在酸溶液中反应，反应结束之后取出，洗涤至中性后放入碱溶液中反应，反应结束后洗涤至中性；(3)将步骤(2)的导管用胰酶与木瓜蛋白酶消化；(4)将步骤(3)的导管剔除导管内外壁的肉质层，保留导管的完整纤维结构；(5)将步骤(4)得到的导管脱水，即得到植物源导管。本发明植物源导管取材方便，自然界广泛存在，为移植的细胞及神经再生提供稳定持久的3D空间；对神经修复再生也有一定地形导向作用。

Description

一种植物源导管及其在修复神经损伤中的应用
技术领域
本发明涉及一种植物源导管及其在修复神经损伤中的应用，属于生物材料和组织工程技术领域。
背景技术
周围神经损伤后自我恢复过程缓慢，由于受到周围组织形成的疤痕影响，损伤神经往往不能完全再生，造成神经支配部位的感觉和运动功能障碍，严重影响患者的生活质量。目前，在临床治疗中仍将自体神经移植作为神经缺损修复的“金标准”。然而，自体神经移植存在很多局限性，例如供体来源不足、需要额外切口、神经匹配问题，还可能引起一些严重的并发症如供区神经功能丧失、炎症反应等；使得其应用受到了限制。因此，人工构建的神经导管移植已经成为一种修复周围神经损伤的很有应用前景的治疗策略。
现有很多文献报道了利用人工构建的神经导管负载干细胞移植修复周围神经缺损的研究成果。然而，目前用于构建神经导管的生物材料主要包括壳聚糖、聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)、羟基乙酸共聚物(PLGA)等，这些生物材料构建神经导管的工艺较为复杂，产品成本高。
因此，如何制备一种材料易得、制作工艺简单、生物形容性好的神经导管是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述至少一个问题，本发明选择节节草的管状茎秆来制作植物源导管，并将其和干细胞结合实现了神经损伤的修复。
本发明的第一个目的是提供一种制备植物源导管的方法，包括如下步骤：
(1)自节节草茎杆节间段导管，用水浸泡；
(2)将步骤(1)浸泡之后的导管在酸溶液中反应，反应结束之后取出，洗涤至中性后放入碱溶液中反应，反应结束后洗涤至中性；
(3)将步骤(2)得到的导管用胰酶与木瓜蛋白酶消化；
(4)将步骤(3)得到的导管剔除导管内外壁的肉质层，保留导管的完整纤维结构；
(5)将步骤(4)得到的导管脱水，即得到所述的植物源导管。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的浸泡时间为24h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的导管长度为1cm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的酸溶液为硫酸溶液，进一步优选为质量分数为10％的硫酸溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的在酸溶液中反应的条件为：在60℃水浴条件下反应40min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的碱溶液为氢氧化钠溶液，进一步优选为质量分数为10％的氢氧化钠溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的在碱溶液中反应的条件为在60℃水浴条件下反应20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中1cm的导管在300mL的酸溶液和300mL的碱溶液进行反应。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的用胰酶与木瓜蛋白酶消化具体为：先用胰酶在37℃下处理30min，其中胰酶的用量是导管质量的0.5％；再用1％的木瓜蛋白酶在37℃下处理30min；其中木瓜蛋白酶的用量是导管质量的1％。
在本发明的一种实施方式中，所述的胰酶、木瓜蛋白酶购自Sigma公司，酶活为10U/mg。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的剔除导管内外壁的肉质层是采用银质探针。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)所述的脱水是采用梯度乙醇脱水，梯度乙醇的浓度分别为15％、25％、35％、55％、85％、95％。
在本发明的一种实施方式中，本发明制备得到的植物源导管置于冰箱4℃保存。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备植物源导管的方法，包括如下步骤：
(1)自节节草茎杆节间段截取导管，在水中浸泡24h；
(2)将步骤(1)得到的导管置于质量分数为10％硫酸溶液中，在60℃水浴条件下反应40min取出，用水清洗至中性；再将处理之后的导管置于质量分数为10％的氢氧化钠溶液中，在60℃水浴条件下反应20min取出，用水清洗至中性；
(3)将步骤(2)得到的导管先用胰酶在37℃下处理30min，再用木瓜蛋白酶在37℃下处理30min；其中胰酶的用量是导管质量的0.5％，木瓜蛋白酶的用量是导管质量的1％；
(4)将步骤(3)得到的导管用银质探针仔细剔除导管内外壁的肉质层，保留导管的完整纤维结构；
(5)将步骤(4)得到的导管用浓度为15％、25％、35％、55％、85％、95％的乙醇溶液进行脱水，使导管变成半透明管状，得到所述的植物源导管。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的植物源导管。
本发明的第三个目的是本发明所述的植物源导管在修复神经损伤中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是在植物源导管表面接种EMSCs实现神经损伤的修复。
在本发明的一种实施方式中，所述应用中植物源导管表面接种EMSCs包括如下步骤：
(1)植物源导管的纤维蛋白修饰：
用纤维蛋白原溶液浸泡本发明制备得到的植物源导管，取出导管，在导管表面边滴加凝血酶溶液，使纤维蛋白原溶液在导管表面凝固成胶状涂层；取出导管，干燥，得到蛋白修饰的植物源导管；
(2)EMSCs的取材培养；
(3)将步骤(2)得到的EMSCs接种至纤维蛋白修饰的植物源导管。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的浸泡时间为10min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的凝血酶溶液的浓度为40U/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的干燥是置于真空干燥箱37℃烘干1.5h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的EMSCs的取材培养具体为：
SD大鼠颈椎脱位处死，于无菌操作台中，在无菌条件下经鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，完整取出鼻中隔，剪取中下三分之二部分，置于4℃PBS中，分离全层鼻粘膜，弃去鼻中隔软骨；鼻粘膜取出后用无血清DMEM/F12漂洗3次，眼科剪充分剪碎，离心弃上清，用0.25％胰酶37℃消化10min，PBS漂洗3次，离心，接种于培养瓶加入含10％FBS的DMEM/F12(含青霉素200U/ml和链霉素200U/ml)培养瓶，置于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的EMSCs接种至纤维蛋白修饰的植物源导管具体为：
在无菌超净台中，将蛋白修饰的植物源导管沿长轴剪开并用砝码(50g)压平成膜片，放置在超净台中备用；将20μL的纤维蛋白原溶液(40mg/mL)和5μL凝血酶(40U/mL)均匀涂布于24孔培养板孔底用于黏附固定植物源导管膜片，立即将压平的植物源导管膜片粘贴在纤维蛋白胶上(导管内表面向上)并用砝码(50g)压平，以利于接种细胞。取出砝码，将EMSCs/培养基悬液滴加于植物源导管膜片表面(20μL/孔)，1h后细胞即可黏附于植物纤维导管表面。细胞黏附后在培养孔周边加入1ml含10％FBS的DMEM/F12培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是在植物源导管表面接种SHH-EMSCs实现神经损伤的修复。
在本发明的一种实施方式中，所述应用中植物源导管表面接种SHH-EMSCs包括如下步骤：
(1)植物源导管的层黏连蛋白修饰：
将本发明制备得到的植物源导管在层黏连蛋白(Laminin)溶液中浸泡，取出导管，干燥；之后再用京尼平溶液浸泡，干燥；得到层黏连蛋白修饰植物源导管；
(2)构建转SHH基因的EMSCs；
(3)将步骤(2)得到的转SHH基因的EMSCs接种至层黏连蛋白修饰的植物源导管。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中层黏连蛋白(Laminin)溶液的浓度为1μg/mL；浸泡时间为1h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中京尼平(Genipin)溶液的质量分数为1％，浸泡时间为1h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中转SHH基因的EMSCs的构建过程为：
将提取获得的第3代EMSCs接种于24孔培养板和6孔培养板内，其中一半孔加入以293A细胞扩增的SHH基因重组腺病毒液(孙勇,陈平波,史文涛,杨开元,毕士奇,张志坚,徐晓峰.重组SHH腺病毒纤维蛋白缓释支架对神经干细胞增殖与分化的影响[J].基础医学与临床,2019,39(08):1085-1090.)，得到转SHH基因的EMSCs。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的转SHH基因的EMSCs接种至纤维蛋白修饰的植物源导管具体为：
在无菌超净台中，将纤维蛋白修饰的植物纤维导管沿长轴剪开并用砝码(50g)压平成膜片，放置在超净台中备用；将20μl的纤维蛋白原溶液(40mg/ml)和5μl凝血酶(40U/ml)均匀涂布于24孔培养板孔底用于黏附固定植物源导管膜片，立即将压平的植物源导管膜片粘贴在纤维蛋白胶上(导管内表面向上)并用砝码(50g)压平，以利于接种细胞；取出砝码，将SHH-EMSCs/培养基悬液滴加于植物源导管膜片表面(20ul/孔)，1h后细胞即可黏附于植物纤维导管表面。细胞黏附后在培养孔周边轻轻加入1ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。培养2周后用4％多聚甲醛固定，甘油封片。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备得到的植物源导管负载EMSCs之后，可以移植至大鼠体内实现大鼠的坐骨神经损伤，可有效促进损伤神经再生和动物后肢运动功能恢复。
(2)本发明采取适合内径的节节草茎的节间部分作为植物源神经导管的原基，通过酸碱浸泡和蛋白酶消化等步骤去除草茎的肉质部分(主要成分是植物蛋白和可溶性多糖)，保留其纤维素成分和管状外形。由于去除了草茎的肉质部分，避免了植物源导管移植到体内的免疫排斥反应。去除肉质后的节节草茎节间部管壁呈半透明状，主要由平行纵向排列的粗纤维和网状排列的细纤维组成，具有较强的刚性和韧性以及通透性。由于管壁的纤维素不含RGD序列，不利于细胞黏附，进而本发明选择了合适的纤维蛋白修饰方法实现了负载细胞。
(3)纤维蛋白修饰导管可促进EMSCs黏附和平行纵向生长，表明修饰的植物源导管与EMSCs具有很好的生物形容性。
(4)本发明的植物源导管取材方便，自然界广泛存在，且植物纤维免疫原性弱；而且节节草天然具有牢固的管型结构及平行于管身的纵行条纹，为移植的细胞及神经再生提供稳定持久的3D空间；而且对细胞粘附有促进作用，引导细胞沿内壁条纹定向生长增殖，对神经修复再生也有一定地形导向作用。
(5)植物源导管联合SHH-EMSCs移植同时具备神经导管和干细胞移植治疗神经损伤的优势，细胞和导管互相作用共同维持一个有利于周围神经再生修复的微环境，促进缺损神经的再生及其感觉和功能的恢复。
附图说明
图1为植物源导管的形态特征和EMSCs在植物源导管上的生长性能；其中A：植物源导管；B.：由纤维蛋白修饰的植物源导管；C和D为纤维蛋白修饰的植物来源导管的表面微观图。
图2为EMSCs接种于植物源导管表面，培养14天后将导管与细胞固定，MBP和S100抗体染色阳性；其中A为S100抗体染色未经修饰的植物源导管表面；B为MBP抗体染色未经修饰的植物源导管表面；C为S100抗体染色纤维蛋白修饰的植物源导管表面；D为MBP抗体染色纤维蛋白修饰的植物源导管表面。
图3为植物源导管表面EMSCs增殖情况。
图4为植物源导管表面EMSCs蛋白表达情况；其中A为S100和MBP免疫印迹图，以actin为内参，B为统计图。
图5为体内移植的手术过程图，其中，A为暴露坐骨神经，B为坐骨神经缺损造模且断端缝合；C为植物源导管移植至坐骨神经缺损处，D为损伤部位用纤维蛋白填充。
图6中A为手术后坐骨神经及其桥接导管的大体形态特征和坐骨神经(a1)及桥接导管内再生神经纤维的免疫组织化学染色结果(a2)，其中B为植物源导管，C为对照组，D为植物源导管和EMSCs，E为假手术组的NF-200进行免疫组织化学染色。
图7为腓肠肌横截面HE染色：其中A为对照组的腓肠肌横截面；B为移植植物源导管组的腓肠肌横截面；C为移植植物源导管负载EMSCs组的腓肠肌横截面；D为假手术组的腓肠肌横截面；E为各组腓肠肌肌纤维横截面的面积统计图，a表示具有显著差异。
图8为术后5个月，脊髓L4-L5节段背根神经节切片荧光显微镜观察结果；其中A为对照组的背根神经节；B为移植植物源导管组的背根神经节；C为移植植物源导管负载EMSCs组的背根神经节；D为假手术组的背根神经节；E为各背根神经节内荧光金标记阳性细胞数量的统计图。
图9为再生神经组织内NF-200和MBP蛋白相对含量比较结果，其中，A为不同组小鼠再生组织中MBP和NF-200蛋白的，B为免疫印迹数据分析柱状图。
图10为动物术后5个月，脊髓L4-L5节段背根神经节切片荧光显微镜图；其中，A为对照组的背根神经节；B为移植植物源导管组的背根神经节；C为移植植物源导管负载EMSCs组的背根神经节；D为移植植物源导管负载SHH-EMSCs组的背根神经节；E为假手术组的背根神经节；F为各背根神经节内荧光金标记阳性细胞数量的统计图。
图11为导管移植后坐骨神经再生情况的形态学观察结果，其中A-D为不同大鼠的植物源导管桥接修复的坐骨神经标本；E-I为各组坐骨神经及导管组织切片的免疫组织化学染色显示NF-200阳性神经纤维，E为单纯损伤组，F为移植单纯植物源导管组；G为移植植物源导管和SHH-EMSCs组；H为移植植物源导管负载EMSCs组；I为假手术组；J为NF-200和MBP、Actin内参的Western blotting结果；K为各组蛋白相对内参的比值。
图12为腓肠肌横截面面积的测量结果，其中；其中A为对照组的腓肠肌横截面；B为移植植物源导管组的腓肠肌横截面；C为移植植物源导管负载EMSCs组的腓肠肌横截面；D为移植植物源导管负载SHH-EMSCs组；E为假手术组的腓肠肌横截面；F为各组腓肠肌肌纤维横截面的面积统计图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
测试方法：
1、免疫印迹与免疫荧光
收取接种于植物源导管上的EMSCs蛋白，BCA方法测定蛋白含量。用PBS将蛋白样品调整为蛋白浓度相等后与等体积上样缓冲液混匀并煮沸5min，置-80℃冰箱冻存备用。常规配制10％的分离胶和5％的浓缩胶，加样，电泳，转模，5％脱脂奶粉(TBS-T稀释)室温封闭1h。以小鼠抗MBP和鼠抗S100，小鼠抗β-tubulin为一抗(1:300)，4℃孵育过夜，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000)室温下孵育1h。ECL-Plus发光剂室温孵育5min，于分子成象系统扫描仪(TyPhoon 9400)上扫描。以Image J软件分析灰度值。目的蛋白与内参蛋白β-tubulin条带灰度的比值表示目的蛋白的相对含量。同时免疫荧光验证两种蛋白表达模式。
2、MTT细胞活性检测
分别于1、3、5、7、14d各取出植物源神经导管3片，弃去原培养液，分别加入2％MTT试剂液1mL，置于37℃培养箱内1h，取出后，每孔内滴加DMSO液1mL，用吸管反复吹打导管表面约1min，取96孔板，每孔内用吸液枪滴加200μL，于490nm波长下检测吸光度值(OD值)。
3、坐骨神经指数(sciatic functional index,SFI)测定：
手术后1、3、5月对四组大鼠进行足迹实验。将大鼠的左右脚掌涂抹红色印泥后在跑道中的宣纸上行走后获取足印。分别测量正常侧(N)和手术侧(E)足印长度(printlength,PL)、足趾宽度(toe spread,TS)和中间足趾距(intermediary toe spread,IT)。PL：足跟至足间的距离；TS：第1趾至第5趾连线距离；IT：第2趾至第4趾连线距离。
参照以下公式(1)计算SFI：
SFI＝-38.8×[(EPL-NPL)/NPL]+109.5×[(ETS-NTS)/NTS]+13.3×[(EIT-NIT)/NIT]-8.8 (1)
式中，SFI为0表示神经功能正常，SFI为-100表示神经功能完全丧失。
4、背根神经节荧光金逆行示踪；
实验动物处死前一周，以同上麻醉与手术方法按原切口入路游离坐骨神经，利用微量注射器吸取5μl 10％的荧光金试剂，在导管远端神经(分叉处)进入腓肠肌前约0.5cm注入荧光金试剂于坐骨神经内，缝合肌肉与皮肤。术后肌肉注射青霉素(5万μ/kg)1次/d，预防感染。术后第7d，对动物麻醉后进行4％多聚甲醛心脏灌注，取双侧背根神经节，石蜡包埋，连续切片。用荧光显微镜观测神经节荧光标记神经细胞的分布情况，挑选神经节最大切面，每组随机取6个高倍视野摄片，用Image J软件标记荧光标记神经细胞，并计算神经节内标记细胞的平均数量，进行统计分析。同时完整取出双侧坐骨神经和腓肠肌用于实验。
5、坐骨神经和腓肠肌的大体观以及腓肠肌的萎缩情况比较：
术后5月，利用4％多聚甲醛心脏灌注后按原切口解剖，大体观察各组导管两端的神经连接及生长情况。仔细分离并完整取出双侧坐骨神经(包括损伤近侧端、远侧端、损伤段以及导管)和腓肠肌。将左、右腓肠肌分别称重后计算腓肠肌湿重比率(损伤侧腓肠肌(g)/健侧腓肠肌(g)×100％)，比较各组动物腓肠肌的萎缩情况。
6、腓肠肌的肌纤维横截面面积比较
将置于4％多聚甲醛溶液中固定的神经与腓肠肌组织取出，经梯度酒精脱水，二甲苯中透明后，用石蜡包埋。将腓肠肌组织蜡块用切片机进行腓肠肌垂直切片、H-E染色，观察各组肌纤维的萎缩情况。每组随机取6个高倍视野摄片，用Image J软件标记肌纤维横截面，计算其平均面积并进行统计分析。
7、坐骨神经切片的免疫组织化学染色
将各组置于4％多聚甲醛溶液中固定的坐骨神经进行石蜡包埋，沿神经纤维长轴切片进行纵向切片，按照程序进行免疫组织化学染色：将切片浸入枸橼酸抗原修复液内，置于微波炉中火力加热5min，进行抗原修复。待其自然冷却，取出切片平放在湿盒中，滴加复合消化酶完全覆盖组织，37℃孵育15min，PBS漂洗5min×3次；用体积分数20％正常羊血清封闭液室温孵育15min；分别滴加小鼠抗NF-200抗体4℃孵育过夜；切片浸入PBS中放在摇床上振荡漂洗15min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗(HRP-IgG)，37℃孵育15min，PBS漂洗5min×3次。DAB/H2O2显色染液显色，显微镜下控制显色时间(约5min)，显色后充分漂洗。阴性对照试验用PBS代替一抗，其余步骤同上。苏木素复染，常规递升梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用显微镜观察NF-200阳性神经纤维在导管内的生长情况。
8、Western blotting检测再生神经蛋白含量
术后5个月各组大鼠麻醉后(不经固定)取出新鲜坐骨神经标本，称重后按10μl/mg组织加入RIPA裂解液，用组织匀浆器将组织研磨成匀浆，冰上裂解30min，超声进一步打碎组织，离心后取上清。用BCA方法测定蛋白含量。用PBS将蛋白样品调整为蛋白浓度相等后与等体积上样缓冲液混匀并煮沸5min，置-80℃冰箱冻存备用。常规配制10％的分离胶和5％的浓缩胶，加样，电泳，转模，5％脱脂奶粉(TBS-T稀释)室温封闭1h。以小鼠抗MBP和鼠抗NF-200，小鼠抗β-tubulin为一抗(1:300)，4℃孵育过夜，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000)室温下孵育1h。ECL-Plus发光剂室温孵育5min，于分子成像系统扫描仪(TyPhoon9400)上扫描。以Image J软件分析灰度值。目的蛋白与内参蛋白β-tubulin条带灰度的比值表示目的蛋白的相对含量。
9、统计学方法
使用SPSS 20统计软件对数据进行分析检验。以均数±标准差(x±s)表示每组结果，以单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计学检验。检验水准P<0.05表示差异有统计学意义。
实施例1
一种制备植物源导管的方法，包括如下步骤：
(1)自节节草茎杆节间段截取1cm长的导管，用去离子水中浸泡24h；
(2)将步骤(1)得到的导管置圆底烧瓶中以300mL质量分数为10％的硫酸溶液在60℃水浴条件下反应40min取出，用双蒸水清洗至中性；将导管置300mL质量分数为10％的氢氧化钠溶液中，在60℃水浴条件下反应20min取出，用双蒸水清洗至中性；
(3)将步骤(2)得到的导管先用胰酶在37℃下处理30min，再用木瓜蛋白酶在37℃下处理30 5min；其中胰酶的用量是导管质量的0.5％，木瓜蛋白酶的用量是导管质量的1％；
(4)将步骤(3)得到的导管用银质探针仔细剔除导管内外壁的肉质层，保留导管的完整纤维结构；
(5)将步骤(4)得到的导管用浓度分别为15％、25％、35％、55％、85％、95％梯度乙醇对导管脱水，使导管变成半透明管状，得到植物源导管。
实施例2
在植物源导管表面接种EMSCs实现神经损伤的修复，具体包括如下步骤：
(1)植物源导管的蛋白修饰：
用纤维蛋白原溶液(40mg/ml)浸泡经过实施例1制备得到的植物源导管10min，取出导管；在导管表面边滴加凝血酶溶液(40U/ml)边旋转导管，使纤维蛋白原溶液在导管表面凝固成胶状涂层；取出导管置真空干燥箱37℃烘干1.5h，得到蛋白修饰后的导管，置于冰箱4℃保存备用；
(2)EMSCs的取材培养；
SD大鼠颈椎脱位处死，于无菌操作台中，在无菌条件下经鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，完整取出鼻中隔，剪取中下三分之二部分，置于4℃PBS(磷酸盐缓冲溶液)中，分离全层鼻粘膜，弃去鼻中隔软骨；鼻粘膜取出后用无血清DMEM/F12漂洗3次，眼科剪充分剪碎，离心弃上清，用0.25％(相对于底物的质量分数)胰酶37℃消化10min，PBS漂洗3次，离心，接种于培养瓶加入含10％(相对于底物的质量分数)FBS的DMEM/F12(含青霉素200U/ml和链霉素200U/ml)培养瓶，置于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养；
(3)将步骤(2)得到的EMSCs接种至蛋白修饰的植物源导管，具体为：
在无菌超净台中，将步骤(1)蛋白修饰的植物源导管沿长轴剪开并用砝码(50g)压平成膜片，放置在超净台中备用；将20μL的纤维蛋白原溶液(40mg/mL)和5μL凝血酶(40U/mL)均匀涂布于24孔培养板孔底用于黏附固定植物源导管膜片，立即将压平的植物源导管膜片粘贴在纤维蛋白胶上(导管内表面向上)并用砝码(50g)压平，以利于接种细胞；取出砝码，将EMSCs/培养基悬液滴加于植物源导管膜片表面(20μL/孔)，1h后细胞即可黏附于植物纤维导管表面；细胞黏附后在培养孔周边加入1ml含10％FBS的DMEM/F12培养基。
(4)体内移植
将24只大鼠随机分为4组，每组各6只。动物经7％水合氯醛腹腔注射(0.5ml/100g)麻醉后，以俯卧位固定，右髋关节周围脱毛，碘伏消毒后铺洞巾，于右侧臀沟下缘向背面切开皮肤，分离臀部肌肉，在手术视野充分暴露、游离坐骨神经，在梨状肌下缘5mm以远切断坐骨神经，用7-0可吸收线松散缝合回缩的断端，使断端对准但仍保留5mm的间隙以制备坐骨神经缺损模型。移植植物源导管组将导管套于断端外，使断端与周围组织隔离，用40mg/ml纤维蛋白原溶液100μl和40U/ml凝血酶溶液20μl固定导管两端。移植植物源导管负载EMSCs组则将EMSCs(2×107)悬浮于纤维蛋白原溶液(50μl)中，注入导管内，随后注入凝血酶溶液10μl。假手术组大鼠在切开肌肉及游离神经后不对神经进行处理。分层缝合肌肉与皮肤，碘伏消毒。术后7d内肌肉注射青霉素(5万μ/kg)1次/d，预防感染。手术过程如图5。
图2为EMSCs接种于植物源导管表面，培养14天后将导管与细胞固定，MBP和S100抗体染色阳性；其中A为S100抗体染色未经修饰的植物源导管表面；B为MBP抗体染色未经修饰的植物源导管表面；C为S100抗体染色纤维蛋白修饰的植物源导管表面；D为MBP抗体染色纤维蛋白修饰的植物源导管表面。从图2中A和B可以看出：未经修饰的植物源导管表面，EMSCs生长状态不良，分别经S100及MBP抗体及对应二抗荧光染色后显示，阳性细胞分布稀疏，形态为短梭形或圆形。从图2中C和D可以看出：纤维蛋白修饰的植物源导管膜片上S100及MBP荧光阳性EMSCs生长状态良好，细胞基本布满于植物纤维导管膜片，细胞呈长梭型，其突起生长方向与植物纤维导管膜片表面条纹长轴平行(标尺为50μm)。
图3为植物源导管表面EMSCs增殖情况。从图3可以看出植物源导管对EMSCs增殖无明显影响。
图4为植物源导管表面鼻粘膜间充质干细胞蛋白表达情况；其中A为S100和MBP，B为免疫印迹数据分析图。从图4可以看出该植物源导管可促进EMSCs向雪旺细胞分化。
表1为体内移植后各时间点各组大鼠SFI比较(X±S)，从表1可以看出：术后1、3、5月，假手术组SFI显著高于其余各组(P<0.05)。术后1个月移植植物源导管负载EMSCs组、植物源导管组显著高于对照组(P<0.05)，移植植物源导管负载EMSCs组间和移植植物源导管组间差异无统计学意义(P>0.05)；3个月的SFI组间比较结果与1个月时一致(P<0.05)；5个月的SFI显示：假手术组>移植植物源导管负载EMSCs组>移植植物源导管组>对照组(P<0.05)；各组术后SFI均显示1月>3月>5月(P<0.05)。
表1为体内移植后各时间点各组大鼠SFI比较(X±S)
Figure BDA0002923060510000111
注：aP<0.05vs对照组，bP<0.05vs移植植物源导管组，cP<0.05vs移植植物源导管负载EMSCs组，dP<0.05vs假手术组；eP<0.05vs 1个月时，fP<0.05vs 3个月时，gP<0.05vs 5个月时。
图6为手术后坐骨神经及其桥接导管的大体形态特征和坐骨神经及桥接导管内再生神经纤维的免疫组织化学染色结果，其中坐骨神经及桥接导管向切片，免疫组织化学染色结果表明，各组坐骨神经组织及桥接导管内均可见棕色的NF-200阳性神经纤维，导管内的再生神经纤维与导管长轴成平行性生长；其中假手术组(图6中E)、移植植物源导管负载EMSCs组(图6中D)、移植植物源导管组(图6中B)的神经纤维密度均高于单纯损伤组(对照组)(图6中C)，移植植物源导管负载EMSCs组(图6中D)神经纤维密度高于移植单纯植物源导管组(图6中B)。从图6中A可以看出：手术后各组大鼠手术切口无明显感染，愈合良好。坐骨神经损伤组大鼠患侧脚掌有自残性损伤，但可自行愈合，导管移植组自行愈合较快。术后5个月重新暴露坐骨神经，肉眼观察发现移植的导管已经与损伤的坐骨神经形成很好的桥接。损伤近端神经已经生长进入导管，再生神经从导管远端生长进入腓肠肌。从图6中B-E可以看出：各组坐骨神经组织及桥接导管内均可见棕色的NF-200阳性神经纤维，导管内的再生神经纤维与导管长轴成平行性生长。
表2为腓肠肌湿重比率统计，从表2可以看出：术后5个月，大鼠腓肠肌湿重比率显示：假手术组>移植植物源导管负载EMSCs组>移植植物源导管组>对照组(P<0.05)。移植植物源导管负载EMSCs组能明显抑制腓肠肌的萎缩，表明移植植物源导管负载EMSCs组具有一定的促神经损伤修复作用。
表2腓肠肌湿重比率统计
Figure BDA0002923060510000121
图7为腓肠肌横截面HE染色：其中A为对照组的腓肠肌横截面；B为移植植物源导管组的腓肠肌横截面；C为移植植物源导管负载EMSCs组的腓肠肌横截面；D为假手术组的腓肠肌横截面；E为各组腓肠肌肌纤维横截面的面积统计图，a表示具有显著差异。从图7可以看出：相比于假手术组，对照组、移植植物源导管组、移植植物源导管负载EMSCs组的肌肉横截面积直径均有不同程度的缩小，但移植植物源导管组和移植植物源导管负载EMSCs组显著高于对照组(aP<0.01)，移植植物源导管负载EMSCs组大于移植植物源导管组(aP<0.01)，假手术组大于移植植物源导管负载EMSCs组(aP<0.01)。
图8为术后5个月，脊髓L4-L5节段背根神经节切片荧光显微镜观察结果；其中A为对照组的背根神经节，神经节萎缩，节内荧光金标记阳性细胞稀少；B为移植植物源导管组的背根神经节内荧光金标记阳性细胞分布不均匀，主要分布与边缘，数量略大于对照组；C为移植植物源导管负载EMSCs组的背根神经节内荧光金标记阳性细胞分布密集；D为假手术组的背根神经节内荧光金标记阳性细胞分布密集；E为各背根神经节内荧光金标记阳性细胞数量的统计图。从图8可以看出：各组损伤侧(右侧)背根神经节内均可见荧光标记阳性细胞。其中假手术组、移植植物源导管负载EMSCs组、移植单纯植物源导管组的荧光标记细胞数量均高于单纯损伤组(对照组)(aP<0.01)，移植植物源导管负载EMSCs组荧光标记细胞数量高于移植单纯导管组(aP<0.01)。
图9为再生神经组织内NF-200和MBP蛋白相对含量比较结果，其中A为不同组小鼠再生组织中MBP和NF-200蛋白的表达量，B为免疫印迹数据分析柱状图；从图9可以看出：假手术组>移植植物源导管负载EMSCs组>移植植物源导管组>对照组(aP<0.01)。NF-200的表达量：假手术组>移植植物源导管负载EMSCs组、移植植物源导管组>对照组(aP<0.01)，但移植植物源导管组与移植植物源导管负载EMSCs组无显著差异(P>0.05)。表明植物源导管以及植物源导管负载EMSCs对神经结构的恢复有促进作用。
实施例3
在植物源导管表面接种SHH-EMSCs实现神经损伤的修复，包括如下步骤：
(1)植物源导管的蛋白修饰：
将植物源导管用层黏连蛋白(Laminin)溶液(1μg/ml)浸泡1h，置于37℃真空烘箱内烘干，再用京尼平(Genipin)溶液(浓度为1％)浸泡1h，置于37℃真空烘箱内烘干。如此重复处理三遍，得到植物源导管，置4℃冰箱保存备用；
(2)构建转SHH基因的EMSCs；
①EMSCs的取材培养：同实施例2的步骤(2)
将SD大鼠颈椎脱位处死，用碘酒消毒鼻及周边区域，在无菌操作台内提取EMSCs。具体操作：用剪刀去除鼻头软骨及软组织，伸进两侧鼻腔剪开，将大鼠颌骨掀起，用镊子完整取出鼻中隔并分离全层鼻粘膜；用无血清DMEM/F12将鼻粘膜漂洗3次；剪碎，去上清，加入0.25％胰酶消化10min，PBS漂洗3次后离心去除胰酶，转移至细胞培养瓶，加入4ml 10％FBSDMEM/F12(含青霉素100U/ml和链霉素100U/ml)，于细胞培养箱中(37℃，5％CO2，饱和湿度)培养，每2d半量换液1次，弃去未贴壁的细胞，当细胞铺满瓶底85％时，消化传代。可得第一代EMSCs，2-3d后观察到细胞贴壁生长密集，再进行传代，获第二代EMSCs，待贴壁后得第三代扩增的细胞。大鼠EMSCs在使用前已传代3-5次。(培养基三天更换一次)。将传代获得的细胞接种于24孔板，待细胞铺满板底的80％时，4％多聚甲醛4℃固定8h，PBS漂洗三遍，用含0.1％Triton X-100的2％BSA封闭30min，弃封闭液，加入Nestin、Cx43、Vimentin、S100抗体，4℃孵育12小时，PBS漂洗三次，加入对应Cy3标记二抗(Cy3-IgG)，37℃孵育1h，DAP复染细胞核，封片后于荧光显微镜下观察并摄片；
②构建转SHH基因的EMSCs
将提取获得的第3代EMSCs接种于24孔培养板和6孔培养板内，其中一半孔加入浓度为1％的，以293A细胞扩增的SHH基因重组腺病毒液(孙勇,陈平波,史文涛,杨开元,毕士奇,张志坚,徐晓峰.重组SHH腺病毒纤维蛋白缓释支架对神经干细胞增殖与分化的影响[J].基础医学与临床,2019,39(08):1085-1090.)，培养3d后荧光显微镜观察转染情况，当转染率达85％时，传代扩增一代后，得到转SHH基因的EMSCs用于细胞移植；细胞移植前对EMSCs的SHH表达水平进行western blottin检测；
(3)将步骤(2)得到的转SHH基因的EMSCs接种至层黏连蛋白修饰的植物源导管
在无菌超净台中，将蛋白修饰的植物纤维导管沿长轴剪开并用砝码(50g)压平成膜片，放置在超净台中备用。将20μl的纤维蛋白原溶液(40mg/ml)和5μl凝血酶(40U/ml)均匀涂布于24孔培养板孔底用于黏附固定植物源导管膜片，立即将压平的植物源导管膜片粘贴在纤维蛋白胶上(导管内表面向上)并用砝码(50g)压平，以利于接种细胞。取出砝码，将SHH-EMSCs/培养基悬液滴加于植物源导管膜片表面(20ul/孔)，1h后细胞即可黏附于植物纤维导管表面。细胞黏附后在培养孔周边轻轻加入1ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。培养2周后用4％多聚甲醛固定，甘油封片；得到转SHH基因的EMSCs-蛋白修饰的植物源导管。
(4)植物源导管体内移植实验
①按手术方法将大鼠随机分成5组，每组5只。通过腹膜内注射用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠。大腿及右后肢臀部备皮并用碘伏消毒3遍，俯卧位固定大鼠于操作台后，无菌条件下于大鼠的右下肢股后切开一个纵切口,长1.5cm,分离股部各肌层,用无菌器械充分显露并切除5mm的坐骨神经节段；
②分组及植物源导管移植方法：
单纯损伤对照组(A组)：7-0可吸收线缝合神经断端,保持5mm间隙及适当张力，断端滴注由40mg/ml的纤维蛋白原溶液及40U的凝血酶混合而成的纤维蛋白凝胶；
植物源导管组(B组)、植物源导管负载EMSCs移植组(C组)、植物源导管负载SHH-EMSCs移植组(D组)：在A组的基础上将植物源导管桥接到这个5mm的神经缺损；桥接后分别于导管内缓慢注射1ml的单纯纤维蛋白凝胶、混合1×106个EMSCs或SHH-EMSCs的纤维蛋白凝胶并固定植物源导管位置；
假手术空白组(E组):仅暴露并游离坐骨神经不作处理，单纯注射纤维蛋白凝胶作为假手术组；
表3为左右腓肠肌称重对比统计；其中A为SFI；B为WWG。从中可以看出：大鼠腓肠肌湿重比例显示：假手术组>移植植物源导管负载SHH-EMSCs组>移植植物源导管负载EMSCs组>单纯移植植物源导管组>单纯损伤组(对照组)(P<0.05)(表2)。表明移植植物源导管和负载SHH-EMSCs能明显抑制腓肠肌的萎缩，移植植物源导管和负载EMSCs具有一定的促神经损伤修复作用。
表3坐骨神经功能指数(SFI)及腓肠肌湿重恢复率(VVG)X±S％
Figure BDA0002923060510000151
图10为动物术后5个月，脊髓L4-L5节段背根神经节切片荧光显微镜图。其中，A为对照组的背根神经节，神经节萎缩，节内荧光金标记阳性细胞稀少；B为移植植物源导管组的背根神经节内荧光金标记阳性细胞分布不均匀，主要分布与边缘，数量略大于对照组；C为移植植物源导管负载EMSCs组的背根神经节内荧光金标记阳性细胞分布密集；D为移植植物源导管负载SHH-EMSCs组的背根神经节内荧光金标记阳性细胞分布密集；E为假手术组的背根神经节内荧光金标记阳性细胞分布密集；F为各背根神经节内荧光金标记阳性细胞数量的统计图；从图10中可以看出：各组损伤侧(右侧)背根神经节内均可见荧光标记阳性细胞。其中假手术组、移植植物源导管负载SHH-EMSCs组、移植植物源导管负载EMSCs组、移植单纯植物源导管组的荧光标记细胞数量均高于单纯损伤组(对照组)，移植植物源导管负载SHH-EMSCs组细胞数量高于移植植物源导管负载EMSCs组。
图11为导管移植后坐骨神经再生情况的形态学观察结果。从图11中A-D可以看出：手术后各组大鼠手术切口无明显感染，愈合良好。坐骨神经损伤组大鼠患侧脚掌有自残性损伤，但可自行愈合，导管移植组自行愈合较快。术后5个月重新暴露坐骨神经，肉眼观察发现移植的导管已经与损伤的坐骨神经形成很好的桥接。损伤近端神经已经生长进入导管，再生神经从导管远端生长进入腓肠肌。导管表面有光滑的纤维组织性外鞘包裹，导管周围无明显的炎症反应性组织疤痕，导管与周围组织容易分离。单纯损伤组，损伤部位形成组织疤痕，神经与疤痕组织粘连，有部分再生神经生长进入腓肠肌。从图11中E-I可以看出：术后5个月，坐骨神经及桥接导管纵向切片，免疫组织化学染色结果表明，各组坐骨神经组织及桥接导管内均可见棕色的NF-200阳性神经纤维，导管内的再生神经纤维与导管长轴成平行性生长。其中假手术组、移植植物源导管负载SHH-EMSCs组、移植植物源导管负载EMSCs组、移植单纯植物源导管组的神经纤维密度均高于单纯损伤组(对照组)，移植植物源导管负载SHH-EMSCs组神经纤维密度高于移植植物源导管负载EMSCs组。从图11中J和K可以看出：假手术组、移植植物源导管负载SHH-EMSCs组、移植植物源导管负载EMSCs组、移植单纯植物源导管组的NF-200和MBP蛋白相对含量均高于单纯损伤组(对照组)，移植植物源导管负载SHH-EMSCs组的NF-200和MBP蛋白相对含量高于移植植物源导管负载EMSCs组。各蛋白表达量的差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明移植层黏连蛋白修饰植物源导管与EMSCs对神经纤维的生长均有促进作用，联合移植层黏连蛋白修饰植物源导管和SHH-EMSCs组对坐骨神经损伤的修复效果最好。
图12为腓肠肌横截面面积的测量结果，其中；其中A为对照组的腓肠肌横截面；B为移植植物源导管组的腓肠肌横截面；C为移植植物源导管负载EMSCs组的腓肠肌横截面；D移植植物源导管负载SHH-EMSCs组；E为假手术组的腓肠肌横截面；F为各组腓肠肌肌纤维横截面的面积统计图，a表示与对照组相比具有显著差异；b表示与移植植物源导管组相比具有显著差异；c表示与移植植物源导管负载EMSCs组相比具有显著差异；d表示与假手术组相比具有显著差异。从图12可以看出：组织切片后对大鼠的腓肠肌肌肉横截面的直径进行测量，结果显示相比于假手术组，其它各组的肌肉横截面积均有不同程度的缩小，但移植植物源导管组和移植植物源导管负载EMSCs组的腓肠肌横截面面积显著大于对照组(P<0.05)，移植植物源导管负载SHH-EMSCs组的肌横截面面积显著大于移植植物源导管负载EMSCs组大(P<0.05)
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备植物源导管的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)自节节草茎杆节间段导管，用水浸泡；
(2)将步骤(1)浸泡之后的导管在酸溶液中反应，反应结束之后取出，洗涤至中性后放入碱溶液中反应，反应结束后洗涤至中性；
(3)将步骤(2)得到的导管用胰酶与木瓜蛋白酶消化；
(4)将步骤(3)得到的导管剔除导管内外壁的肉质层，保留导管的完整纤维结构；
(5)将步骤(4)得到的导管脱水，即得到所述的植物源导管。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的酸溶液为硫酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的碱溶液为氢氧化钠溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的用胰酶与木瓜蛋白酶消化具体为：先用胰酶在37℃下处理30min，其中胰酶的用量是导管质量的0.5％；再用1％的木瓜蛋白酶在37℃下处理30min；其中木瓜蛋白酶的用量是导管质量的1％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的脱水是采用梯度乙醇脱水，梯度乙醇的浓度分别为15％、25％、35％、55％、85％、95％。
6.权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的植物源导管。
7.权利要求6所述的植物源导管在在修复神经损伤中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用是在植物源导管表面接种EMSCs或SHH-EMSCs实现神经损伤的修复。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用中植物源导管表面接种EMSCs包括如下步骤：
(1)植物源导管的纤维蛋白修饰：
用纤维蛋白原溶液浸泡权利要求6所述的植物源导管，取出导管，在导管表面边滴加凝血酶溶液，使纤维蛋白原溶液在导管表面凝固成胶状涂层；取出导管，干燥，得到纤维蛋白修饰的植物源导管；
(2)EMSCs的取材培养；
(3)将步骤(2)得到的EMSCs接种至纤维蛋白修饰的植物源导管。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用中植物源导管表面接种SHH-EMSCs包括如下步骤：
(1)植物源导管的层黏连蛋白修饰：
将权利要求6所述的植物源导管在层黏连蛋白(Laminin)溶液中浸泡，取出导管，干燥；之后再用京尼平溶液浸泡，干燥；得到层黏连蛋白修饰植物源导管；
(2)构建转SHH基因的EMSCs；
(3)将步骤(2)得到的转SHH基因的EMSCs接种至层黏连蛋白修饰的植物源导管。
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