CN106714570A - 直接饲喂微生物和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合的直接饲喂微生物。更具体而言，本发明涉及用于包括上述用途的分离芽孢杆菌菌株86和300以及具有这些菌株的所有鉴定特征的菌株。

Description

直接饲喂微生物和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年5月13日提交的美国临时申请序列号61/992607和于2014年11月12日提交的美国临时申请序列号62/078665的优先权，其中上述所有美国临时申请以全文引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及用于改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合的直接饲喂微生物。更具体而言，本发明涉及用于包括上述用途的分离芽孢杆菌(Bacillus)菌株86和300以及具有这些菌株的所有鉴定特征的菌株。
发明背景和内容
本发明涉及直接饲喂微生物(DFM)组合物和用于改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合的方法。这些改善增强动物群体的商业价值。
动物的胃肠道不断地受存在于饲料、垫料和环境中的大量细菌、病毒和原生动物攻击。胃肠道具有由物理、化学和免疫防御线组成的复杂系统来反击这些潜在病原体。有益细菌是该系统的重要部分。病原体、压力、代谢紊乱、使用抗微生物剂和其他原因可扰乱肠细菌的平衡，这可损害消化并且使动物对疾病更易感。因此，向动物提供协助建立(或重建)正常细菌谱的细菌可帮助维持最佳动物性能。
直接饲喂微生物产品是含有活(live)(活(viable))微生物(例如，细菌)的产品。随着时间推移，先前认为可用于或直接经由饲料转化率改善或间接经由环境改善来改善动物性能的许多直接饲喂微生物产品已失去总体功效。功效的变化可与在动物饲粮中干酒糟可溶物(DDGS)或类似饲料组分的使用增加相关联。在动物饲粮中使用DDGS还影响粪废坑系统。DDGS连同高氮、高脂质和高纤维的任何饲料组分对动物而言难以消化并且通常释放入粪坑，从而影响粪处理、存储和分解。饲喂动物高水平的DDGS或其他含高纤维和/或脂质的饲粮导致粪坑中固体积累增加，以及氨、甲烷、磷化氢和硫化氢气体增加。当前，市售可得的产品似乎不帮助控制与DDGS或其他含高纤维和/或脂质的饲粮(例如，玉米-大豆饲粮，以及类似物)相关联的负面环境效应。因此，需要在动物中和在粪废坑系统中均起作用的直接饲喂微生物菌株。还需要将改善动物性能的微生物菌株，所述动物性能包括已在饲喂DDGS的动物中减少的平均日采食量、平均日增重和饲料转化率。
申请人已开发了直接饲喂微生物组合物，所述组合物导致：平均日增重增加、平均日采食量增加和动物中的饲料转化率改善，因饲粮(例如，DDGS)中难以消化的饲料组分分解所致的代谢能改善，因氨挥发所致的负面环境对动物的影响减小，涉及动物病原体(例如，大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)和梭菌(Clostridia))的疾病减少，因NH3氨挥发减少所致的粪氮值提高，疾病传播和有害的粪坑发泡减少，和因含长链脂肪酸的泡沫减少所致的谷仓中爆炸性气体(例如，甲烷、氢气、磷化氢)减少。本文所述的直接饲喂微生物组合物通过在单一直接饲喂微生物组合物中提供所有这些性质或它们的组合来供给商业效益。另外，本文所述的直接饲喂微生物组合物导致抗生素的使用减少和饲料效率提高，这降低了动物饲料的总成本。
提供用于改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境和它们的组合的方法和组合物。在各种实施方案中，动物可选自家禽物种、猪物种、牛物种、羊物种、马物种和伴生动物。在其中所述动物是家禽物种的实施方案中，所述家禽物种可为肉鸡。在其中所述动物是猪物种的实施方案中，所述猪物种可选自生长育成猪、保育猪、母猪和存栏猪。
在各种实施方案中，用于本文所述方法中的组合物可为商业包装、用于动物饲料组合物的饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂，或动物饲料组合物(例如，全价饲料)，上述各者包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
在本文所述方法的一个实施方案中，提供饲喂动物的方法。所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合。
在本文所述方法的另一个实施方案中，提供控制粪的有害环境效应的方法。所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
在本文所述方法的又一个说明性实施方案中，提供控制粪的有害环境效应的方法。所述方法包括以下步骤：向粪、窝、坑、或粪池施加组合物，所述组合物包含有效量的选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
以下条项和其组合提供本文所述发明的各种额外的说明性方面。本专利申请的任何其他章节(包括标题为“说明性实施方案的详述”和实施例的章节)中所描述的各种实施方案可应用于下方编号条项中所述本发明的以下实施方案中的任一个。
1.一种饲喂动物的方法，所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合。
2.如条项1所述的方法，其中所述动物选自家禽物种、猪物种、牛物种、羊物种、马物种和伴生动物。
3.如条项2所述的方法，其中所述家禽物种是肉鸡。
4.如条项3所述的方法，其中所述效应是改善动物性能。
5.如条项4所述的方法，其中所述动物性能的改善选自：降低饲料转化率，增加平均日采食量，增加平均日增重，改善性能一致性以及它们的组合。
6.如条项4所述的方法，其中所述动物性能的改善是增加的胸肉重量。
7.如条项4所述的方法，其中所述动物性能的改善是增加的占活重百分比的胸肉产率。
8.如条项2所述的方法，其中所述猪物种选自生长育成猪、保育猪、母猪和存栏猪。
9.如条项1至8中任一项所述的方法，其中所述效应是改善动物性能。
10.如条项9所述的方法，其中所述动物性能的改善选自：降低饲料转化率，增加平均日采食量，增加平均日增重，改善性能一致性以及它们的组合。
11.如条项9所述的方法，其中所述动物性能的改善选自：改善饲粮的可消化率，改善代谢能与总能量的比率以及它们的组合。
12.如条项1至11中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株产生选自以下的酶：α-半乳糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶以及它们的组合。
13.如条项1所述的方法，其中所述效应是改善动物健康。
14.如条项1至13中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株中的至少一种具有抗微生物活性。
15.如条项14所述的方法，其中所述抗微生物活性是对抗选自大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、梭菌、弯曲杆菌(Campylobacter)以及它们的组合的细菌。
16.如条项1所述的方法，其中所述效应是改善环境。
17.如条项16所述的方法，其中所述对环境的改善选自：降低粪的pH，降低粪的长链脂肪酸含量，减少粪中的氨，减少粪坑发泡，减少粪中的爆炸性气体，减少氨挥发以及它们的组合。
18.如条项17所述的方法，其中所述粪中氨的减少引起选自以下的降低：动物中氨毒性降低和对动物环境中的天然菌群的氨毒性降低。
19.如条项17所述的方法，其中所述粪中氨的减少使谷仓中的氨闪蒸减少。
20.如条项17所述的方法，其中所述粪中长链脂肪酸含量的降低引起粪中爆炸性气体减少，其中所述气体选自甲烷气体、氢气、磷化氢气体和它们的组合。
21.如条项17所述的方法，其中所述粪中氨的减少提高粪中的氮值，其中将所述粪用作肥料。
22.如条项1至21中任一项所述的方法，进一步包括向动物施用选自另一芽孢杆菌菌株、乳酸菌菌株和它们的组合的另一细菌菌株的步骤。
23.如条项1至22中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株。
24.如条项1至22中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株。
25.如条项1至22中任一项所述的方法，其中芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，和芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株在单一组合物中组合施用。
26.如条项1至22中任一项所述的方法，其中芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，和芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株在分开的组合物中组合施用。
27.如条项1至26中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约5.0×1012CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
28.如条项1至27中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约1.0×107CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
29.如条项1至28中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以大于约7.0×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
30.如条项1至29中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约7.3×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
31.如条项1至30中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株分离自高性能生长育成猪。
32.如条项1至31中任一项所述的方法，进一步包括将抗生素施用于动物的步骤，其中所述抗生素选自DenagardTM、BMDTM、CarbadoxTM和StafacTM。
33.如条项1至32中任一项所述的方法，进一步包括避免向动物施用选自以下的抗生素的步骤：红霉素、左氧氟沙星、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、达托霉素、利福平、TylanTM、PulmotilTM和万古霉素。
34.如条项1至33中任一项所述的方法，进一步包括向动物施用选自以下的酶的步骤：半乳糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、半纤维素酶、阿拉伯木聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、NSP酶、植酸酶以及它们的组合。
35.如条项1至34中任一项所述的方法，其中所述动物中的微生物平衡受维持。
36.如条项2所述的方法，其中所述动物是伴生动物。
37.如条项36所述的方法，其中所述动物是犬物种或猫物种。
38.如条项2所述的方法，其中所述动物是母猪，并且所述芽孢杆菌菌株在泌乳期间施用。
39.如条项2所述的方法，其中所述动物是母猪，并且所述芽孢杆菌菌株在妊娠期间施用。
40.如条项1至39中任一项所述的方法，其中将所述饲料组合物每日施用于动物。
41.如条项1所述的方法，其中所述动物选自：鸡、猪、马、矮种马、母牛、火鸡、山羊、绵羊、鹌鹑、野鸡、鸵鸟、鸭、鱼、甲壳类以及它们的组合。
42.一种控制粪的有害环境效应的方法，所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
43.如条项42所述的方法，其中所述动物选自家禽物种、猪物种、牛物种、羊物种和马物种。
44.如条项42所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：降低粪的pH，降低粪的长链脂肪酸含量，减少粪中的氨，减少粪坑发泡，减少粪中的爆炸性气体，减少氨挥发以及它们的组合。
45.如条项44所述的方法，其中所述粪中氨的减少使谷仓中的氨闪蒸减少。
46.如条项44所述的方法，其中所述粪中长链脂肪酸含量的降低导致粪中爆炸性气体减少，其中所述气体选自甲烷气体、氢气、磷化氢气体以及它们的组合。
47.如条项44所述的方法，其中所述粪中氨的减少提高粪中的氮值，其中将所述粪用作肥料。
48.如条项42至47中任一项所述的方法，进一步包括向动物施用选自另一芽孢杆菌菌株、乳酸菌菌株和它们的组合的另一细菌菌株的步骤。
49.如条项42至48中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株。
50.如条项42至48中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株。
51.如条项42至50中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约5.0×1012CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
52.如条项42至51中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约1.0×107CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
53.如条项42至52中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以大于约7.0×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
54.如条项42至53中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约7.3×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
55.一种控制粪的有害环境效应的方法，所述方法包括以下步骤：向粪、窝、坑或粪池施加组合物，所述组合物包含有效量的选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
56.如条项55所述的方法，其中所述方法通过选自以下的效应来改善动物健康：减少动物的呼吸问题，改善动物的肠健康，改善动物性能一致性，减少动物中与环境毒性相关的疾病，以及减少动物中的病原体。
57.如条项55所述的方法，其中所述动物是家禽物种，并且所述方法通过选自以下的效应来改善所述动物的健康：减少家禽物种的呼吸问题，减少家禽物种的胸囊肿(breastblisters)，改善家禽物种性能的一致性，以及减少对家禽物种脚的损害。
58.如条项55所述的方法，其中所述粪在厌氧消化池中。
59.如条项55所述的方法，其中所述粪在厌氧污水塘中。
60.如条项55至59中任一项所述的方法，其中所述施加步骤包括喷雾或添加粉末或可泵送液体。
61.如条项55至60中任一项所述的方法，其中所述坑是猪坑。
62.如条项32所述的方法，其中所述抗生素是DenagardTM，并且DenagardTM与氯四环素组合施用。
63.如条项11所述的方法，其中所述饲粮包括选自干酒糟可溶物、玉米、大豆和它们的组合的组分。
64.一种商业包装，其包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
65.一种用于动物饲料的饲料添加剂，所述饲料添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
66.一种用于动物饮用水的添加剂，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
67.一种动物饲料组合物，其包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
68.如条项64至67中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能，改善动物健康，改善动物环境以及它们的组合。
69.如条项64至68中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂，其中所述芽孢杆菌菌株抑制选自大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、弯曲杆菌和梭菌的病原体。
70.如条项65或66所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈浓缩物的形式。
71.如条项65或66所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈超浓缩物的形式。
72.如条项65至67中任一项所述的饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈干燥形式。
73.如条项67所述的饲料组合物，其呈丸粒状形式。
74.如条项64所述的商业包装，其包含呈用于处理坑、粪池或用于处理窝的形式的所述芽孢杆菌菌株。
75.如条项74所述的商业包装，其中所述菌株呈选自粉末、液体和丸粒形式的形式。
76.如条项64至73中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者进一步包含用于所述芽孢杆菌菌株的载体。
77.如条项76所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述载体选自糠、稻壳、盐、糊精和它们的组合。
78.如条项64至77中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者在袋中。
79.如条项78所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述袋是塑料袋。
80.如条项64至79中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者进一步包含使用所述芽孢杆菌菌株中一种或多种的说明。
81.如条项78至80中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、或用于动物饮用水的添加剂，上述者在20磅袋中。
82.如条项78至80中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、或用于动物饮用水的添加剂，上述者在50磅袋中。
83.如条项65、66、68、69至72，或76至82中任一项所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈粉末形式。
84.如条项65、66、68至71，或78至80中任一项所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈液体形式。
85.如条项64至84中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者在用于商业用途的容器中。
86.如条项85所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述容器包含塑料。
87.如条项85所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述容器包含纸。
88.如条项55所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株被施加于窝并且减少窝中的氨。
89.如条项1所述的方法，其中所述动物是鸡，并且所述鸡健康的改善导致：鸡产下的蛋的数量增加，鸡出生的小鸡的数量增加，或鸡出生的活小鸡的数量增加。
90.如条项64至87中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者进一步包含粘合剂。
91.如条项90所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述粘合剂选自：粘土、酵母细胞壁组分、硅酸铝，和葡聚糖，或它们的组合。
附图简述
图1显示出饲喂包括芽孢杆菌菌株86和300的各种DFM菌株组合的肥育猪(finishing pigs)的生长性能。Bs 86+552表示Bs菌株86和552的50:50(1:1)混合物；Bs300+552表示Bs菌株300和552的50:50(1:1)混合物；Bs 86+300+552表示Bs菌株86、300和552的33.3:33.3:33.3(1:1:1)混合物。在13-F072中，处理3(Bs 86+300)是80％菌株86和20％菌株300。
图2显示出针对三(3)个实验的包括芽孢杆菌菌株86的DFM菌株的荟萃分析。三菌株表示Bs菌株86、300和552的33.3:33.3:33.3(1:1:1)混合物。
图3显示出对菌株86和300针对淀粉酶、CMC酶、蛋白酶、木聚糖酶和脂肪酶活性的酶筛选(菌株86是每组两条柱中的第一条柱并且菌株300是第二条柱)。
图4A和4B显示出芽孢杆菌菌株86和300对抗各种细菌菌株的抗微生物活性。
图5显示出芽孢杆菌菌株86和300的抗生素易感性。
图6显示出芽孢杆菌菌株86和300对抗生素的易感性和耐受性。
图7显示出芽孢杆菌菌株86和300利用干酒糟可溶物的能力。
图8和图9显示出芽孢杆菌菌株86和300降低粪中pH和减少粪中游离氨的能力。
图10和图11显示出芽孢杆菌菌株86和300消化长链脂肪酸的能力(在图表顶部的四个图例从左至右对应于每组四条柱中从左至右的柱)。
图12显示出展示芽孢杆菌菌株86和300的RAPD PCR图谱(引物1至6)的凝胶的照片。菌株86具有顶部图谱，并且菌株300具有底部图谱。最左和最右泳道具有标记，并且标记之间的每组两个连续泳道从左至右对应于引物1至6。
图13显示出DFM菌株86、101、290和300中的甘露聚糖酶酶活性。
图14显示出由DFM菌株86、101、290和300的作为唯一碳源的亚油酸利用，以及由那些DFM菌株的各种组合的亚油酸利用。具有最高亚油酸利用的菌株组合是(顶部曲线至底部)86/101/300、86/101/290、101/290、86/290、101/300、300和86/300。所有其他组合具有类似的利用。
图15和图16分别显示出DFM菌株86和300的基因组注释。
说明性实施方案的详述
提供用于改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境和它们的组合的方法和组合物。在各种实施方案中，用于本文所述方法中的组合物可为商业包装、用于动物饲料组合物的饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂，或动物饲料组合物(例如，全价饲料)，上述各者包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
在本文所述方法的一个实施方案中，提供饲喂动物的方法。所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合。
在本文所述方法的另一个实施方案中，提供控制粪的有害环境效应的方法。所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
在本文所述方法的又一个说明性实施方案中，提供控制粪的有害环境效应的方法。所述方法包括以下步骤：向粪、窝、坑、或粪池施加组合物，所述组合物包含有效量的选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
以下条项和其组合提供本文所述发明的各种额外的说明性方面。标题为“说明性实施方案的详述”的这一章节中所描述的各种实施方案可应用于下方编号条项中所述本发明的以下实施方案中的任一个。
1.一种饲喂动物的方法，所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合。
2.如条项1所述的方法，其中所述动物选自家禽物种、猪物种、牛物种、羊物种、马物种和伴生动物。
3.如条项2所述的方法，其中所述家禽物种是肉鸡。
4.如条项3所述的方法，其中所述效应是改善动物性能。
5.如条项4所述的方法，其中所述动物性能的改善选自：降低饲料转化率，增加平均日采食量，增加平均日增重，改善性能一致性以及它们的组合。
6.如条项4所述的方法，其中所述动物性能的改善是增加的胸肉重量。
7.如条项4所述的方法，其中所述动物性能的改善是增加的占活重百分比的胸肉产率。
8.如条项2所述的方法，其中所述猪物种选自生长育成猪、保育猪、母猪和存栏猪。
9.如条项1至8中任一项所述的方法，其中所述效应是改善动物性能。
10.如条项9所述的方法，其中所述动物性能的改善选自：降低饲料转化率，增加平均日采食量，增加平均日增重，改善性能一致性以及它们的组合。
11.如条项9所述的方法，其中所述动物性能的改善选自：改善饲粮的可消化率，改善代谢能与总能量的比率以及它们的组合。
12.如条项1至11中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株产生选自以下的酶：α-半乳糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶以及它们的组合。
13.如条项1所述的方法，其中所述效应是改善动物健康。
14.如条项1至13中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株中的至少一种具有抗微生物活性。
15.如条项14所述的方法，其中所述抗微生物活性是对抗选自大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、梭菌、弯曲杆菌(Campylobacter)以及它们的组合的细菌。
16.如条项1所述的方法，其中所述效应是改善环境。
17.如条项16所述的方法，其中所述对环境的改善选自：降低粪的pH，降低粪的长链脂肪酸含量，减少粪中的氨，减少粪坑发泡，减少粪中的爆炸性气体，减少氨挥发以及它们的组合。
18.如条项17所述的方法，其中所述粪中氨的减少引起选自以下的降低：动物中氨毒性降低和对动物环境中的天然菌群的氨毒性降低。
19.如条项17所述的方法，其中所述粪中氨的减少使谷仓中的氨闪蒸减少。
20.如条项17所述的方法，其中所述粪中长链脂肪酸含量的降低引起粪中爆炸性气体减少，其中所述气体选自甲烷气体、氢气、磷化氢气体和它们的组合。
21.如条项17所述的方法，其中所述粪中氨的减少提高粪中的氮值，其中将所述粪用作肥料。
22.如条项1至21中任一项所述的方法，进一步包括向动物施用选自另一芽孢杆菌菌株、乳酸菌菌株和它们的组合的另一细菌菌株的步骤。
23.如条项1至22中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株。
24.如条项1至22中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株。
25.如条项1至22中任一项所述的方法，其中芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，和芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株在单一组合物中组合施用。
26.如条项1至22中任一项所述的方法，其中芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，和芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株在分开的组合物中组合施用。
27.如条项1至26中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约5.0×1012CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
28.如条项1至27中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约1.0×107CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
29.如条项1至28中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以大于约7.0×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
30.如条项1至29中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约7.3×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
31.如条项1至30中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株分离自高性能生长育成猪。
32.如条项1至31中任一项所述的方法，进一步包括将抗生素施用于动物的步骤，其中所述抗生素选自DenagardTM、BMDTM、CarbadoxTM和StafacTM。
33.如条项1至32中任一项所述的方法，进一步包括避免向动物施用选自以下的抗生素的步骤：红霉素、左氧氟沙星、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、达托霉素、利福平、TylanTM、PulmotilTM和万古霉素。
34.如条项1至33中任一项所述的方法，进一步包括向动物施用选自以下的酶的步骤：半乳糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、半纤维素酶、阿拉伯木聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、NSP酶、植酸酶以及它们的组合。
35.如条项1至34中任一项所述的方法，其中所述动物中的微生物平衡受维持。
36.如条项2所述的方法，其中所述动物是伴生动物。
37.如条项36所述的方法，其中所述动物是犬物种或猫物种。
38.如条项2所述的方法，其中所述动物是母猪，并且所述芽孢杆菌菌株在泌乳期间施用。
39.如条项2所述的方法，其中所述动物是母猪，并且所述芽孢杆菌菌株在妊娠期间施用。
40.如条项1至39中任一项所述的方法，其中将所述饲料组合物每日施用于动物。
41.如条项1所述的方法，其中所述动物选自：鸡、猪、马、矮种马、母牛、火鸡、山羊、绵羊、鹌鹑、野鸡、鸵鸟、鸭、鱼、甲壳类以及它们的组合。
42.一种控制粪的有害环境效应的方法，所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
43.如条项42所述的方法，其中所述动物选自家禽物种、猪物种、牛物种、羊物种和马物种。
44.如条项42所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：降低粪的pH，降低粪的长链脂肪酸含量，减少粪中的氨，减少粪坑发泡，减少粪中的爆炸性气体，减少氨挥发以及它们的组合。
45.如条项44所述的方法，其中所述粪中氨的减少使谷仓中的氨闪蒸减少。
46.如条项44所述的方法，其中所述粪中长链脂肪酸含量的降低导致粪中爆炸性气体减少，其中所述气体选自甲烷气体、氢气、磷化氢气体以及它们的组合。
47.如条项44所述的方法，其中所述粪中氨的减少提高粪中的氮值，其中将所述粪用作肥料。
48.如条项42至47中任一项所述的方法，进一步包括向动物施用选自另一芽孢杆菌菌株、乳酸菌菌株和它们的组合的另一细菌菌株的步骤。
49.如条项42至48中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，或具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株。
50.如条项42至48中任一项所述的方法，其中施用的菌株是芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，或具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株。
51.如条项42至50中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约5.0×1012CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
52.如条项42至51中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约1.0×107CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
53.如条项42至52中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以大于约7.0×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
54.如条项42至53中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株以约7.3×104CFU/克饲料组合物的剂量在所述饲料组合物中施用。
55.一种控制粪的有害环境效应的方法，所述方法包括以下步骤：向粪、窝、坑或粪池施加组合物，所述组合物包含有效量的选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
56.如条项55所述的方法，其中所述方法通过选自以下的效应来改善动物健康：减少动物的呼吸问题，改善动物的肠健康，改善动物性能一致性，减少动物中与环境毒性相关的疾病，以及减少动物中的病原体。
57.如条项55所述的方法，其中所述动物是家禽物种，并且所述方法通过选自以下的效应来改善所述动物的健康：减少家禽物种的呼吸问题，减少家禽物种的胸囊肿(breastblisters)，改善家禽物种性能的一致性，以及减少对家禽物种脚的损害。
58.如条项55所述的方法，其中所述粪在厌氧消化池中。
59.如条项55所述的方法，其中所述粪在厌氧污水塘中。
60.如条项55至59中任一项所述的方法，其中所述施加步骤包括喷雾或添加粉末或可泵送液体。
61.如条项55至60中任一项所述的方法，其中所述坑是猪坑。
62.如条项32所述的方法，其中所述抗生素是DenagardTM，并且DenagardTM与氯四环素组合施用。
63.如条项11所述的方法，其中所述饲粮包括选自干酒糟可溶物、玉米、大豆和它们的组合的组分。
64.一种商业包装，其包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
65.一种用于动物饲料的饲料添加剂，所述饲料添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
66.一种用于动物饮用水的添加剂，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
67.一种动物饲料组合物，其包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
68.如条项64至67中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能，改善动物健康，改善动物环境以及它们的组合。
69.如条项64至68中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂，其中所述芽孢杆菌菌株抑制选自大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、弯曲杆菌和梭菌的病原体。
70.如条项65或66所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈浓缩物的形式。
71.如条项65或66所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈超浓缩物的形式。
72.如条项65至67中任一项所述的饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈干燥形式。
73.如条项67所述的饲料组合物，其呈丸粒状形式。
74.如条项64所述的商业包装，其包含呈用于处理坑、粪池或用于处理窝的形式的所述芽孢杆菌菌株。
75.如条项74所述的商业包装，其中所述菌株呈选自粉末、液体和丸粒形式的形式。
76.如条项64至73中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者进一步包含用于所述芽孢杆菌菌株的载体。
77.如条项76所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述载体选自糠、稻壳、盐、糊精和它们的组合。
78.如条项64至77中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者在袋中。
79.如条项78所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述袋是塑料袋。
80.如条项64至79中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者进一步包含使用所述芽孢杆菌菌株中一种或多种的说明。
81.如条项78至80中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、或用于动物饮用水的添加剂，上述者在20磅袋中。
82.如条项78至80中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、或用于动物饮用水的添加剂，上述者在50磅袋中。
83.如条项65、66、68、69至72，或76至82中任一项所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈粉末形式。
84.如条项65、66、68至71，或78至80中任一项所述的饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂，上述者呈液体形式。
85.如条项64至84中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者在用于商业用途的容器中。
86.如条项85所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述容器包含塑料。
87.如条项85所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述容器包含纸。
88.如条项55所述的方法，其中所述芽孢杆菌菌株被施加于窝并且减少窝中的氨。
89.如条项1所述的方法，其中所述动物是鸡，并且所述鸡健康的改善导致：鸡产下的蛋的数量增加，鸡出生的小鸡的数量增加，或鸡出生的活小鸡的数量增加。
90.如条项64至87中任一项所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，上述者进一步包含粘合剂。
91.如条项90所述的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物，其中所述粘合剂选自：粘土、酵母细胞壁组分、硅酸铝，和葡聚糖，或它们的组合。
在各种实施方案中，被施用如本文所述的饲料添加剂、饲料组合物或饮用水的动物可选自：家禽物种、猪物种、牛物种、羊物种、马物种和伴生动物。在其中所述动物是伴生动物的实施方案中，所述伴生动物可为例如犬物种或猫物种。在其中所述动物是猪物种的实施方案中，所述猪物种可选自生长育成猪、保育猪、母猪和存栏猪。在各种示例性实施方案中，所述动物可选自：鸡(例如肉鸡或下蛋鸡)、猪、马、矮种马、母牛、火鸡、山羊、绵羊、鹌鹑、野鸡、鸵鸟、鸭、鱼(例如罗非鱼、鲶鱼、比目鱼或鲑鱼)、甲壳类(例如虾或蟹)，以及它们的组合。
在本发明的一个实施方案中，可施用有效量的芽孢杆菌菌株来改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境，或它们的组合。“有效量”意指能够通过任何机制(包括本文所述的那些)来改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境或它们的组合的芽孢杆菌菌株(例如菌株86或300)的量。
在本文所述的实施方案中，其中将包含芽孢杆菌菌株86和/或300的本发明组合物施用于动物，所述组合物优选在饲料组合物中或饮用水中经口施用于动物，但本领域技术人员已知的任何其他有效施用方法均可利用。在一个说明性实施方案中，芽孢杆菌菌株86和/或300以用于添加至动物饮用水的添加剂的形式来提供。
在另一个说明性实施方案中，芽孢杆菌菌株86和/或300以用于添加至饲料组合物的饲料添加剂的形式来提供。所述饲料组合物可含有在与动物饲料掺合物的混合物中的芽孢杆菌菌株86和/或300，所述动物饲料掺合物包括任何本领域公认的动物饲料掺合物或本文所述的任何动物饲料掺合物。如本文所使用，“饲料组合物”或“动物饲料组合物”意指包含以下的饲料组合物：在与动物饲料掺合物的混合物中的芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300，以及，任选地，可用于饲料组合物中的任何其他组分，包括其他细菌菌株，诸如其他芽孢杆菌菌株或乳杆菌菌株。
任何动物饲料掺合物，包括本领域已知的那些和本文所述的那些，诸如菜籽粉、棉籽粉、大豆粉、玉米粉、大麦、小麦、青贮饲料和半干草料，可根据本专利申请中所描述的方法和组合物来使用。在各种实施方案中，所述动物饲料掺合物可用芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300来补充，但可将其他成分(包括其他细菌菌株，诸如其他芽孢杆菌菌株或乳杆菌菌株)任选地添加至所述动物饲料掺合物。
在各个说明性实施方案中，所述动物饲料掺合物的任选成分包括糖和复合碳水化合物，诸如可溶于水和不可溶于水的单糖、二糖和多糖。其他任选成分包括干酒糟可溶物、脂肪(例如粗脂肪)、磷、碳酸氢钠、石灰石、盐、植酸盐、钙、钠、硫、镁、钾、铜、铁、锰、锌、灰分、鱼油、来源于鱼粉的油、生籽(例如亚麻籽)、抗氧化剂和淀粉。在另一个实施方案中，矿物质可以矿物质预混合料的形式来添加。
可添加至动物饲料掺合物的任选氨基酸成分是精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸乙酯盐酸盐、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸乙酯盐酸盐，和类似物，以及它们的盐。可任选添加的维生素是盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺、肌醇、氯化胆碱、泛酸钙、生物素、叶酸、抗坏血酸和维生素A、B、K、D、E等。在另一个实施方案中，维生素可以维生素预混合料的形式来添加。在又一个实施方案中，蛋白质成分可被添加至动物饲料掺合物，并且包括从肉粉、骨粉或鱼粉、液体或粉末状蛋、鱼汁、粗蛋白等获得的蛋白质。
在另一个说明性方面中，可将本领域已知的任何药剂成分诸如抗生素添加至动物饲料掺合物或添加至用于动物饮用水的添加剂。在各种实施方案中，所述抗生素选自氨苄青霉素、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、四环素、氯四环素、DenagardTM、BMDTM、CarbadoxTM、StafacTM以及它们的组合。在本文所述方法的一个实施方案中，其中将饲料组合物或饮用水施用于动物，所述方法可进一步包括避免向动物施用选自以下的抗生素的步骤：红霉素、左氧氟沙星、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、达托霉素、利福平、TylanTM、PulmotilTM、万古霉素，以及它们的组合。在另一个实施方案中，所述动物饲料掺合物、所述饲料组合物、所述饲料添加剂或所述用于动物饮用水的添加剂可不含有抗生素。
在另一个说明性实施方案中，可将一种或多种酶添加至动物饲料掺合物。在各种实施方案中，可添加的酶包括半乳糖苷酶、植酸酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、半纤维素酶、阿拉伯木聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、NSP酶，它们的组合，以及改善饲料组合物对改善动物性能或健康的有效性，或者对改善动物环境有效的任何其他酶。在又一个实施方案中，可将酵母、真菌(例如曲霉(Aspergillus)或木霉(Trichoderma))或微量营养物添加至动物饲料。适合于添加至用于动物饮用水的添加剂的上述成分中的任一种可作为如本文所述用于动物饮用水的添加剂的组分来添加。
在各种说明性实施方案中，芽孢杆菌菌株(例如，芽孢杆菌菌株86和/或300)，或除芽孢杆菌菌株86和/或300以外添加的任何其他细菌菌株可以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约5.0×1012CFU/克饲料组合物的剂量，或以约1.0×103CFU/克饲料组合物至约1.0×107CFU/克饲料组合物的剂量来在饲料组合物中施用。在其他实施方案中，芽孢杆菌菌株(例如，芽孢杆菌菌株86和/或300)按以下剂量来在饲料组合物中施用：大于约1.0×103CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.1×103CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.25×103CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.5×103CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.75×103CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约2.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约3.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约4.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约5.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约6.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约7.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约8.0×104CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×105CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×106CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×107CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×108CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×109CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×1010CFU/克饲料组合物的剂量，大于约1.0×1011CFU/克饲料组合物的剂量，或大于约1.0×1012CFU/克饲料组合物的剂量。在又一个实施方案中，芽孢杆菌菌株(例如，芽孢杆菌菌株86和/或300)以约7.3×104CFU/克饲料组合物的剂量来在饲料组合物中施用。
在各种实施方案中，根据本文所述的方法和组合物所使用的芽孢杆菌菌株(例如，芽孢杆菌菌株86和/或300)可选自：芽孢杆菌菌株86，具有芽孢杆菌菌株86的所有鉴定特征的菌株，芽孢杆菌菌株300，和具有芽孢杆菌菌株300的所有鉴定特征的菌株。芽孢杆菌菌株MDG86和芽孢杆菌菌株MDG300于2014年3月14日保藏于61604-3999，伊利诺斯州，皮奥里亚市，北大学街1815，USDA，农业研究所，国家农业应用研究中心，农业研究所培养物保藏中心(NRRL)，并且分别给予登录号B-50944和B-50943。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行了保藏。NRRL菌株名称是MDG86和MDG300，如本申请中提及的，分别等同于芽孢杆菌菌株86和300。
这些菌株中的任一种可以饲料组合物(例如，包含动物饲料掺合物的全价饲料)或动物饮用水的形式单独或组合施用。在一个实施方案中，在单一组合物中组合施用多种菌株。在另一个实施方案中，在分开的组合物中组合施用多种菌株。在一个说明性实施方案中，这些菌株中的任一种分离自高性能生长育成猪。
在另一个实施方案中，可将先前段落中所述的芽孢杆菌菌株中的一种或多种(例如，芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300)与选自另一芽孢杆菌菌株、乳酸菌菌株以及它们的组合的另一细菌菌株一起施用于动物。在又一个实施方案中，可将先前段落中所述的芽孢杆菌菌株中的一种或多种(例如，芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300)与有效改善动物性能或健康、或者有效改善动物环境的任何其他细菌菌株一起施用于动物。
如本文所使用，“具有芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的所有鉴定特征的菌株”可为具有芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的所有鉴定特征(例如，对应于芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的DNA指纹的基于DNA分析的DNA指纹，对应于芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的酶活性，对应于芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的抗微生物活性，对应于芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的抗生素敏感性和耐受性曲线，或它们的组合)的突变菌株。在替代实施方案中，所述突变可为天然突变或经基因工程改造的突变。在另一个实施方案中，“具有芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的所有鉴定特征的菌株”可为例如，通过从芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300分离一种或多种质粒并且将所述一种或多种质粒引入诸如另一芽孢杆菌菌株的另一细菌中来产生的菌株，只要所述一种或多种质粒含有提供芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的鉴定特征(例如，对应于芽孢杆菌菌株86或芽孢杆菌菌株300的DNA指纹的基于DNA分析的DNA指纹)的DNA。
可将包含芽孢杆菌菌株86和/或300的饲料组合物或饮用水施用于动物持续有效改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境、或它们的组合的任何时间段。例如，在一个实施方案中，可每日向动物提供所述饲料组合物或饮用水。在替代实施方案中，可将所述饲料组合物或饮用水在泌乳期间和/或在妊娠期间施用于动物。上述用于施用所述饲料组合物或饮用水的时间段是非限制性实例，并且应理解可使用确定为有效改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境、或它们的组合的任何时间段或施用方案。
如本文所述，方法实施方案中的一个是通过向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水来饲喂动物的方法，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合。
在其中所述效应是改善动物性能的实施方案中，动物性能的改善选自：降低饲料转化率(例如，降低饲料增重比(F/G))，增加平均日采食量(ADFI)，增加平均日增重(ADG)，改善性能一致性，改善饲粮可消化率，改善代谢能与总能量的比率，以及它们的组合。在一个实施方案中，芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300可通过产生增加消耗营养物的可消化率的酶来增加饲粮的可消化率，其中所述酶选自：α-半乳糖苷酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶以及它们的组合。所述酶还可为降解长链脂肪酸的任何其他酶，诸如降解硬脂酸、棕榈酸和/或油酸的酶，但不限于这些脂肪酸。这种饲粮可消化率的增加导致选自以下的动物性能改善：降低饲料转化率(例如，降低饲料增重比(F/G))，增加平均日采食量(ADFI)，增加平均日增重(ADG)，改善动物性能的一致性(例如，减少性能变化，诸如减小F/G、ADFI和ADG的变化并且增加均匀性)，改善代谢能与总能量的比率以及它们的组合。
在其中所述效应是改善动物健康的实施方案中，所述改善可由包括但不限于芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300的抗微生物活性的机制来引起。在各种实施方案中，所述抗微生物活性是对抗选自大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、梭菌、弯曲杆菌以及它们的组合的细菌。因此，芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300可改善动物的肠健康，并且减少动物和动物环境中的病原体。在又一个实施方案中，所述动物是鸡，并且鸡健康的改善导致：鸡产下的蛋的数量增加，鸡出生的小鸡的数量增加，或鸡出生的活小鸡的数量增加。
芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300还可降低粪中的高氨和高pH。粪中高氨和高pH的降低使氨对动物的毒性和对降解长链脂肪酸的天然菌群的毒性降低。氨对动物的毒性部分地由NH4解离成NH3，以在动物环境中产生氨气引起。NH3比NH4更有毒性并且可在动物中导致呼吸疾病。因此，芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300有助于降低对动物的毒性，有助于维持动物中的正常微生物平衡，并且有助于减少动物中与环境毒性相关的疾病。
在其中所述效应是改善动物环境的实施方案中，对环境的改善选自：降低粪的pH，降低粪中截留爆炸性气体的长链脂肪酸含量，减少粪中的氨，减少氨挥发，减少粪坑发泡，减少粪中的爆炸性气体以及它们的组合。
在这些实施方案中，粪中的高氨和高pH可抑制降解长链脂肪酸的细菌(例如，乳酸菌和互营单胞菌(Syntrophomonas))的生长。长链脂肪酸通常发现于饲喂高脂质饲粮(例如，含有干酒糟可溶物的饲粮或含有大豆的饲粮，诸如大豆粉饲粮)的动物的粪中，其中所述脂质分解成长链脂肪酸。粪中长链脂肪酸的积聚可对动物的环境有害，因为长链脂肪酸截留导致例如坑发泡和谷仓中爆炸的爆炸性气体。长链脂肪酸还可抑制将降解所述长链脂肪酸以产生较少有害产物的天然菌群。
芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300不仅降低粪中的高氨和高pH，而且这些菌株还降解长链脂肪酸。由芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300造成的粪中截留爆炸性气体的长链脂肪酸含量的降低使粪中爆炸性气体(例如，甲烷气体，氢气，磷化氢气体和它们的组合)减少，并且因此减少谷仓中的爆炸。如上文论述的，粪中高氨和高pH的降低通过减少动物环境中的NH3来改善动物健康。粪中高氨和高pH的降低还抑制谷仓中的氨闪蒸(例如，当NH3闪蒸出时)，所述氨闪蒸导致氮损失和粪作为肥料的价值降低。因此，芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300提高粪作为肥料的价值。
如本文所述，另一个方法实施方案是控制粪的有害环境效应的方法。所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
在该实施方案中，芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300引起选自以下的效应：降低粪的pH，降低粪的长链脂肪酸的含量，减少粪中的氨，减少粪坑发泡，减少粪中的爆炸性气体，减少氨挥发以及它们的组合。在这些实施方案中，如已经论述的，粪中的高氨和高pH可抑制降解长链脂肪酸的细菌(例如，乳酸菌和互营单胞菌(Syntrophomonas))的生长。长链脂肪酸通常发现于饲喂高脂质饲粮的动物的粪中，其中所述脂质分解成长链脂肪酸。粪中长链脂肪酸的积聚可对动物环境有害，因为长链脂肪酸截留导致谷仓中爆炸的爆炸性气体。长链脂肪酸还可抑制将使所述长链脂肪酸降解成较少有害产物的天然菌群。
芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300不仅降低粪中的高氨和高pH，而且这些菌株还降解长链脂肪酸。由芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300引起的粪中长链脂肪酸含量的降低使粪中爆炸性气体减少，并且因此减少谷仓中的爆炸。粪中高氨和高pH的降低抑制谷仓中的氨闪蒸，所述氨闪蒸导致氮损失和粪作为肥料的价值降低。因此，芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300提高粪作为肥料的价值。
在另一个方法实施方案中，提供控制粪的有害环境效应的方法。所述方法包括以下步骤：向粪、窝、坑、或粪池施加组合物，所述组合物包含有效量的选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
在该实施方案中，可通过任何适合的方法来将芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300施加于粪、窝、坑(例如，猪坑)或粪池。例如，可通过喷雾或以粉末、液体或丸粒的形式，或者通过添加粉末或可泵送液体来将芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300施加于粪、窝、坑或粪池。在其中将芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300施加于粪的实施方案中，所述粪可在厌氧消化池、厌氧污水塘或油脂捕集器中。可例如以粉末、液体或丸粒的形式将菌株施加于厌氧消化池、厌氧污水塘或油脂捕集器中。在该实施方案中，将所述芽孢杆菌菌株施加于窝可导致窝中的氨减少。
在该方法实施方案中，所述方法可通过选自以下的效应来改善动物环境从而改善动物健康：减少动物的呼吸问题，改善动物的肠健康，改善动物性能的一致性，减少动物中与环境毒性相关的疾病，以及减少动物中的病原体。在其中所述动物是家禽物种的实施方案中，所述方法可通过选自以下的效应来改善动物健康：减少家禽物种的呼吸问题，减少家禽物种的胸囊肿，改善家禽物种的性能的一致性，以及减少对家禽物种脚的损害。这些改善动物健康的机制是非限制性实例。
在本发明的另外的实施方案中，提供包含芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300的组合物。在一个实施方案中，提供商业包装，所述商业包装包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合。
在另一个实施方案中，提供用于动物饲料的饲料添加剂，所述饲料添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合。
在又一个实施方案中，提供用于动物饮用水的添加剂，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合。
在本发明的又一个说明性方面中，提供动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300(NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
在一个实施方案中，用于添加至动物饲料掺合物中以产生全价饲料组合物的饲料添加剂可例如利用自动化微营养物递送系统，或者，例如通过手动称量和添加，来与动物饲料掺合物混合，以达到本文所述的芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300的任何剂量，从而以全价饲料组合物的形式施用于动物。混合还可通过本领域已知的任何其他适合方法来进行以使直接饲喂微生物与动物饲料掺合物组合来获得均匀混合物。在各种实施方案中，所述混合可进行任何适合的时间段(例如，约1至约4分钟)。在其中芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300呈用于动物饮用水的添加剂形式的实施方案中，芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300可呈例如粉末、液体或丸粒的形式，并且可使用本领域已知的任何适合方法来与饮用水混合以达到本文所述的芽孢杆菌菌株86和芽孢杆菌菌株300的任何剂量，从而在动物饮用水中施用于动物。芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300还可以粉末、液体或丸粒的形式经口(即，通过口腔插入)直接饲喂至动物。
在本文所述的组合物实施方案中的任一个中，芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300可引起选自以下的效应：改善动物性能，改善动物健康，改善动物环境以及它们的组合。本文所述的商业包装、饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂还可抑制选自以下的病原体：大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、梭菌、弯曲杆菌以及它们的组合。这些效应是芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300可引起的效应类型的非限制性实例。
在一个说明性方面中，所述饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或所述饲料组合物可呈商业包装的形式。在另一个说明性实施方案中，所述饲料添加剂或用于动物饮用水的添加剂、或商业包装中的芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300可呈浓缩物(例如，约1×108CFU/g至约5×109CFU/g)或超浓缩物(例如，约1×1010CFU/g至约5×1012CFU/g)的形式，或可呈相同形式但可用于处理粪、窝、坑或粪池中。在另一个实施方案中，所述饲料添加剂、饲料组合物、或用于动物饮用水的添加剂、或商业包装中的组合物中的芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300可呈干燥形式(例如，粉末)、丸粒状形式、液体形式，呈顶部敷料(top-dressing)的形式，或呈凝胶形式，或任何其他适合的形式。
在又一个实施方案中，呈商业包装形式的菌株可呈用于处理粪的形式，呈用于处理坑的形式或呈用于处理窝的形式。在该实施方案中，芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300可例如呈干燥形式(例如，粉末或冷冻干燥的形式)，呈丸粒状形式，或呈液体形式。
在另一个说明性实施方案中，所述商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物可进一步包含用于芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300的载体。所述载体可选自：糠、稻壳、盐、矿物油、糊精(例如麦芽糊精)、乳清、糖、石灰石、干燥的淀粉、铝硅酸钠、植物油以及它们的组合。在另一个实施方案中，所述载体可为本领域已知用于直接饲喂微生物的任何适合载体。在另一个实施方案中，所述商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物可进一步包含粘合剂，诸如粘土、酵母细胞壁组分、硅酸铝、葡聚糖或其他已知粘合剂。
在又其他实施方案中，包含芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂、或饲料组合物在用于商业用途的容器中。在各种实施方案中，所述容器可为例如袋(例如20磅袋、50磅袋、2盎司袋、1磅袋或1千克袋)、小袋、桶、瓶或盒。在说明性方面中，用于包含芽孢杆菌菌株86和/或芽孢杆菌菌株300的商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂或饲料组合物的容器可包含塑料、金属、箔、纸、纤维或纸板(例如塑料桶、纸袋、箔袋、纤维桶等)。所述商业包装、饲料添加剂、用于动物饮用水的添加剂或饲料组合物可进一步包含用于使用所述芽孢杆菌菌株中的一种或多种的说明。
以下实施例仅用于说明的目的。实施例是非限制性的，并且不意图以任何方式限制本发明。
实施例1
菌株组合提高肉鸡活体生长性能的功效
本实施例的目的在于测定几种芽孢杆菌物种菌株组合在肉鸡中促进增重和饲料/能量转化的功效。评估了饲喂补充有各种菌株组合(DFM)的饲粮的肉鸡的生长性能反应。
对于该研究而言，利用了总共60个圈，其中组大小为每个圈35只禽。圈中利用的窝是先前使用(但没有先前使用DFM)的木材锯末。
评估了大约2100只孵化鸡(Cobb 500遗传学)，包括混合性别圈中的公鸡和母鸡。鸡在孵化时接受抗球虫疫苗(雾施加)。鸡的起始重量是约50克，并且鸡的最终重量是约2.75kg。
在研究中，所述鸡被分成如表1中所示的四个组：
表1.实验处理组
对于实验分配鸡，按圈对禽称重，并且将圈分组成六(6)个相似重量的圈的重复。来自重复内的圈被随机分配至饲粮处理并立即开始研究，并且保持饲粮处理直至实验周期结束。动物的日常管理按照农场的标准操作程序。从实验中移除需要连续3天进行药物治疗的禽。记录在移除时的研究日和禽的体重以用于该圈性能的适当描述(accounting)。
获得并评估窝组合物的测量结果。在小鸡安置之前、研究的第3周期间和研究结束时，从四(4)个重复(每一半谷仓中两个)中取出窝样品。窝样品经受大肠菌、pH、水分和氨的分析，并且保留以用于将来可能的分析。
还获得并评估了活体性能的测量结果。在研究开始时和每两周一次间隔记录总圈重，对应于饲粮阶段变化，此后直至实验周期结束。实验饲料经手工制造、递送和记录。在实验周期结束时喂料器中的饲料被移除并称重，并且使用该重量来计算按圈的总饲料消失。使用每个圈的圈重、递送的饲料和喂料器中的饲料来计算体重、采食量和饲料转化率(克饲料/克体重)。从每个圈的总采食量、各饲粮的代谢能(ME)含量和每只禽的总活体增重来计算热量效率(kcal/lb增重)。记录所有发病和死亡事件、连同任何主要健康问题。变得病态的任何禽被从研究中移除并称重，并且记录其个体鉴定号、性别、室、圈、移除日期和移除理由。
还评价了经济性能的评估。每个圈的饲料成本计算为每个圈所消耗的总饲料与每种饲粮成本的和积。每只禽的饲料成本计算为每个圈的总饲料成本除以实验结束时存在禽的总数量。每增重100磅的饲料成本计算为饲料/增重(F/G)与成本/100磅饲料(总饲料成本/总胴体重量(cwt)饲料)的乘积。每只禽收益计算为胴体重量(cwt)与肉价($/磅)的乘积。每只禽超出饲料的利润计算为每只禽的收益与饲料成本之间的差值。
用于本实施例中的实验饲粮配方包括黄色马齿型玉米(Producers Cooperative,Bryan,TX)和家禽脂肪(Griffin Industries)。试验材料DFM菌株由Microbial DiscoveryGroup(Franklin,WI)提供。对照饲粮含有补充脂肪(家禽)、5％DDGS以及3％肉骨粉。DFM物料的鉴定信息如下：
根据以下年龄范围，以三个阶段给鸡饲喂饲粮：阶段1——第1-2周；阶段1——第3-4周；和阶段3——第5-6周。
所有饲粮配制成具有足够的SID Lys(％,NRC,1994)和其他必需氨基酸(AA)、可利用磷(P)、钙(Ca)和钠(Na)(参见表2)。
表2.按生产阶段的实验饲粮的饲粮营养物配方限制
饲粮缺乏饲料级抗生素和抗球虫药。在牺牲玉米的情况下，将试验DFM物料补充至最终饲粮(参见表3)。
表3.用于实验饲粮的饲粮配方
在卧式混合器中混合饲粮组分。将一定量玉米添加至混合器以便在每批补充DFM的饲粮之间冲洗系统。在30秒的调节之后在185℉下将各饲料压粒。用于第1-2周的饲粮在压粒之后粉碎。用手将实验饲粮递送至每个圈，并且手动记录添加。
在每次制造饲粮时取出玉米、SBM和DDGS的样品。最终实验饲粮在制造时取样。将饲料原料(合并)和实验饲粮的样品分成五(5)个样品，其中一个保留并且剩余四个可用于以下分析的提交：近似组分和矿物质、氨基酸、微生物计数和真菌毒素。
针对所有度量进行初始数据分析来测定方差齐性、正态分布和界外值(与总均值相差±>3标准偏差)。
饲料转化率(FCR)：
表4显示出在开食期(starter)、生长期和肥育期阶段的各种处理组中直跑(straight-run)肉鸡的死亡率校正的饲料转化率(FCR)。
表4.饲喂包含直接饲喂微生物的标准玉米-大豆饲粮的直跑肉鸡的死亡率校正的饲料转化率(FCR)
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
在开食期阶段中，除MDG-3(7.354)导致相比于对照的显著降低之外，在所有处理中DFM的包含产生与对照相似的结果。在整个生长期和肥育期阶段中，未观测到FCR的显著差异。
表5显示出处理阶段的第1-28天和处理阶段的第1-41天的各种处理组中直跑肉鸡的死亡率校正的饲料转化率(FCR)。
表5.饲喂包含DFM的标准玉米-大豆饲粮的直跑肉鸡的死亡率校正的累积饲料转化率(FCR)
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
至第28天，MDG-1和MDG-3(1.845)的包含产生与对照饲粮相似的FCR。相比于对照饲粮，在包含MDG-3(7.354)的情况下观测到FCR的显著降低。在试验结束时(即，至第41天)，处理之间未观测到显著差异。
体重：
表6显示出在处理的第1天、第14天、第28天和第41天时各种处理组中饲喂标准玉米-大豆饲粮的直跑肉鸡的计算体重。
表6.饲喂包含直接饲喂微生物的标准玉米-大豆饲粮的直跑肉鸡的体重(kg)
如表6中所示，在整个试验期间，在与处理相关联的体重上未观测到显著差异。
死亡率：
表7显示出在开食期、生长期和肥育期阶段的各种处理组中饲喂标准玉米-大豆饲粮的直跑肉鸡的死亡率。
表7.饲喂包含直接饲喂微生物的标准玉米-大豆饲粮的直跑肉鸡的死亡率(％)
如表7中所示，在整个试验期间，处理之间未观测到死亡率的差异。
对该研究中实验的结论是，DFM产品导致球虫病接种的肉鸡中饲料转化率的改善。在包含MDG-3(7.354)的情况下，改善在28天龄时达到显著水平，并且在第41天改善了3个点。
实施例2
用来确定理想DFM菌株组合的肥育猪的生长性能研究
图1显示出饲喂各种DFM菌株组合的肥育猪的生长性能。图1表明关于ADFI和ADG，菌株86单独比与其他菌株组合的性能更好。然而，在实施例3的结尾所述的另一试验表明，关于ADFI和ADG，菌株86加菌株300的组合比菌株86单独的性能更好。86+300+552的比率分别是33.3％、33.3％和33.3％。86+552和300+552的比率是50:50。
实施例3
饲喂各种DFM菌株组合的肥育猪的生长性能
该研究的目的在于测定几种芽孢杆菌物种DFM菌株组合促进肥育猪中增重和生长性能的功效。
在本实施例中评估了三个不同的组：13-F040、13-F071和13-F072。在实施例中，评估了PIC 337×Camborough29猪，包括混合性别圈中的阉公猪和小母猪。各组的参数在如下表8中显示：
表8.处理方案的参数
13-F040 13-F071 13-F072
设施 BRFC&DFIN BRFA&BFIN DEOW2MN
组大小 22头猪 26头猪 12头猪
年龄 约23周 约18周 约19周
起始重量 232±5lbs 171±5lbs 210±11lbs
最终重量 284±8lbs 277±7lbs 276±7lbs
持续时间 29天 60天 38天
在此研究中，所述猪被分成如表9中所示的三个组：
表9.实验处理组
处理组 实验处理
A 玉米-SBM(阳性对照)
B 玉米-SBM+7.35×104cfu/g Bs菌株86
C 玉米-SBM+7.35×104cfu/g Bs菌株86+300+552组合
在各实验开始时，猪的混合性别圈按重量分类成基于体重的重复。然后，将来自重复内的圈随机分配至饲粮处理并且立即开始研究。圈保持饲粮处理直至实验周期结束。
日常管理按照各农场内的标准操作程序。每天对猪进行目测检查以确保个体猪符合体况标准和农场标准操作程序的准则。未符合这类准则的猪根据农场标准和主治兽医的建议来进行药物治疗。需要药物治疗连续3天并且未显示改善迹象的猪被从实验中立即移除。
记录所有发病和死亡事件、连同任何主要健康问题。对变得病态并且被从研究中移除的任何猪进行称重，并且记录其性别、室、圈、移除日期和移除理由。将从试验中移除的猪分类为营养或非营养移除理由(参见表10)。
表10.移除原因的鉴定
1呼吸疾病＝PRRS；肺炎；流感；或砰然作声(thumping)。
2胃肠疾病＝回肠炎；肠出血；肠梗阻；或溃疡。
3其他疾病＝链球菌病(strep)或仔猪皮脂溢。
4损伤＝骨折；啄癖(cannibalism)；脓肿；或关节肿胀
5结构缺陷＝冠断裂(broken top)；腿健全问题；或外翻腿
6疝＝阴囊疝或脐疝
7消瘦＝变瘦；厌食症；或一般的生长发育不良(general unthrifitiness)
8非卧床性，非损伤性(NANI)＝卧地不起(downers)和压力相关性问题
9不能找到饲料或水
10低体重
11未列出的其他理由
还获得并评估了胴体性能的测量结果。收集了胴体重量、背部脂肪和第10肋骨处的腰脊深度、计算的瘦肉含量、分类折扣和瘦肉溢价。胴体产率计算为胴体重量除以如在现场(at the plant)测量的活重，乘以100。胴体ADG计算为胴体重量与实验开始时的胴体重量之间的差值，定义为起始重量×0.75；胴体F/G计算为ADFI/胴体ADG。从每个圈的总成分摄取、所使用的各成分的ME含量和每个圈的总胴体增重来计算胴体热量效率(kcal/磅胴体增重)。
还评价了经济性能的评估。每个圈的饲料成本计算为每个圈所消耗的总成分与每单位各成分的成本的和积。每头猪的饲料成本计算为每个圈的总饲料成本除以实验结束时存在猪的总数量。每磅增重的饲料成本(活体和胴体两者)计算为F/G与成本/磅饲料(总饲料成本/总磅饲料)的乘积。每头猪的收益计算为胴体重量(cwt)与基础价格和瘦肉溢价($/cwt)之和的乘积。每头猪超出饲料的利润(MOF)计算为每头猪的收益与饲料成本之间的差值。
本实施例中使用的实验饲粮配方包括诸如以下的饲料原料：黄色马齿型玉米(Co-Alliance,Frankfort,IN)、大豆粉(ADM,Frankfort,IN)、DDGS(The Andersons,Clymers,IN)、精选白色油脂(IPC,Delphi,IN)和基本混合物(basemix)(JBS United,Inc.,Sheridan,IN)。玉米、大豆粉(SBM)和DDGS的载荷值在表11中显示。
表11.营养物载荷值和饲料原料分析
芽孢杆菌(Bs)菌株组合中的各者由Microbial Discovery Group(Franklin,WI)制造和提供。处理B包含Bs菌株86和300，而处理C包含Bs菌株86、300和552。每种菌株组合在添加至实验饲粮之前与玉米预混合。根据表12中概述的各实验预算按重量范围给猪饲喂实验饲粮。
表12.实验饲粮的饲粮饲料原料和配方限制
所有饲粮使用推荐值配制成具有足够的必需氨基酸、可利用P、Ca和Na。饲粮使用玉米和大豆粉构成，并且在各实验内的饲粮包括30％的DDGS。饲粮不含有补充脂肪。
饲粮制造和递送参数在表13中显示。对于13-F040和13-F071组而言，饲粮组分经过电子饲料混合、递送和记录系统来混合并递送至各喂料器。对于13-F072组而言，最终实验饲粮在饲料粉碎机中混合并且经过电子饲料混合、递送和记录系统来递送至各喂料器。
表13.实验饲粮的配方
对每种饲料原料取样以用于根据标准规程的营养物和真菌毒素分析。最终实验饲粮每两周一次从每个饲粮处理的最少5个喂料器中取样并且对于各处理合并到一起。在认为必需的情况下提交饲料原料和实验饲粮样品以用于以下分析：近似组分和矿物质、氨基酸和真菌毒素。
每个实验与其他实验分开进行统计分析，以及经过荟萃分析，并且在每个实验中，来自三个实验的数据使用另一类变量‘Exp’来进行组合。针对单个数据集和组合数据集的所有度量进行初始数据分析来测定分布正态性和界外值(与总均值相差±>3标准偏差)。
跨实验的性能度量的总均值在表14中显示。
表14.跨实验的性能度量的总均值
肥育后期中饲喂不同DFM组合的猪的生长性能在表15中显示。单独的菌株86和与其他两种菌株组合成三菌株组合的比较显示出在平均日增重上，单独的菌株86比对照显著改善。单独的菌株86趋向于具有p＝0.057的显著性，但当起始重量被认为协变量时是显著的。菌株86的最终重量相比于对照不认为是显著的，但将起始重量考虑为协变量时认为是显著的。单独的菌株86的胴体重量趋向于具有p＝0.051，但在起始重量作为协变量的情况下认为是显著的。
表15.在肥育后期中饲喂不同DFM组合的猪的生长性能
1数据为来自由其中出现所有三个列出的处理组合的三个实验的平均值。
2数据作为随机完全区组设计来分析，包括处理的主效应、实验和实验内重复的随机效应以及协变量起始重量和饲喂天数。
3基于以下饲料原料成本来计算饲料成本：玉米，$4.25/bu；大豆粉，$500/吨；DDGS，$225/吨；基本混合物，$900/吨；并且DFM以等同于$5/经处理吨的饲料的成本来估价。
4收入计算为胴体重量(cwt/猪)乘以$80/cwt的基础肉价。
考虑到跨实验的起始重量和饲喂天数差异，DFM添加对平均日增重的效应(Trt P＝0.053)取决于DFM配方，因为单独的Bs菌株86超过对照增加(P＝0.018)ADG 3％，但3-菌株组合不具有效应。类似地，DFM添加以配方依赖性方式影响饲料/增重比率(Trt P＝0.089)，其中单独的Bs菌株86降低(P＝0.057)饲料/增重比率1.5％，并且3-菌株配方不产生影响。
图2显示出跨三个实验的DFM菌株对生长性能的效应的荟萃分析。组合使用DFM菌株86和300、单独使用DFM菌株86和300或与其他芽孢杆菌或乳酸菌菌株组合来进行总共三(3)个分开的试验。利用7.35×104CFU/克的通用剂量。
如图2中所示，使用单独的DFM菌株86的处理使增重增加大约3％(P＝0.05)并且使F/G降低大约2％(P＝0.06)。在实验13-F072(80％菌株86和20％菌株300)中，对于ADG而言，DFM菌株86和300的组合物在数值上比单独的DFM菌株86更好。
实施例4
酶活性筛选
本实施例描述了使用平板培养基筛选方法来检测DFM菌株86、300和其他相关分离物中的酶活性。通过用0.5％与1％之间的各种底物补充胰胨豆胨琼脂来制备酶测定培养基平板，所述底物包括多糖(玉米淀粉、羧甲基纤维素或木聚糖)、蛋白质(酪蛋白)和脂质(三丁酸甘油酯)。将从新鲜过夜培养物获得的目标芽孢杆菌菌株(包括DFM菌株86和300)点样至平板(5μl)上并且在32℃下孵育长达48小时。对于蛋白质和脂质琼脂平板而言，产酶菌落周围的透明区在不经过进一步处理的情况下可见。含多糖的平板用革兰氏碘染色1分钟以显现透明区。观察到DFM菌株86和300在48小时之后均对蛋白酶、淀粉酶和羧甲基纤维素(CMC酶)活性呈阳性，并且观察到在72小时之后对三丁酸甘油酯琼脂(脂肪酶)的强阳性。
如图3中所示，所述芽孢杆菌菌株具有包括但不限于淀粉酶、羧甲基纤维素、蛋白酶、木聚糖酶和脂肪酶的酶活性。
实施例5
底物测试总结
在本实施例中，进行了DFM菌株86和DFM菌株300的比较来测定底物利用的变化。测试了许多参数，包括酶活性、病原体抗微生物活性、DDGS的消化和某些生产抗生素的耐受性。
用于DFM菌株86和DFM菌株300的碳水化合物和羧酸碳源的列表呈现在表16中。
表16.所利用的碳水化合物和羧酸碳源
由DFM菌株86和DFM菌株300所利用的磷酸和硫源的列表呈现在表17中。
表17.所利用的磷酸和硫源
对DFM菌株86和DFM菌株300观测的独特营养利用的列表呈现在表18中。
表18.独特营养利用
如表16-18中所示，两种DFM菌株似乎利用极广泛阵列的氨基酸和二肽键。DFM菌株86和DFM菌株300分别利用123种和149种氨基酸和二肽键。DFM菌株300似乎具有更多功能，因为该菌株比DFM菌株86多使用26种氨基酸和二肽键，包括数种不常发现于微生物中的D-氨基酸。
两种菌株使用非常广泛种类的碳源，但DFM菌株86似乎使用许多α-半乳糖苷，诸如蜜二糖、水苏糖和棉子糖。此外，DFM菌株86能够利用麦芽糖和麦芽三糖，其在DFM菌株300中未观测到。
另外，DFM菌株86和菌株300均能够使用各种磷酸盐和硫源，包括植酸盐。两种菌株均能够使用植酸盐分解产物m-肌醇。关于磷酸盐化合物利用的阵列，DFM菌株300似乎更宽。
最后，DFM菌株86和菌株300均能够使用各种吐温化合物，这指示分解诸如棕榈酸、油酸和硬脂酸的长链脂肪酸的能力。其他数据表明，观测到的对长链脂肪酸的活性可根据需氧或厌氧环境中的存在而不同。
实施例6
利用交叉划线方法和穿刺划线方法的抗微生物筛选
该实施例描述了使用交叉划线平板方法和穿刺划线方法来对包括DFM菌株86和DFM菌株300的目标DFM菌株针对一系列其他生物的抗微生物活性进行筛选。
将从冷冻甘油原种获得的目标芽孢杆菌菌株(包括DFM菌株86和DFM菌株300)接种在跨过合适营养培养基的平板中心的单个1cm宽划线(交叉划线)中。当筛选针对大多数非苛求生物的活性时使用胰胨豆胨琼脂(对于针对梭菌菌株的筛选而言，发现加强的梭菌琼脂支持芽孢杆菌菌株以及测试的梭菌菌株的令人满意的生长)。芽孢杆菌划线的平板在32℃下孵育24小时，直至出现生长的重划线为止。
将诸如梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌的待测试易感性的生物(来自冷冻甘油原种)划线在垂直于芽孢杆菌划线的线条中并且在其最优生长条件下孵育24小时。在孵育后，对平板的最初芽孢杆菌划线周围的抑制区进行检验，并且测量每个抑制区的宽度。如图4A中所示，DFM菌株86和300产生抑制病原生物的抗微生物物质，所述病原生物包括但不限于葡萄球菌、肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和梭菌。如图4B中所示，DFM菌株86和300产生抑制另外的病原生物的抗微生物物质。该实施例描述了将穿刺划线平板方法用来对包括DFM菌株86和DFM菌株300的目标DFM菌株针对其他生物的抗微生物活性进行筛选。获自冷冻甘油原种的目标芽孢杆菌菌株(包括DFM菌株86和DFM菌株300)通过用接种针刺穿富营养物培养基平板的中心来接种。将脑心浸液琼脂用于使芽孢杆菌物种和厌氧或微需氧微生物(产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))两者同时生长。接种芽孢杆菌的平板在37℃下孵育16-24小时，这取决于各芽孢杆菌菌株的菌落大小和增殖趋势。一旦孵育已结束，即移除盖子并且将平板在1ml浓缩的三氯甲烷上倒置15分钟以杀死芽孢杆菌菌落。三氯甲烷经由吸收材料来包含，所述吸收材料还充当平板所依靠的平台。在15分钟之后，将平板面朝上放置于生物安全柜中以便使过量的三氯甲烷蒸发同时维持平板的无菌性另外15分钟。将BHI(0.7％)琼脂制备成5ml等分试样并且用于最近灭活的芽孢杆菌菌株的顶部琼脂覆盖物。这些试管用100μl病原性液体培养基悬浮液接种、涡旋、局部施加于用芽孢杆菌接种的平板，并且使其固化。然后倒置平板并且在变化的病原体特异性生长条件下(37℃，具有由BD提供的大气压生长培养基(pak))孵育。在孵育之后，在芽孢杆菌菌落周围观察到抑制区并且出于相对定量的目的以mm为单位来测量。如图4B中所示，菌株86和300产生抑制病原生物的抗微生物物质，所述病原生物包括但不限于葡萄球菌、肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌、弧菌和弯曲杆菌。
实施例7
抗生素易感性和耐受性筛选
将来自胰胨豆胨肉汤中24小时龄培养物的目标芽孢杆菌菌株(包括DFM菌株86和300)与熔化的米勒-辛顿(Muller-Hinton)琼脂II组合，倒入皮氏平板，并且使其固化。在含有芽孢杆菌的平板硬化之后，将含有抗生素浓度梯度的Etest试纸条(Biomerieux)置于各接种芽孢杆菌的平板的表面上。在32℃下孵育24小时之后，用细菌生长的均匀菌苔覆盖平板，其中抑制区围绕Etest试纸条。通过根据Etest方案来读取试验试纸条来确定每种抗生素的最小抑制浓度。
如图5中所示，使用各种抗生素对DFM菌株86和300的抗生素敏感性进行测试，并且DFM菌株86和300对多种抗生素易感。
实施例8
抗生素易感性和耐受性筛选
抗生素培养基平板是用具有农业重要性的五种抗生素以它们的推荐剂量率的1×、1/10×或1/100×来制备的(PulmotilTM，181g/吨；BMDTM，30g/吨；StafacTM，10g/吨；TylanTM，20g/吨；氯四环素(CTC)+DenagardTM，400g/吨CTC+35g/吨DenagardTM)。通过将5μl新鲜的过夜培养物在抗生素培养基平板上点样并且孵育24小时来筛选芽孢杆菌分离物。记录菌落生长的存在或不存在并且将其用作用于筛选目的的抗生素易感性的粗略测量。
如图6中所示，推荐剂量的CTC+DenagardTM、1/10推荐剂量的BMDTM、和1/10推荐剂量的StafacTM的存在造成对DFM菌株86和300的最小尺寸的抑制区。因此，这些抗生素不应干扰DFM菌株86和300的生长。这些菌株还耐受甲醛(Sal CURB,Termin-8)并且用CarbadoxTM(113.4g/吨)观测到最小抑制。
实施例9
酒糟(Distilled Grain)基本培养基筛选
为了对芽孢杆菌分离物(包括DFM菌株86和300)利用干酒糟及其可溶物(DDGS)作为营养源的能力进行筛选，用DDGS作为主要碳源和氮源来制备基本培养基：0.023％K2HPO4、0.01％MgSO4*7H2O、0.1％微量元素原液、0.05％酵母提取物、0.0002％MnCl2*4H2O、0.002％FeCl3和0.2％DDGS。该培养基的无菌10ml管用这些芽孢杆菌菌株接种、在25℃下孵育72小时并且对生长评分。将具有强生长的管用于相同培养基中的10×连续稀释，在25℃下孵育24小时，并且再次对生长评分，其中稍后的稀释步骤的浊度充当初始细胞计数的粗略指示。
如图7中所示，在DDGS作为唯一碳源的情况下，DFM菌株86和300均展现生长和消化DDGS的能力。DFM菌株86在菌株中具有最高生长，在二级筛选之后在10-8稀释管中具有浊度。DFM菌株300显示出在72小时的中等生长，在二级筛选之后在10-4稀释管中具有浊度。
实施例10
相对于粪pH对DFM菌株的评估
该实施例描述了芽孢杆菌DFM菌株86和300在体外降低液体猪粪的pH和游离氨的用途。从几个猪生产设施中的深坑系统收集的液体粪被分成50ml部分并且用DFM菌株86、300的冷冻干燥培养物接种。所有冷冻干燥培养物由平板计数方法计数，并且通过将孢子悬浮于0.1％蛋白胨中来制备接种体。
接种的粪样品管被松散封盖并且在25℃下且不伴随振荡，在不流动、非充气条件下孵育最少24小时。在24小时(以及在一些情况下，在之后另外的24小时间隔)，使用pH电极来测定pH，并且通过于Millipore水中1/20稀释部分的粪样品来测定总氨氮(TAN)以用于利用Hach ISENH4铵离子敏感电极的分析。所有测量在25℃下进行。游离氨的级分和浓度来源于样品的pH、温度和TAN。
如图8和图9中所示，用含有DFM菌株86和300的菌株掺合物的处理与多个试验中降低的pH和降低的游离氨相关联。效应大小在粪类型之间变化。
实施例11
DFM菌株86、300对长链脂肪酸的消化
为了测定DFM菌株86和300是否能够利用长链脂肪酸作为能量源，用或者无碳源或者油酸、棕榈酸或硬脂酸作为唯一碳源来制备基本培养基(2×矿物质原液、10mM磷酸盐缓冲液和0.1％脂肪酸，调整至pH 7.0、7.5、8.0)。将获自冷冻甘油原种的DFM菌株86和300接种至各类型的基本培养基中并且在37℃下伴随或不伴随振荡孵育48小时。通过用分光光度计测量在600nm下的光密度来测定生长。
如图10中所示，在需氧条件下，DFM菌株86显示出在不同pH下利用棕榈酸和硬脂酸的显著生长(A600的变化>0.1)，并且DFM菌株300显示出在7.5和8.0的pH下利用棕榈酸和硬脂酸的显著生长。如图11中所示，在厌氧条件下，DFM菌株86显示出在7.0、7.5和8.0的pH下利用棕榈酸和油酸的显著生长(A600的变化>0.1)，并且DFM菌株300显示出在7.5和8.0的pH下利用棕榈酸和油酸的显著生长。
实施例12
DFM菌株86和300的RAPD(随机扩增多态性DNA)分析
为了获得菌株文库中所收集的芽孢杆菌菌株的遗传条形码或“指纹”，利用来自芽孢杆菌文库的各菌株来进行RAPD(随机扩增多态性DNA)分析。各分离物在32℃下10ml胰胨豆胨肉汤中培养过夜。此后，使用Qiagen的DNeasy Mini试剂盒按照为革兰氏阳性细菌提供的方案从这些培养物中提取DNA。使用GE Healthcare Illustra Ready-To Go RAPD试剂盒对各DNA样品进行RAPD-PCR以扩增任意长度的遗传片段。PCR产物经由凝胶电泳分离，并且使用BioNumerics软件来检测和匹配带型。如图12中所示，尽管观察到一些条带被DFM菌株共享，但两种DFM菌株之间未观察到共同的DNA指纹。因此，图12证明DFM菌株86和300是不同的菌株，各自具有独特DNA指纹。
实施例13
DFM菌株86和300的培养物生长
在本实施例中，可通过培养来实现DFM菌株86和300的生长。在小规模上，TSB或营养肉汤可用来培养DFM菌株86和300。
琼脂培养基可使用23克营养琼脂(BD 213000)和1000ml去离子水来产生，接着在121℃下高压灭菌。肉汤培养基可使用8.0克营养肉汤(BD 234000)和1000ml去离子水来产生，接着在121℃下高压灭菌。
对于培养DFM菌株86而言，将DFM菌株86的纯培养物在营养琼脂平板上划线并且使其在32℃下生长48小时。此后，将单菌落接种在营养肉汤培养基中。在37℃和230-240rpm下孵育单菌落16至24小时。最后，将培养物在营养琼脂平板上划线以检查形态。
对于培养DFM菌株300而言，将DFM菌株300的纯培养物在营养琼脂平板上划线并且使其在32℃下生长48小时。此后，将单菌落接种在营养肉汤培养基中。在37℃和230-240rpm下孵育单菌落16至24小时。最后，将培养物在营养琼脂平板上划线以检查形态。
实施例14
在肉鸡中对利用DFM的变化策略的生长性能反应
本实施例的目的在于测定肉鸡的增重、热量效率和存活性对DFM的多种利用策略的反应。研究了选定的DFM组合对饲养至7周(49天)龄的肉鸡的增加的增重、降低的饲料转化率和改善的存活的效应，其中使用随机完全区组设计、作为重复因子的活重(按圈)和10个重复来分析生长和胴体数据。
对于该研究而言，利用了总共60个圈(6×6ft，35ft2/圈，扣除1ft2用于喂料器空间)，其中每个圈的组大小为35只禽。所述圈配备有干管喂料器(30-lb饲料容量)，具有50in.(1.7in./禽)的总喂料器空间和5个乳头式饮水器/圈(7只禽/乳头)。
评估了大约2100只孵化公鸡(Cobb 500遗传学)。所述鸡的起始重量是约40克，并且所述鸡的最终重量是约3.2kg。
在所述研究中，所述鸡被分成如表19中所示的六个组：
表19.实验处理组
处理组 实验处理
A 玉米-SBM-5％干酒糟可溶物(DDGS；阳性对照)
B As A+7.35×104CFU/g(0.15lbs/吨)MDG.DFM仅在开食期阶段中
C As A+7.35×104CFU/g(0.15lbs/吨)MDG.DFM仅在开食期和生长期阶段中
D As A+7.35×104CFU/g(0.15lbs/吨)MDG.DFM连续
E As A+5.50×104CFU/g(0.1125lbs/吨)MDG.DFM连续
F As A+7.35×104CFU/g(0.224lbs/吨)MDG.DFM-v2连续
MDG.DFM表示80％菌株86和20％菌株300；MDG.DMF-v2表示50％菌株86和50％菌株300(Microbial Discovery Group,Franklin,WI)。
实验程序如下：
动物护理方案：按照批准的动物使用方案来提供护理。环境条件每日监测3次。通过Rodem Plantium Junior来提供和调节年龄适宜温度。用多个压力通风型加热器提供热量。房屋利用在一端的冷垫和在另一端的3-60英寸风扇来隧道通风。
动物的实验分配：基于日龄小鸡重量将禽分配至圈。所有重复圈的初始圈重具有30克的最大范围。然后，将来自重复内的圈随机分配至饲粮处理并且立即开始研究。圈保持饲粮处理直至实验结束。
测量：
活体性能：
总圈重——起始，孵化后第2周、第4周、第6周和第7周。
饲料消失——孵化后第2周、第4周、第6周和第7周。
通过以下公式针对死亡率来调整饲料/增重比率：
消耗的总饲料/(圈增重+死亡率重量)。
热量效率(kcal/lb增重)：——孵化后第2周、第4周、第6周和第7周。
发病率和死亡率。
胴体性能：各重复圈的亚组经加工以测定胴体、脂肪垫和胸肉产率。每个重复圈随机选择六只肉鸡用于产率测定。
实验饲粮配方：
饲料原料是：黄色马齿型玉米、大豆粉、玉米低油DDGS和猪肉骨粉(ProducersCooperative,Bryan,TX)，并且脂肪是家禽脂肪(Griffin Industries)。
实验试验材料：MDG.DFM(80％菌株86和20％菌株300)9.8×108CFU/g；MDG.DFM-v2(50％菌株86和50％菌株300)6.55×108CFU/g。
实验饲粮规格：四个饲粮阶段——第1-2周、第3-4周、第5-6周、第7周。对照饲粮含有至少2％补充脂肪(家禽脂肪)、5％DDGS和5％肉骨粉。所有饲粮配制成具有足够的SIDLys(％,NRC,1994)和其他必需AA、可利用P和Ca。在牺牲玉米的情况下，将试验材料补充至最终饲粮(表20)。在卧式混合器中混合饲粮组分。
各饲粮在30s调节之后在185℉下压粒。用于第1-2周的饲粮在压粒之后粉碎。在开食期阶段中测定DFM配方的丸粒稳定性。样品如下获得并且送去分析：在开始时获得2-lb糊状(Mash)样品，并且在对每个含DFM处理的各压粒运行期间获得丸粒状饲料的5个样品(每个样品1-lb)。在各新一轮的压粒运行的短暂适应之后收集丸粒状饲料的样品，并且来自各2.0lb样品的1.0lb组合以形成用于各处理的合并样品。使丸粒状饲料样品冷却至室温，之后密封用于运输。糊状和丸粒状饲料样品均送去分析。
饲粮取样：在实验饲粮的每个制造点对各饲料原料取样以用于营养物和真菌毒素分析，并且对最终实验饲粮取样。
统计程序如下进行：在分析之前，检查所有数据的界外值。从数据集中移除与该度量的总均值相差>3标准差的任何观测值。累积体重、生长、胴体和经济性能作为具有六(6)个处理和10个重复的RCBD进行分析。发病率、死亡率和其他健康相关度量作为非参数数据进行分析。数据经受单因素ANOVA并且使用Fisher’s LSD分离。
用于实验饲粮的饲粮配方在表20中显示。
表20.用于实验饲粮的饲粮配方
基于表19的处理A-F的结果显示于以下表21-30中，概述如下：
表21.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的体重
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于第14天体重而言，未观察到显著差异。
对于第28天体重而言，在相比于对照饲粮时，处理B和D显示出显著更高的平均体重，而所有剩余处理处在中间。
对于第42天体重而言，在相比于对照和处理E时，处理B、D和F具有显著更高的平均体重，而处理C处在中间。
在第48天，在相比于对照饲粮时，处理D和F产生更高的体重，而所有剩余处理处在中间。
表22.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的消耗饲料(g/禽/天)
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于在开食期阶段期间消耗的饲料而言，未观察到显著差异。
在生长期阶段期间，处理F每只禽消耗最多饲料，显著高于对照饲粮。所有其他处理处在中间。
对于在肥育期阶段期间消耗的饲料而言，处理D具有所有处理中最高的饲料消耗率，并且显著高于对照和处理E饲粮，而所有剩余饲粮处在中间。
在肥育II期阶段期间，处理D和F具有最高的饲料消耗率，显著高于对照、处理C和E饲粮，而处理B保持在中间。
表23.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的消耗饲料(g/禽/天)
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于饲喂不同DFM的肉鸡消耗的饲料而言，未观察到相当大的差异。
表24.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的饲料转化率
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于饲喂不同DFM的肉鸡的FCR而言，在开食期、生长期和肥育期II期间未观察到显著差异。
在肥育期阶段期间在处理D中包含7.35×104的DFM显著降低FCR(当与处理E相比时)，而所有其他处理处在中间。
表25.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的累积饲料转化率
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于在第0-28天的累积FCR而言，相比于饲喂对照和处理F的肉鸡，饲喂处理B饲粮的肉鸡具有显著改善的累积FCR，而所有其他处理处在中间。
对于在第0-42天饲喂不同DFM的肉鸡的累积FCR而言，在相比于对照饲粮时，处理D具有显著更低的FCR，而所有其他处理保持在中间。
在第0-48天饲喂不同DFM的肉鸡的累积FCR导致未观察到显著差异。
表26.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的一致性(变异系数)
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于在第14天、第28天和第42天饲喂不同DFM的肉鸡的一致性而言，未观察到显著差异。
就第48天饲喂不同DFM的肉鸡的一致性，在相比于处理F时，处理E具有显著更高的一致性，而所有其他饲粮处在中间。
表27.在第44天从饲喂不同DFM的肉鸡收集窝pH和铵离子浓度。通过将12g窝物料稀释至60mL蒸馏水中来测定参数。对每个重复圈测量平行样。
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于窝pH而言，在相比于处理F时，处理C具有显著更低的pH，而所有其他饲粮处在中间。
铵离子浓度导致未观察到显著差异。
表28.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的加工重量(g)
a,b,c不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于饲喂不同DFM的肉鸡的加工重量而言，处理D具有最高平均活重。处理B、C和F显著高于对照。处理E与对照无差异。
对于WOG重量而言，处理B、D和F显著高于对照，而处理D为最大。处理C和E大于对照但并非在显著水平。
对于脂肪垫重量而言，未观察到显著差异。
对于肉片重量(胸肉重量)而言，在相比于对照、处理C和E时，处理D和F显著更高，而所有其他处理处在中间。
表29.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的加工产率(％)
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于饲喂不同DFM的肉鸡的加工产率而言，在WOG和脂肪垫产率上，处理组之间未观察到差异。
对于肉片产率(胸肉产率)而言，在相比于对照、处理C和E时，处理F显著更高，而所有其他处理组处在中间。
表30.饲喂不同DFM的雄性肉鸡的死亡率(％)
a,b不同分组的平均值差异显著(P≤0.05)。
对于饲喂不同DFM的肉鸡的死亡率而言，在第0-14天、第15-28天、第29-42天和第0-48天未观察到显著差异。
对于第43-48天而言，在相比于对照、处理B和C时，处理F具有显著更高的死亡率，而所有其他处理处在中间。
在该研究中实验结论是，在该研究中将DFM添加至肉鸡饲粮特别是在连续贯穿试验的7.35×104的包含水平上在某种程度上改善了总体肉鸡性能和加工参数。性能参数的显著差异在试验的稍后阶段中出现，而开食期阶段中未观察到差异。
实施例15
在肉鸡的饲粮中直接饲喂微生物(86/300)的生长性能效应
本实施例的目的在于比较35天地面圈试验中用和不用86/300DFM(80％菌株86和20％菌株300)饲喂的肉鸡的性能，用来对肉鸡性能与饲喂杆菌肽MD(BMD)穿梭至维及尼霉素(VM)的抗生素生长促进物(AGP)方案的那些、以及与未接收任何添加剂的那些进行比较。
测试的饲料添加剂如下：具有80％菌株86和20％菌株300DFM菌株的86/300DFM试验材料由Microbial Discovery Group(Franklin,WI)提供。BMD(亚甲基水杨酸杆菌肽)。VM(维及尼霉素)。
对于该研究而言，利用了总共56个圈，其中初始组大小为每个圈30只禽。实验在具有金属屋顶和粘土地面的木材和煤渣砖结构的建筑物中进行。每个研究圈含有1个饮水器和75lb容量饲料管。圈尺寸为4'×5'，这在每个圈存在30只禽时提供每只禽0.67ft2的放养密度。每个圈具有聚合物漏缝地板，所述地板用3mil厚塑料片覆盖，在第0天顶部具有大约3英寸的新的木材锯末。在第7天，每个圈用4磅先前使用的肉鸡来铺顶(top dressed)，所述肉鸡来自没有疾病问题或暴露于直接饲喂微生物的鸡群。提供连续光照。
在研究期间至少每日检查所有圈。
观察包括饲料和水的可用性，以及用于维持所需温度的育雏器控制。
评估了大约2520只孵化直跑肉鸡(Cobb 500遗传学)。在第0天的鸡的初始年龄是一天。
饲粮：使用所有配制与当前工业规格一致的2阶段定制肉鸡饲粮方案，并且位于附录A中。
研究设计：存在4个处理组，其中每个组复制14次，总共56个圈(安置30只小鸡/圈)，如表31中所示。盐霉素60g/吨存在于所有开食期和生长期饲料中。
表31.研究设计
1.BMD在开食期中/VM在生长期中——具有BMD(第1-28天50g/吨)和维及尼霉素(第29-35天20g/吨)的阳性对照。
2.nCON——没有添加饲料级抗生素的阴性对照。
3.86/300连续——与第2组相同+7.35×104CFU/g 86/300DFM连续。
4.86/300仅开食期——与第2组相同+7.35×104CFU/g 86/300DFM在仅开食期(第1至约14天)中。
动物安置：在试验的第一天，在一排台子上设置10堆的3个孵化板条箱，每个板条箱中含有至少100只小鸡。将来自10堆中每一者的三十(30)只小鸡放置于运输板条箱中，将那些30只小鸡分组称重并然后放置于第1圈中。对所有56个圈重复这一过程。剩余小鸡被用来替换在第1天至第7天期间发现的任何生长发育不良或跛足的小鸡。
数据收集：在第0、14、28和35天的圈体重和饲料重量(用于饲料转化率)。在第35天对所有禽单独称重，并且通过表型确定每只禽的性别。记录所有死亡和移除的禽(死亡率)。直至第35天没有从圈中移除饲料以确保所有圈在整个研究期间接受相同水平的营养。各反应变量通过单因素ANOVA评估并通过Tukey HSD Test(Statistix 10，AnalyticalSoftware，Tallahassee,FL)分离平均值。
活禽重量：如表32中所示，所有禽在第14天(按圈)、第28天(按圈)和第35天(按性别、按圈)按圈称重。
表32.活禽重量(lb)
注意：具有不同上标的纵列数据有差异(p≤0.05)。1.针对处理组内的圈，按圈和性别的个体第35天体重用于统计分析。
相比于nCON，BMD/VM、86/300在开食期中或86/300连续的第14天活重/禽(lb)更重(p≤0.05)。86/300仅在开食期中给出比BMD/VM饲粮更重的(p≤0.05)重量。含有86/300(开食期或连续)的处理给出最高体重并且在同一统计分组中。
第28天活重/禽(lb)：86/300仅在开食期中给出比nCON饲粮更重的(p≤0.05)重量。
相比于nCON处理，BMD/VM和86/300仅在开食期中的雄性和雌性组合的第35天活重/禽(lb)平均值更重(p≤0.05)，而86/300连续处理处在中间。这种相同统计模式对雄性体重明显。对于雌性，具有BMD/VM、86/300仅在开食期中或86/300连续的饲粮给出比nCON饲粮更重的(p≤0.05)肉鸡。
饲料转化率：使用以下等式来计算饲料转化率和针对死亡率调整的饲料转化率(表33)：
第0-14、第0-28或第0-35天饲料转化率(未调整)
＝总圈采食量÷总圈活重
第0-35天饲料转化率(针对死亡率调整)
＝总圈采食量÷(总圈活重+死亡率重量)
表33.饲料转化率
注意：具有不同上标的纵列数据有差异(p≤0.05)。
86/300仅开食期或86/300连续的第0-14天饲料转化率(未调整)比nCON更低(p≤0.05)，而BMD/VM处在中间。
第0-28天饲料转化率(未调整)结果无显著差异(p>0.05)。
第0-35天死亡率调整的饲料转化率按照与未调整的饲料转化率所述相同的统计模式。
死亡率(％)：处理组的死亡率(％)结果在表34中显示。
表34.死亡率(％)
注意：具有不同上标的纵列数据有差异(p≤0.05)。
第0-14天死亡率(％)在处理组之间无显著差异(p>0.05)。在第一个2周期间的任何处理中未观察到死亡。
第0-28天死亡率(％)在处理组之间无显著差异(p>0.05)。0-28天的总体平均死亡率％为4.73％。
第0-35天死亡率(％)在处理组之间无显著差异(p>0.05)。0-28天的总体平均死亡率％为5.95％。
胴体产率和胸肉产率(％活重)：占按性别和按组合性别的活重百分比的胴体产率和胸肉产率的结果在表35和表36中显示，表36显示出组合的平均重量和产率百分比。
作为侧点，仔细观察用于加工的所有肉鸡的胸囊肿。所加工禽中的仅一只被发现有囊肿(来自86/300仅开食期组的雌性)，而所有其他肉鸡胸未发现有疤(blemishes)。
表35.胴体产率和胸肉产率(％活重)
注意：具有不同上标的纵列数据有差异(p≤0.05)。
表36.组合的平均胴体产率和胸肉产率
饲喂BMD/VM的肉鸡的胴体产率(％活重)比nCON肉鸡显著(p≤0.05)更大，而其他处理值处在中间。雌性胴体产率结果与组合性别结果在统计上相似。针对雄性胴体产率，处理之间不存在显著差异(p>0.05)。
86/300连续处理组中的禽比nCON禽的组合性别的胸肉产率(％活重)平均值显著更大(p≤0.05)，而其他组处在中间。按单独两性，胸肉产率中未检测到显著差异(p>0.05)。
在具有4个处理和14个重复圈(具有30只小鸡/圈)的该35天圈试验中，实验结论是，DFM补充组86/300仅在开食期中或86/300连续给出在统计上等同于BMD/VM并且比nCON组更大(p≤0.05)的最终体重。因此，在该研究中，BMD/VM或86/300(在开食期或所有阶段中)肉鸡具有最大改善的35天肉鸡体重。未发现对死亡率(％)的显著处理效果。补充有BMD/VM的饲粮具有比nCON饲粮更大(p≤0.05)的占活重百分比的胴体产率，而其他实验饲粮处在中间。对于组合两性而言，DFM产物86/300连续的占活重百分比的胸肉产率比nCON更大(p≤0.05)，而其他处理结果处在中间。
实施例15，附录A：饲料配方
肉鸡开食期(0-21天)
肉鸡生长期(21-35天)
实施例16
酶活性筛选
为了经由二硝基水杨酸(DNS)还原糖测定来证实DFM菌株中半乳甘露聚糖降解酶的存在，该实施例描述了使用平板培养基筛选方法来检测DFM菌株86、101、290和300以及其他相关分离物中的酶活性。
DNS还原糖测定按照制造商的方案来进行，用生长于TSB+0.5％瓜尔胶中的MDG菌株86、101、290和300的过夜培养物来接种0.5％瓜尔胶溶液。利用在37℃下孵育30分钟和18小时之后取出的样品来进行还原糖测定。用1M与1μM之间浓度的D-甘露糖和D-半乳糖溶液来制备标准曲线，用以测定反应的游离还原糖与OD 575之间的关系。由瓜尔胶底物组成的阴性对照样品(NC)仅用缓冲液接种或用无菌培养基(TSB+瓜尔胶)接种。
如图13中所示，在24小时内，芽孢杆菌菌株86、101、290和300显示出在约0.467mmol至约0.720mmol范围内的甘露聚糖酶活性。
实施例17
底物测试总结
在本实施例中，进行DFM菌株的比较来测定底物利用的变化。DFM菌株86、101、290和300单独测试并且用各种菌株组合来测试。例如，二菌株组合包括但不限于如下的菌株1/菌株2组合：86/101；86/290；86/300；101/290；101/300和290/300。三菌株组合包括但不限于如下的菌株1/菌株2/菌株3组合：86/101/290；101/290/300；86/290/300和86/101/300。还测试了所有四种菌株的组合(即，86/101/290/200)。还用菌株评价了不包括芽孢杆菌的阴性对照。
具体而言，进行底物利用测定来确定芽孢杆菌菌株是否在利用亚油酸作为唯一碳源的基本培养基中展现生长。
在进行底物利用测定中，每个微量滴定板孔含有2μl亚油酸和用相应芽孢杆菌菌株或菌株组合接种的200μl基本培养基。底物利用试验在37℃下伴随培养基振荡运行4天。如图14中所示，对于使用亚油酸作为唯一碳源而言，最有效菌株或菌株组合是：86/300；86/101/290；86/101/300；101/290；101/290/300；101/300；以及300。
实施例18
DFM菌株86和300的基因组分析
为了获得菌株文库中所收集的芽孢杆菌菌株86和300的基因组“指纹”，根据制造商的说明书对每种芽孢杆菌菌株进行下一代测序分析。将原始测序数据从头组装到重叠群和共有序列中。使用微生物基因组预测基因，然后接着对新序列进行功能注释。
图15和图16分别显示出DFM菌株86和300的基因组注释。如图15中所示，菌株86包含大约4,055,712bp(即，约4056kb)的基因组序列。DFM菌株300略小，包含约3,957,082bp(即，约3957kb)的基因组序列。因此，图15和图16证明DFM菌株86和300是不同的菌株，各自具有独特DNA指纹。
另外，DFM菌株86和300的测序鉴定了菌株内的许多不同基因。菌株86和300中鉴定的基因包括但不限于抗微生物基因，诸如杆菌溶素、bacilyosin、抗李斯特菌枯草蛋白酶(antlisterial subtilisin)、表面活性肽(sufactin)、羊毛硫地衣抗生素(Lantibioticlichenicidin)、链霉素、乳球菌素、聚酮化合物、制磷脂菌素(plipastatin)和大环内酰亚胺(macrolactin)。测序还鉴定了并入菌株86和300的另外的基因，包括但不限于抗微生物耐受基因，诸如杆菌肽、β-内酰胺、青霉素、红霉素、头孢菌素、林可霉素、四环素、衣霉素、膦胺霉素和磷霉素。测序还鉴定了五种未命名的细菌素、菌株内的遗传冗余、多药物流出转运蛋白和不同的化合物。
实施例19
饲喂不同直接饲喂微生物组合的保育猪的生长性能分析
进行该多实验试验来测定饲喂不同的直接饲喂微生物饲粮组合的保育猪的生长性能。进行一个实验(下方实验1)来评价对保育猪的不同的直接饲喂微生物饲粮处理。关于实验方法和细节的特定参数以及统计程序在下方描述，连同如表38中所示的实验结果。
实验1：
1.遗传学：PIC 337×C29
2.研究动物起始重量：13.9±2.3lb
3.重复：23-26头混合性别猪/圈(6.7ft2/猪放养密度)的12个重复
4.喂料器：3空间干箱喂料器和2个摆动水嘴
5.四(4)个处理
i.非DFM对照
ii.As 1+0.75lb/吨Bs 86/300组合(80/20％)(5.5×104CFU/g)
iii.As 1+1lb/吨Bs 86/300组合(80/20％)(7.35×104CFU/g)
iv.As 1+1lb/吨Bs 86/300组合(50/50％)(7.35×104CFU/g)
6.玉米-SBM-DDGS实验饲粮从断奶至断奶后6周饲喂(表37)
实验程序：
动物的实验分配：在各实验开始时，将猪的混合性别圈按重量分类成基于体重的重复。然后，将来自重复内的圈随机分配至饲粮处理并且立即开始研究。圈保持饲粮处理直至实验周期结束。
日常管理：日常管理按照各农场内的标准操作程序。对猪每日目测检查以确保个体猪符合体况标准和农场标准操作程序的准则。未达到这类准则的猪根据农场标准和主治兽医的建议来进行药物治疗。需要药物治疗连续3天并且未显示改善迹象的任何猪被从实验中立即移除。
活体性能和发病率的测量：在实验分配时和在实验周期中以规则间隔记录总圈重。
周期采食量与圈重周期对应。使用每个圈的圈重、递送的饲料和喂料器中的饲料来计算ADG、ADFI和F/G比率。记录所有发病和死亡事件、连同任何主要健康问题。
统计程序：单独地对每个实验进行统计分析。使用SAS的单变量程序对所有度量进行初始数据分析以来测定分布正态性和界外值(在与总均值相差±>3标准差)。使用SAS的混合程序，利用饲粮的主效应和重复的随机效应，根据随机完全区组设计来分析体重和累积生长速率、采食量和饲料/增重比率。类似地分析系列体重、生长速率、采食量和饲料/增重比率，其中周或周期被包括作为重复测量。使用SAS的NPar1way程序将发病率、死亡率和其他健康相关度量分析为非参数数据。
结果：
实验1结果(参见表38)：
1.在补充MDG Bs 86/300的情况下最终体重和生长速率增加(P<0.05)，其中50/50比例产生最大反应(P<0.01；8％相比于80/20比例的3％)。
2.在饲喂更低剂量86/300的组中饲料/增重比率高出3.4％(饲粮，P＝0.34；1lb/吨对比0.75lb/吨，P<0.05)。
结论：MDG芽孢杆菌菌株86和300以1lb/吨补充至饲粮，增加ADG并且降低F/G。
表37.用于实验#1的动物饲粮
表38.保育猪对实验#11不同浓度和菌株比例下实验枯草杆菌(Bacillussubtilis)菌株组合的饲粮补充的生长性能反应
1数据意指在断奶后第1天开始并且继续至实验结束饲喂实验饲粮的每个圈23-26头混合性别猪的11个重复的平均值。
2实验饲粮基于玉米和SBM，并且在阶段1-4分别中包括0％、7.5％、15％和22.5％的DDGS。在牺牲玉米的情况下，将DFM物料添加至实验饲粮。
3实验经设计具有在保育周期中对猪饲喂1lb/吨86/300(80/20比例)的处理。在该表格中，已将饲喂一般饲粮的处理组合，从而产生各由22个圈组成的处理1和2，以及各由11个圈组成的处理3和4。
4使用一般玉米、大豆粉和DDGS成本、以及$3.75/处理吨的86/300DFM成本来计算饲料成本。超出饲料的利润计算为猪价值($0.80/lb活重)与饲料成本($/猪)之间的差值。

Claims (7)

1.一种饲喂动物的方法，所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合，其中所述芽孢杆菌菌株引起选自以下的效应：改善动物性能、改善动物健康、改善动物环境以及它们的组合。
2.一种控制粪的有害环境效应的方法，所述方法包括以下步骤：向动物施用包含有效量的添加剂的饲料组合物或饮用水，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
3.一种控制粪的有害环境效应的方法，所述方法包括以下步骤：向粪、窝、坑或粪池施加组合物，所述组合物包含有效量的选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)、芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)、具有芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株、具有芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株以及它们的组合；并且控制粪的有害环境效应。
4.一种商业包装，其包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
5.一种用于动物饲料的饲料添加剂，所述饲料添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
6.一种用于动物饮用水的添加剂，所述添加剂包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
7.一种动物饲料组合物，其包含选自以下的分离芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌菌株86(NRRL号B-50944)，芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)，具有芽孢杆菌菌株86 (NRRL号B-50944)的所有鉴定特征的菌株，具有芽孢杆菌菌株300 (NRRL号B-50943)的所有鉴定特征的菌株，以及它们的组合。
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