CN106706901A - 可实现多种致病菌同步检测方法 - Google Patents

可实现多种致病菌同步检测方法 Download PDF

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一种可实现多种致病菌同步检测方法，包括如下步骤：抗体包被微孔板；以HRP标记伴刀豆球蛋白，形成酶标记复合物；向包被有抗体的微孔板中加入待测样本，经反应，洗板、甩干后加入酶标记复合物，温育；洗板温育后，向微孔板中加入底物，测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质光吸收值，根据该吸收值来确定待测抗原含量。上述检测方法中，通过HRP和ConA 交联修饰得到ConA‑HRP复合物，具有酶标记二抗与细菌结合的能力，因此能应用于多种致病菌检测，由于该复合物与细菌的结合位点不同于抗体的结合位点，因此应用于夹心法检测细菌时能提高检测灵敏度。

Description

可实现多种致病菌同步检测方法
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种能应用于不同种类食源性致病菌的可实现多种致病菌同步检测方法。
背景技术
免疫检测是目前生物学检测方法中用途最广泛的一种方法，通常用于疾病诊断，动植物生理活动研究、微生物鉴定、病理研究以及免疫研究等。传统的免疫检测方法有免疫沉淀反应、凝集反应、补体结合实验等。免疫检测通常采用免疫标记，如酶标记、荧光标记、放射性核素等，应用较广泛的是酶标记技术。
目前，虽然人们生活水平得到极大提高，但是食品卫生状态一直处于令人堪忧的境地，为检测各种致病菌，免疫检测技术在食品卫生安全方面彰显其重要性。
例如，夹心法酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。这种ELISA检测体系中的酶标记只能采用对应抗原的酶标记抗体，虽然具有针对性，但是检测的致病菌单一，如涉及到多种致病菌时，需要分别检测，费时费力。
发明内容
有鉴于此，提供一种可实现多种致病菌同步检测方法，其可应用于多种致病菌的同时检测，达到快速检测的目的。
一种可实现多种致病菌同步检测方法，其包括如下步骤：
抗体包被微孔板；
以HRP标记伴刀豆球蛋白，形成酶标记复合物；
向包被有抗体的微孔板中加入待测样本反应，洗板、甩干后加入酶标记复合物，温育；
洗板温育后，向微孔板中加入底物，测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质光吸收值，根据该吸收值来确定待测抗原含量。
上述可实现多种致病菌同步检测方法中，通过HRP和伴刀豆球单白(即ConA)交联修饰得到伴刀豆球单白-HRP复合物，以下简称ConA-HRP复合物，具有酶标记二抗与细菌结合的能力，因此能应用于多种致病菌检测，由于该复合物与细菌的结合位点不同于抗体的结合位点，因此应用于夹心法检测细菌时能提高检测灵敏度。另外由于ConA-HRP复合物能与多种细菌结合，因此能应用于多种致病菌的同时检测，达到快速检测的目的。
附图说明
图1为本发明实施例的可实现多种致病菌同步检测方法原理示意图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。
本发明实施例提供的可实现多种致病菌同步检测方法，其包括如下步骤：
S01：抗体包被微孔板；
S02：以HRP标记伴刀豆球蛋白，形成酶标记复合物；
S03：向包被有抗体的微孔板中加入待测样本反应，洗板、甩干后加入酶标记复合物，温育；
S04：洗板温育后，向微孔板中加入底物，测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质光吸收值，根据该吸收值来确定待测抗原含量。
具体地，所述抗体是细菌免疫制备的单克隆抗体，可来源于山羊、兔或小鼠等动物。抗体是细菌免疫制备的单克隆抗体，其免疫原是食源性致病菌，例如可以是但不限于沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌中的至少一种。所述伴刀豆球蛋白是从刀豆中提取出来的凝集素，所述凝集素是四聚体球蛋白，分子量为102,000，每个亚基（即为四聚体之一）含237个氨基酸残基，每个亚基分子量25,500，结合一个Ca2+和一个Mn2+，每个凝集素含一个糖结合部位。上述方法中，步骤S01和S02无先后顺序。
如图1所示，简略示意出上述方法的检测原理：预先将辣根过氧化酶（HRP）和伴刀豆球单白(ConA)交联修饰得到ConA- HRP复合物（即酶标记复合物），用抗体包被微孔板，洗涤后；加入待检测的抗原，再加入ConA- HRP复合物，利用伴刀豆球单白能与细菌上糖蛋白结合特点，在微孔板上形成能牢固结合的单克隆抗体（Ab）—细菌—ConA-HRP复合物，把多余的未结合上细菌的ConA- HRP复合物洗去后，加入适量的底物如TMB后，HRP把底物分解成有色物质，从而达到检测效果。本发明实施例的检测方法的检测灵敏度可达到102 cfu/mL。
步骤S01具体包括如下过程：取抗体，用磷酸盐缓冲液稀释终浓度5～8 μg /mL，加入到微孔板进行包被，包被体积为100～150 μL/孔，包被条件为4℃，过夜。
步骤S02中，酶标记复合物的形成包括如下步骤：1）将ConA溶液于碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中4℃透析过夜，换液2～3次；2）在避光条件下，制备氧化的HRP溶液；3）将氧化好的HRP溶液加入到所要标记的ConA溶液中，充分混匀，透析交联2-3小时；4）用NaBH4溶液将交联完毕的ConA－HRP溶液还原；5）将还原完毕的ConA -HRP溶液置于pH值为7.2的PBS溶液中，4℃透析18小时以上，然后收获标记好的ConA－HRP溶液，备用。
步骤S03中，向包被有抗体的微孔板中加入待测样本，待测样本即为待测菌液，微孔板具有多个微孔，多个微孔中分别加入对照菌液、待测菌液等，37℃温育60分钟左右，在每孔加入抗ConA -HRP结合物，混匀后，37℃温育60分钟，洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液显色，最后加入硫酸终止反应，判断实验结果。
以下通过多个实验实施例来举例说明上述可实现多种致病菌同步检测方法的具体步骤以及实验结果。
实施例1 基于ConA- HRP复合物实现大肠杆菌O157:H7检测方法
1) 大肠杆菌O157:H7抗体包被板：取抗大肠杆菌O157:H7抗体，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释终浓度5～8 μg /mL，加入到微孔板进行包被，包被体积为100～150 μL/孔。包被条件4℃过夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封闭2h，甩干备用。
2) ConA- HRP复合物的制备：①ConA的处理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中4℃透析过夜，换液2～3次。②辣根过氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步骤均需在避光条件下操作）取0.4ml的超纯水加入HRP管中，充分混匀。 取1ml超纯水加入过碘酸钠（NaIO4）管中，充分混匀。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，边加边混匀，室温暗置反应20分钟。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混匀，室温暗置反应30分钟。③交联：将上述氧化好的HRP溶液加入到所要标记的ConA溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。交联透析液为50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6)缓冲液。④还原：取0.5ml超纯水加入硼氢化钠（NaBH4）管，颠倒数次混匀。将交联完毕的ConA－HRP溶液从透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻轻摇匀一次。⑤透析：将还原完毕的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析过夜（18小时以上）。换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。 ⑥收获标记好的ConA－HRP溶液，备用（可加等量甘油或其他蛋白保护剂）。
3) 取出抗体包被板，阴性对照1孔，阳性对照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待测菌液。阴阳性对照每孔加入50 μL对照菌液，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP结合物。混匀后，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃温育30分钟。 最后加入0.5M硫酸终止反应，判断实验结果。
实施例2 基于ConA- HRP复合物实现霍乱弧菌0139检测方法
1) 霍乱弧菌0139抗体包被板：取抗霍乱弧菌0139抗体，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释终浓度5～8 μg /mL，加入到微孔板进行包被，包被体积为100～150 μL/孔。包被条件4℃过夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封闭2h，甩干备用。
2) ConA- HRP复合物的制备：①ConA的处理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中4℃透析过夜，换液2～3次。②辣根过氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步骤均需在避光条件下操作）取0.4ml的超纯水加入HRP管中，充分混匀。 取1ml超纯水加入过碘酸钠（NaIO4）管中，充分混匀。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，边加边混匀，室温暗置反应20分钟。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混匀，室温暗置反应30分钟。③交联：将上述氧化好的HRP溶液加入到所要标记的ConA溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。交联透析液为50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6)缓冲液。④还原：取0.5ml超纯水加入硼氢化钠（NaBH4）管，颠倒数次混匀。将交联完毕的ConA－HRP溶液从透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻轻摇匀一次。⑤透析：将还原完毕的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析过夜（18小时以上）。换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。 ⑥收获标记好的ConA－HRP溶液，备用（可加等量甘油或其他蛋白保护剂）。
3) 取出抗体包被板，阴性对照1孔，阳性对照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待测菌液。阴阳性对照每孔加入50 μL对照菌液，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP结合物。混匀后，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃温育30分钟。 最后加入0.5M硫酸终止反应，判断实验结果。
实施例3 基于ConA- HRP复合物实现沙门式菌检测方法
1) 沙门式菌抗体包被板：取抗沙门式菌抗体，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释终浓度5～8 μg /mL，加入到微孔板进行包被，包被体积为100～150 μL/孔。包被条件4℃过夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封闭2h，甩干备用。
2) ConA- HRP复合物的制备：①ConA的处理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中4℃透析过夜，换液2～3次。②辣根过氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步骤均需在避光条件下操作）取0.4ml的超纯水加入HRP管中，充分混匀。 取1ml超纯水加入过碘酸钠（NaIO4）管中，充分混匀。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，边加边混匀，室温暗置反应20分钟。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混匀，室温暗置反应30分钟。③交联：将上述氧化好的HRP溶液加入到所要标记的ConA溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。交联透析液为50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6)缓冲液。④还原：取0.5ml超纯水加入硼氢化钠（NaBH4）管，颠倒数次混匀。将交联完毕的ConA－HRP溶液从透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻轻摇匀一次。⑤透析：将还原完毕的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析过夜（18小时以上）。换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。 ⑥收获标记好的ConA－HRP溶液，备用（可加等量甘油或其他蛋白保护剂）。
3) 取出抗体包被板，阴性对照1孔，阳性对照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待测菌液。阴阳性对照每孔加入50 μL对照菌液，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP结合物。混匀后，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃温育30分钟。 最后加入0.5M硫酸终止反应，判断实验结果。
实施例4 基于ConA- HRP复合物实现大肠杆菌O157:H7和沙门式菌检测方法
1) 大肠杆菌O157:H7和沙门式菌抗体包被板：取抗大肠杆菌O157:H7和沙门式菌抗体，用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释终浓度5～8 μg /mL，加入到微孔板进行包被，包被体积为100～150 μL/孔。包被条件4℃过夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封闭2h，甩干备用。
2) ConA- HRP复合物的制备：①ConA的处理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中4℃透析过夜，换液2～3次。②辣根过氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步骤均需在避光条件下操作）取0.4ml的超纯水加入HRP管中，充分混匀。 取1ml超纯水加入过碘酸钠（NaIO4）管中，充分混匀。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，边加边混匀，室温暗置反应20分钟。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混匀，室温暗置反应30分钟。③交联：将上述氧化好的HRP溶液加入到所要标记的ConA溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。交联透析液为50mM 碳酸盐缓冲液 (pH 9.6)缓冲液。④还原：取0.5ml超纯水加入硼氢化钠（NaBH4）管，颠倒数次混匀。将交联完毕的ConA－HRP溶液从透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻轻摇匀一次。⑤透析：将还原完毕的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析过夜（18小时以上）。换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。 ⑥收获标记好的ConA－HRP溶液，备用（可加等量甘油或其他蛋白保护剂）。
3) 取出抗体包被板，阴性对照1孔，阳性对照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待测菌液。阴阳性对照每孔加入50 μL对照菌液，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP结合物。混匀后，37℃温育60分钟。用稀释好的洗涤液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃温育30分钟。 最后加入0.5M硫酸终止反应，判断实验结果。
使用上述实施例所述方法检测大肠杆菌O157：H7、沙门式菌和霍乱弧菌0139与传统ELISA法检测的结果进行对比，结果见表1。由表1结果可知：本发明实施例方法的检测灵敏度达到102 cfu/mL，而传统的ELISA试剂盒检测常见的致病菌的灵敏度则为103~4 cfu/mL，可见，本发明实施例方法的检测灵敏度远远高于传统的检测方法。
表1 各实施例方法与传统ELISA法检测致病菌参数对比。
需要说明的是，本发明并不局限于上述实施方式，根据本发明的创造精神，本领域技术人员还可以做出其他变化，这些依据本发明的创造精神所做的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (9)

1.一种可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
抗体包被微孔板；
以HRP标记伴刀豆球蛋白，形成酶标记复合物；
向包被有抗体的微孔板中加入待测样本反应，洗板、甩干后加入酶标记复合物，温育；
洗板温育后，向微孔板中加入底物，测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质光吸收值，根据该光吸收值来确定待测抗原含量。
2.如权利要求1所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述抗体是细菌免疫制备的单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述单克隆抗体是来源于山羊、兔或小鼠。
4.如权利要求1所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述抗体是细菌免疫制备的单克隆抗体，其免疫原是食源性致病菌。
5.如权利要求4所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述食源性致病菌是沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌中的至少一种。
6.如权利要求1所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述伴刀豆球单白是从刀豆中提取出来的凝集素，所述凝集素是四聚体球蛋白，分子量为102,000，每个亚基含237个氨基酸残基，每个亚基分子量25,500，结合一个Ca2+和一个Mn2+，每个凝集素含一个糖结合部位。
7.如权利要求1所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为102 cfu/mL。
8.如权利要求1所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述抗体包被微孔板步骤包括如下过程：取抗体，用磷酸盐缓冲液稀释终浓度5～8 μg /mL，加入到微孔板进行包被，包被体积为100～150 μL/孔，包被条件为4℃，过夜。
9.如权利要求1所述的可实现多种致病菌同步检测方法，其特征在于，所述酶标记复合物的形成包括如下步骤：1）将伴刀豆球蛋白溶液于pH 值为9.6的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜，换液2～3次；2）在避光条件下，制备氧化的HRP溶液；3）将氧化好的HRP溶液加入到所要标记的伴刀豆球蛋白ConA溶液中，充分混匀，透析交联2-3小时；4）用NaBH4溶液将交联完毕的伴刀豆球蛋白－HRP溶液还原；5）将还原完毕的伴刀豆球蛋白-HRP溶液置于pH值为7.2的PBS溶液中，4℃透析18小时以上，然后收获标记好的伴刀豆球蛋白ConA-HRP溶液，备用。
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