CN106692966A - 动物疫苗用佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物疫苗用佐剂及其制备方法和应用。该动物疫苗用佐剂包括以下体积分数的原料组分：低密度矿物油为75％～90％，辛癸酸甘油酯和司盘‑80为1％～10％，甘油和聚甘油异硬脂酸酯为0.5％～5％，聚乙二醇‑12‑羟基硬脂酸酯‑15、吐温‑80和丙二醇为1％～10％，其中，吐温‑80为0～5％。制备方法包括量取低密度矿物油，加入辛癸酸甘油酯和司盘‑80、甘油和聚甘油异硬脂酸酯、聚乙二醇‑12‑羟基硬脂酸酯‑15、吐温‑80和丙二醇，混合并静置后即得。本发明的佐剂兼具安全性、稳定性、自乳化性，乳化过程中对温度的敏感性低、能形成水包油包水型空间结构，可广泛用于制备动物疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物制品类动物疫苗领域，具体涉及一种动物疫苗用佐剂及其制备方法和应用。
背景技术
目前，绝大多数动物疫苗的两种基本组成成分为抗原和佐剂。佐剂如同药物的胶囊，能起到保护疫苗，并使疫苗缓慢释放的作用。自乳化、二步乳化、多步乳化将决定疫苗生产工艺的难度及影响疫苗的生物学活性。油包水型(W/O)、水包油型(O/W)和水包油包水型(W/O/W)会决定动物免疫应答的快慢和疫苗保护时间的长短，其中“水”是指抗原，“油”是指佐剂，不同的类型是指油和水包裹的空间结构的区别，水包油包水型是综合性能最优秀的。但是水包油包水型佐剂是佐剂的技术难点，经过文献和专利检索，现已有水包油包水型佐剂专利(有的称双相佐剂或W/O/W佐剂)，如公开号为201310619292.2的中国专利文献《兽用疫苗用双相油乳佐剂及其制作方法》，是使用矿物油(注射级/医用级)和乳化剂(也称表面活性剂)进行配制，佐剂再与抗原混合在一起进行乳化，乳化完得到水包油包水型疫苗。但都存在一定的缺点，具体阐述如下：
1、安全性：因为佐剂是要注射到动物体内的，佐剂构成成分的生物安全性是其最基础属性，例如矿物油以直链烷烃为主但含有芳香烃和环烷烃，芳香烃和环烷烃容易造成动物毒副反应；乳化剂吐温-80存在多种脂肪酸残基的混入，过多的脂肪酸残基发生过氧化反应后会生成有毒成分，造成动物溶血性、过敏和休克，佐剂产生的毒副反应将会超过产品本身带来的益处。
2、稳定性：油和水本身不能互溶，水包油包水型本身为热力学不稳定型，佐剂与抗原配置成疫苗后需要冷藏、运输和解冻，佐剂与抗原的油水界面膜极易破裂，破裂后佐剂对抗原的保护和缓释效果将受到影响，所以稳定性也是佐剂性能的重要体现。其次在水包油包水型佐剂与抗原配制过程中也是不稳定的，出于生物安全考虑，佐剂所用的乳化剂为非离子型，乳化剂的HLB值(亲水亲油平衡值)是形成水包油包水型的关键之一，非离子型乳化剂的HLB值会随温度变化，温度不适合，水包油包水型会不稳定，将会变成油包水型或水包油型，而与此同时温度也会影响抗原的生物学活性，所以温度成为了水包油包水型疫苗生产工艺和生产设备的难点，选择合适的乳化剂以降低乳化剂HLB值对温度的敏感性是解决问题的捷径，而现有的水包油包水都没有提出降低乳化剂HLB值对温度的敏感性的方案。
3、易配制性：水包油包水型佐剂与抗原的配制进行两步或两步以上的乳化，会带来乳化工艺繁琐度和增加乳化工艺时间，而这都会影响疫苗的生物学活性。
综上可知，寻求新型的兼具安全性、稳定性和易配制性的动物疫苗用佐剂成为了当务之急。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种兼具安全性、稳定性、自乳化性、乳化过程对温度的敏感性低、且能形成水包油包水型空间结构的动物疫苗用佐剂及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种动物疫苗用佐剂(命名为GR208佐剂)，所述动物疫苗用佐剂包括以下体积分数的原料组分：
上述的动物疫苗用佐剂中，优选的，所述动物疫苗用佐剂中，按体积分数计：
所述辛癸酸甘油酯为0.5％～5％，所述司盘-80为0.5％～8％；
所述甘油为0.1％～4.9％，所述聚甘油异硬脂酸酯为0.1％～4.9％；
所述聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15为0.1％～5％，所述丙二醇为0.1％～5％。
更优选的，所述辛癸酸甘油酯为0.5％～3％，所述司盘-80为0.5％～7％；所述甘油为0.1％～3％，所述聚甘油异硬脂酸酯为0.1％～2％。
上述的动物疫苗用佐剂中，优选的，所述动物疫苗用佐剂中，按体积分数计：
所述辛癸酸甘油酯为0.5％～3％，所述司盘-80为0.5％～7％；
所述甘油为0.25％～2.5％，所述聚甘油异硬脂酸酯为0.25％～2.5％；
所述聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15为0.5％～2％，吐温-80为0％～4％，丙二醇为0.5％～4％。
上述的动物疫苗用佐剂中，优选的，所述动物疫苗用佐剂中，所述低密度矿物油在15℃下的密度为0.83kg/L～0.85kg/L；所述低密度矿物油为低密度医用级矿物油。
上述的动物疫苗用佐剂中，优选的，所述聚甘油异硬脂酸酯包括聚甘油单异硬脂酸酯、聚甘油二异硬脂酸酯、聚甘油三异硬脂酸酯中的一种或多种。
上述的动物疫苗用佐剂中，优选的，所述吐温-80的纯度不低于99％。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的动物疫苗用佐剂的制备方法，包括以下步骤：
按照所述原料组分的体积分数，先量取低密度矿物油，然后向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，再加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，最后加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80和丙二醇，混合均匀后，静置，待所得混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂；
或者，按照所述原料组分的体积分数，先量取低密度矿物油，然后向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，再加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80和丙二醇，最后加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，混合均匀后，静置，待所得混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂。
上述的制备方法中，优选的，所述制备方法的整个过程中，控制溶液温度不超过30℃，且每次添加原料组分后均需混合均匀。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的动物疫苗用佐剂或者上述的制备方法制得的动物疫苗用佐剂在制备动物疫苗中的应用。
本发明中，吐温-80即为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，司盘-80即为失水山梨醇油酸酯。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明的佐剂为水包油包水型佐剂，具有独特的均匀缓释效果，能减少因异体蛋白给动物带来的过敏反应，还能为动物提供快速的免疫应答、整齐的免疫效价及长期的免疫保护，有效降低了对动物的毒副反应，且不会影响动物的正常发育。
2、本发明的佐剂采用低密度医用级矿物油(温度15℃下，密度为0.83kg/L～0.85kg/L)，医用级矿物油绝大多数为高压加氢法，油密度低，芳香烃和环烷烃很少，对动物毒害低，其黏度低，动物注射部位形成肉肿块的可能性低。本发明采用高纯度的吐温-80(纯度不低于99％)，纯度越高的吐温-80，其游离脂肪酸越少，动物毒副反应越低。本发明佐剂的乳化剂成分选择使用辛癸酸甘油酯、甘油、聚甘油异硬脂酸酯、丙二醇、司盘-80、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80。乳化剂种类的选择对安全性和水包油包水体系的稳定性至关重要，辛癸酸甘油酯和聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15的复配能对吐温-80进行替代，在兼顾产品成本的同时尽量降低吐温-80的使用量，对于猪和犬等对吐温-80毒副作用非常敏感的动物可以不用吐温-80；甘油、聚甘油异硬脂酸酯、辛癸酸甘油酯的组合因为分子结构相近而分子量不同，乳化性能更高，乳化体系越稳定，能降低HLB值对温度的敏感性；甘油和丙二醇小分子醇类能增加界面膜的强度，可在一定程度上克服热力学不稳定的缺陷；辛癸酸甘油酯、甘油、聚甘油异硬脂酸酯及聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15的复配组合能提高佐剂的乳化性能，使佐剂在多种温度下与抗原自发形成水包油包水型疫苗。因此，本发明的佐剂中乳化剂的组合兼顾了佐剂安全性、佐剂稳定性、佐剂对温度的敏感性、佐剂的自乳化性且能形成水包油包水型空间结构。
3、本发明佐剂的制备方法简单方便、成本低廉，并且能够有效保护抗原活性：将抗原加入本发明的佐剂后，能自发乳化成乳液(无需白油、表面活性剂和抗原分别多步添加或过程中需要生成半成品)，即一步乳化，如性能和存储另有要求，可以按需增加分散工艺(选择不同的搅拌方式或均质方式)，整个加工时间缩短，加工方式简单便捷，降低了生产成本。同时佐剂HLB值对温度敏感性低，生产工艺对温度无严苛要求，可以降低能耗。耗时短和低强度的生产过程使得抗原活性得到保护。
4、本发明的佐剂可制成水包油包水型疫苗，使用了本发明佐剂的水包油包水型疫苗能够获得更长的储存期和更远的运输距离，抗原能得到更好的保护和更长缓释效果。并且，本发明的佐剂使得水包油包水型疫苗的配制更易实现，生产成本更低，疫苗配制过程中抗原生物活性受到影响更小，疫苗的免疫效果更好。
附图说明
图1为对比例1中仔猪接种GR208佐剂(由实施例1制备)和进口206佐剂口蹄疫灭活疫苗后体温变化图。
图2为对比例2中GR208佐剂苗(由实施例1制备)与传统佐剂苗的免疫效果比较图。
图3为对比例4中GR208佐剂苗(由实施例2制备)与传统佐剂苗的免疫效果比较图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中，除非另有指明，所述的百分比均为按总体积比计，加工方式为锚式搅拌桨搅拌(50～100转/分钟)，所采用的材料和仪器均为市售。
一种本发明的动物疫苗用佐剂(GR208)，包括以下体积分数的原料组分：
动物疫苗用佐剂中，优选的，按体积分数计：
辛癸酸甘油酯为0.5％～5％，司盘-80为0.5％～8％；
甘油为0.1％～4.9％，聚甘油异硬脂酸酯为0.1％～4.9％；
聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15为0.1％～5％，丙二醇为0.1％～5％。
更优选的，辛癸酸甘油酯为0.5％～3％，司盘-80为0.5％～7％；甘油为0.1％～3％，聚甘油异硬脂酸酯为0.1％～2％。
动物疫苗用佐剂中，还可优选的，按体积分数计：
辛癸酸甘油酯为0.5％～3％，司盘-80为0.5％～7％；
甘油为0.25％～2.5％，聚甘油异硬脂酸酯为0.25％～2.5％；
聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15为0.5％～2％，吐温-80为0％～4％，丙二醇为0.5％～4％。
动物疫苗用佐剂中，低密度矿物油在15℃下的密度为0.83kg/L～0.85kg/L；低密度矿物油为低密度医用级矿物油。
聚甘油异硬脂酸酯包括聚甘油单异硬脂酸酯、聚甘油二异硬脂酸酯、聚甘油三异硬脂酸酯中的一种或多种。
吐温-80的纯度不低于99％。
一种上述的动物疫苗用佐剂的制备方法，包括以下步骤：
按照原料组分的体积分数，先量取低密度矿物油，然后向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，再加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，最后加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80(可以为0)和丙二醇，混合均匀后，静置，待所得混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂；
或者，按照原料组分的体积分数，先量取低密度矿物油，然后向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，再加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80(可以为0)和丙二醇，最后加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，混合均匀后，静置，待所得混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂。
上述制备方法的整个过程中，控制溶液温度不超过30℃，且每次添加原料组分后均需混合均匀。
上述的动物疫苗用佐剂可广泛用于制备动物疫苗。
实施例1：
一种本发明的动物疫苗用佐剂(GR208佐剂)，包括以下体积分数的原料：
本实施例中，辛癸酸甘油酯的体积分数为1％，司盘-80的体积分数为6％。
本实施例中，甘油的体积分数为1％，聚甘油异硬脂酸酯的体积分数为1％。
本实施例中，聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15的体积分数为1％，吐温-80的体积分数为3％，丙二醇的体积分数为3％。
本实施例中，低密度矿物油具体为低密度医用级矿物油，在15℃下的密度为0.834kg/L。
本实施例中，聚甘油异硬脂酸酯具体为聚甘油二异硬脂酸酯。
本实施例中，吐温-80的纯度为99％。
一种上述本实施例的动物疫苗用佐剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按上述原料的体积分数，先量取低密度矿物油；
(2)向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，混合均匀；
(3)加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，混合均匀；
(4)加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80和丙二醇，混合均匀；
(5)静置，待混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂。
以上的制备过程中，各步骤的温度均控制在不超过30℃，得到动物疫苗用佐剂后，也要使其温度保持在不超过30℃。
上述的制备方法中，调换步骤(3)和步骤(4)的顺序，也可实施。
一种上述本实施例的佐剂在制备动物疫苗中的应用，制备1000g疫苗，采用常规一步法配制，疫苗成分如表1所示：
表1 GR208佐剂配制疫苗成分表
| 成分 | 含量(g) |
| GR208 | 500 |
| 水相抗原介质 | 500 |
混合前，将每相均加热至30℃，将水相抗原介质(口蹄疫抗原，也可采用安慰抗原介质MEM细胞培养液)混入GR208佐剂中，经过低剪切力(2000rpm～5000rpm均可)的搅拌，获得稳定的疫苗乳剂(维持温度在30℃)。
该疫苗还可采用自乳化法、搅拌法、均质机均质法、高压喷射均质法等制备，即将抗原于25～30℃加入佐剂中自发形成水包油包水型疫苗。
经检验，由上述本实施例制备的GR208佐剂乳化的疫苗具有如表2～4所示的相关特性：
表2 GR208佐剂乳化的疫苗的稳定性和乳化条件
表3 GR208佐剂乳化的疫苗的相关特性(使用安慰抗原介质MEM细胞培养液)
表4 上海食品药品检验所GR208佐剂乳化的疫苗安全性试验
由上述检验可知，本实施例制备的GR208佐剂及其与抗原配制的疫苗具有以下优点：
免疫反应：GR208佐剂可通过诱导短期和长期的免疫反应以提高疫苗的效果，能诱导体液和细胞免疫反应，可用于病毒、细菌、支原体或寄生虫抗原。
强度：GR208配置的疫苗粘度低，低于4秒，符合2010版兽药典收录标准，易于注射(粘度检测方法为：用1ml吸管，下口径1.2mm，上口径2.7mm，吸取25摄氏度左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间)，尤其适用于获得短期和长期的保护。这类即开即用的佐剂可以使用传统的低剪切力的乳化机(最佳设备是高压均质机)通过一步法制备稳定的液体疫苗。该佐剂可广泛用于猪和牛的口蹄疫疫苗，还能用于提高活疫苗的效果。
适用动物种类：GR208佐剂适用各种兽类(如猪、牛及小反刍动物)疫苗，能有效提高病毒苗、菌苗和寄生虫苗等的免疫活性。
安全性：对GR208佐剂进行的毒理学试验(Berlin试验，口服LD50，IP LD50，眼部刺激试验，皮肤刺激试验，致热源性等)证实这类佐剂无毒且具有良好的相容性。
对比例1：
对16-18kg的仔猪分别接种实施例1制备的GR208佐剂乳化的口蹄疫灭活疫苗和进口206佐剂乳化的口蹄疫灭活疫苗，定时监测仔猪体温、精神和进食情况。注射前，猪只体温、精神和食欲均正常，注射后的试验结果如图1所示。试验结果表明：注射4倍剂量后，本实施例的GR208佐剂和进口206佐剂乳化的口蹄疫疫苗均未引起仔猪体温剧烈变化，仔猪精神和进食也能很快恢复，对免疫猪影响较小。
对比例2：
将本发明实施例1制备的GR208佐剂苗(即GR208佐剂与抗原构成的疫苗)与传统油包水佐剂苗(具体为不完全弗氏佐剂与抗原构成的疫苗)的免疫效果进行比较，试验结果如图2所示。由图2可知，本发明的GR208佐剂苗免疫后更早诱导抗体产生，效价更整齐。由此说明本发明的佐剂具有免疫应答快、免疫持续期长、免疫效价高且整齐的特点，可同时诱导体液和细胞免疫应答。
实施例2：
一种本发明的动物疫苗用佐剂，包括以下体积分数的原料：
本实施例中，辛癸酸甘油酯的体积分数为2％，司盘-80的体积分数为6％。
本实施例中，甘油的体积分数为2.5％，聚甘油异硬脂酸酯的体积分数为0.5％。
本实施例中，聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15的体积分数为4％，丙二醇的体积分数为3％。
本实施例中，低密度矿物油具体为低密度医用级矿物油，在15℃下的密度为0.84kg/L。
本实施例中，聚甘油异硬脂酸酯具体为聚甘油三异硬脂酸酯。
一种上述本实施例的动物疫苗用佐剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按上述原料的体积分数，先量取低密度矿物油；
(2)向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，混合均匀；
(3)加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，混合均匀；
(4)加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15和丙二醇，混合均匀；
(5)静置，待混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂。
以上的制备过程中，各步骤的温度均控制在不超过30℃，得到动物疫苗用佐剂后，也要使其温度保持在不超过30℃。
对比例3
将传统油包水佐剂苗(不完全弗氏佐剂与抗原构成的疫苗)、实施例2制备的GR208佐剂苗(GR208佐剂与抗原构成的疫苗)、空白对照(只含抗原)的安全性进行比较，试验结果表5所示。
表5 实施例2的GR208佐剂苗与传统油包水佐剂苗的安全性比较
注：1.家兔，注射1.5ml/只，注射后观察60天。
2.(-)局部无异常，(+)有未吸收的油苗，(++)有轻度结节，(+++)有明显结节。
对比例4
将实施例2制备的GR208佐剂苗与传统油包水佐剂苗(不完全弗氏佐剂苗)的免疫效果进行比较，试验结果如图3所示。由图3可知，本发明的GR208佐剂苗免疫后更早诱导抗体产生，效价更整齐。由此说明本发明的佐剂具有免疫应答快、免疫持续期长、免疫效价高且整齐的特点，可同时诱导体液和细胞免疫应答。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种动物疫苗用佐剂，其特征在于，所述动物疫苗用佐剂包括以下体积分数的原料组分：
其中，所述吐温-80为0～5％。
2.根据权利要求1所述的动物疫苗用佐剂，其特征在于，所述动物疫苗用佐剂中，按体积分数计：
所述辛癸酸甘油酯为0.5％～5％，所述司盘-80为0.5％～8％；
所述甘油为0.1％～4.9％，所述聚甘油异硬脂酸酯为0.1％～4.9％；
所述聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15为0.1％～5％，所述丙二醇为0.1％～5％。
3.根据权利要求2所述的动物疫苗用佐剂，其特征在于，所述辛癸酸甘油酯为0.5％～3％，所述司盘-80为0.5％～7％；所述甘油为0.1％～3％，所述聚甘油异硬脂酸酯为0.1％～2％。
4.根据权利要求1所述的动物疫苗用佐剂，其特征在于，所述动物疫苗用佐剂中，按体积分数计：
所述辛癸酸甘油酯为0.5％～3％，所述司盘-80为0.5％～7％；
所述甘油为0.25％～2.5％，所述聚甘油异硬脂酸酯为0.25％～2.5％；
所述聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15为0.5％～2％，吐温-80为0％～4％，丙二醇为0.5％～4％。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的动物疫苗用佐剂，其特征在于，所述动物疫苗用佐剂中，所述低密度矿物油在15℃下的密度为0.83kg/L～0.85kg/L；所述低密度矿物油为低密度医用级矿物油。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的动物疫苗用佐剂，其特征在于，所述聚甘油异硬脂酸酯包括聚甘油单异硬脂酸酯、聚甘油二异硬脂酸酯、聚甘油三异硬脂酸酯中的一种或多种。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的动物疫苗用佐剂，其特征在于，所述吐温-80的纯度不低于99％。
8.一种如权利要求1～7中任一项所述的动物疫苗用佐剂的制备方法，包括以下步骤：
按照所述原料组分的体积分数，先量取低密度矿物油，然后向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，再加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，最后加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80和丙二醇，混合均匀后，静置，待所得混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂；
或者，按照所述原料组分的体积分数，先量取低密度矿物油，然后向低密度矿物油中加入辛癸酸甘油酯和司盘-80，再加入聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯-15、吐温-80和丙二醇，最后加入甘油和聚甘油异硬脂酸酯，混合均匀后，静置，待所得混合液中无气泡后，密封存储，得到动物疫苗用佐剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的整个过程中，控制溶液温度不超过30℃，且每次添加原料组分后均需混合均匀。
10.一种如权利要求1～7中任一项所述的动物疫苗用佐剂或者如权利要求8或9所述的制备方法制得的动物疫苗用佐剂在制备动物疫苗中的应用。
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