CN106680412B - 一种奈帕芬胺有关物质的rt-hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种奈帕芬胺有关物质的RT‑HPLC检测方法。本发明公开了奈帕芬胺的相关8个杂质同时分离的分析方法：配置分析溶液；使用反相色谱柱，以酸铵盐溶液‑有机相的混合液为流动相，采用梯度洗脱方法；将配置好的分析溶液上机测定。本发明分析方法能够有效且准确的测定奈帕芬胺中各种相关杂质，从而确保产品的质量可控。

Description

一种奈帕芬胺有关物质的RT-HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种奈帕芬胺及其降解杂质和工艺杂质的反向高效液相色谱检测方法。

背景技术

奈帕芬胺，化学名为2-氨基-3-苯甲酰基苯基乙酰胺，其结构式如下：

奈帕芬胺(Nepafenac)是一种新型眼用非甾体类解热镇痛抗炎药(NSAIDs)。用于眼内炎症的治疗。目前研究结果表明Nepafenac效果优于传统NSAIDs且安全性良好。2005年8月19日，美国食品与药物管理局(FDA)允许其眼用混悬液(商品名为Nevanac，Alton公司)应用于临床，使其成为FDA批准的首个眼科用非激素类抗炎前体药物。

Nepafenac经眼部给药后，可迅速穿过角膜，并在眼组织水解酶的作用下转化为氨芬酸，迅速到达靶位点发挥作用。而氨芬酸又通过抑制前列腺素H合成酶(环氧化酶)，阻断前列腺素的合成，来发挥其抗炎止痛的作用。NSAIDs经眼部给药后，可抑制前列腺素在虹膜、睫状体和结膜的合成，因此可预防眼部炎症的发生，减少相关的疼痛。与传统NSAIDs相比，Nepafenac具有渗透力强、靶向作用强、毒副作用小等优点。

在药物分析中所称的“有关物质(related substances)”是指在原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质，也可能是制剂在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。有关物质的种类与药物的合成路线和制剂工艺密切相关，药物在合成和制剂过程中的任何一个因素的改变都可能导致其有关物质的种类不同，因而有关物质的检测和控制过程相对复杂。有关物质的检测是控制药品质量的重要指标。

在奈帕芬胺原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等杂质，确定相关杂质谱：杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I(见表1)。

表1奈帕芬胺各杂质名称及结构

现有文献中为见能够分离上述8种杂质的分析方法，本发明提供一种能够分离上述杂质和奈帕芬胺的分析方法。

发明内容

本发明提供一种高灵敏度的检测方法，解决将奈帕芬胺特征峰与降解杂质、较多的合成中间体及工艺杂质特征峰分离的问题。

本发明技术方案如下：

奈帕芬胺的有关物质杂质的RT-HPLC检测方法，包括下列步骤：

a)配置分析溶液

用甲醇、乙腈单一溶剂或甲醇-水、乙腈-水混合溶液溶解样品，制成分析溶液；

b)色谱条件

色谱柱为反相色谱柱，所述反相色谱柱选自苯基硅烷键合硅胶色谱柱、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

以酸铵盐溶液-有机相的混合液为流动相，流动相pH范围5～8，所述的有机相为甲醇或乙腈；采用梯度洗脱方法，流速为0.8-1.3ml/min；柱温为25-50℃，检测波长为205-300nm；运行时间40-70min；

c)上机测定

取步骤a)制成的分析溶液5-40μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。

在一些实施例中，所述反相色谱柱的填充剂为苯基硅烷键合硅胶色谱柱或十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述反相色谱柱的规格为：柱长介于100mm至300mm，色谱柱内径介于1mm至10mm，粒径介于1μm至10μm，优选为Agilent ZORBAX C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述酸铵盐溶液的浓度为0.001-0.05mol/L、pH 2.0-7.0，优选酸铵盐溶液的浓度为0.01mol/L、pH 6.5。

在一些实施例中，所述酸铵盐为甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵中之一，优选乙酸铵。

所述酸铵盐溶液-有机相的体积比为90:10-20:80。在一些实施例中，所述酸铵盐溶液-有机相，所述酸铵盐溶液-有机相的体积比为90:10～30:70，优选为70:30～30:70。

所述步骤b为所述反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述流动相为乙酸铵溶液与乙腈混合液，乙酸铵溶液0.01mol/L，所述流动相中乙酸铵溶液-乙腈的比例按0、25～30、38～42、48～52、53～57、63～67min时间点，水相体积比为73～77％、73～77％、58～62％、13～16％、13～16％、73～77％、进行梯度洗脱。。

所述样品为奈帕芬胺原料药或其制剂，所述制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、眼用制剂、鼻用制剂、栓剂、丸剂、软膏剂乳膏剂、糊剂、吸入制剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、糖浆剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、酊剂、贴剂、口服溶液剂、植入剂、膜剂、洗剂、冲洗剂、煎膏剂、膏药、露剂、茶剂。

有益效果：

本发明能够有效的测定奈帕芬胺溶液中各种相关杂质的存在，尤其实现了谱图中奈帕芬胺特征峰与奈帕芬胺降解杂质特征峰及其相关中间体、工艺杂质特征峰的分离。同时本发明的方法还可用于奈帕芬胺制剂的有关物质检测。

本发明的分析方法各杂质的分离度都大于1.5，不对称因子都在1.9-1.2范围内，达到准确有效分离目的。上述方法的检测可以确保产品的质量可控。

附图说明

图1实施例1方法梯度洗脱的色谱图；

(注：图中1‐10分别为杂质A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)

图2实施例1方法梯度洗脱的色谱图；

(注：图中1‐10分别为杂质A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)

图3实施例1方法梯度洗涤的色谱图；

(注：图中1‐10分别为杂质A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)

图4实施例1方法梯度洗涤的色谱图；

(注：图中1‐10分别为杂质A、B、C、奈帕芬胺、D、E、F、G、H、I)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：u3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Syncronis C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱

配置0.01mol/L乙酸铵溶液、稀氨水调节pH至3.5为水相，流动相中水相-乙腈的比例按0、26、35、40、47、50、60min时间点，水相体积比为72％、72％、55％、15％、75％、75％，设置流速为1.0ml/min，检测波长为240nm，柱温50℃。

(2)实验步骤

分别取奈帕芬胺、杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I适量，用乙腈-乙酸铵水溶液(80:20)溶解并稀释成每1ml中约含奈帕芬胺及各杂质10μg的混合溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1，杂质和奈帕芬胺基本可以分离开，但该条件下杂质B峰形较差，不对称性因子较大0.7，一般而言不对称性因子在0.9-1.2范围内较为理想。杂质E、F、G未能实现基线完全分离。综上，该方法需进行调整优化。

实施例2

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：u3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Syncronis C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置0.01mol/L乙酸铵溶液、稀氨水调节pH至6.8为水相，流动相中水相-乙腈的比例按0、25、50、53、65min时间点，水相体积比为78％、78％、20％、78％、78％进行梯度洗脱，设置流速为1.3ml/min，检测波长为240nm，柱温40℃。

(2)实验步骤

分别取奈帕芬胺、杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I适量，用乙腈-水(70:30)

溶解并稀释成每1ml中约含奈帕芬胺及杂质各20μg的混合溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图2，可以看出该条件下奈帕芬胺主峰和其他杂质峰完全分离。

实施例3

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Agilent ZORBAX C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置0.01mol/L乙酸铵溶液为水相，流动相中水相-乙腈的比例按0、28、50、52、60min时间点，水相体积比为75％、75％、25％、75％、75％进行梯度洗脱，流速1.1ml/min；柱温35℃，检测波长250nm；

(2)实验步骤

分别取奈帕芬胺、杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I适量，用乙腈-水(70:30)溶解并稀释成每1ml中约含奈帕芬胺及杂质各10μg的混合溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图3，可以看出该条件下萘帕芬胺主峰和其他杂质峰完全分离。

实施例4

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站

色谱柱：Phenomenex Luna C₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱

配置甲醇-0.01mol/L乙酸铵溶液pH至6.0(10:90)为水相，流动相中水相-乙腈的比例按0、25、50、53、65min时间点，水相体积比为80％、80％、60％、20％、80％、80％，设置流速为1.0ml/min，检测波长为240nm，柱温50℃。

(2)实验步骤

分别取奈帕芬胺、杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I适量，用甲醇-水(70:30)溶解并稀释成每1ml中约含奈帕芬胺各20μg的混合溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图3，可以看出该条件下奈帕芬胺主峰和其他杂质峰完全分离。

如下表2所示，实施例1的方法分离出来结果，杂质B、F不对称性较差，并且杂质E、F分离度为1.4和1.3，未完全分离。实施例2、3、4分离度和不对称因子都比较好，能够到达有效分离。

表2实施例1-4杂质分离度和不对称因子情况表

Claims (5)

1.奈帕芬胺的有关物质杂质的RT-HPLC检测方法，包括下列步骤：

a)配置分析溶液

用甲醇、乙腈单一溶剂或甲醇-水、乙腈-水混合溶液溶解样品，制成分析溶液；

b)色谱条件

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

以酸铵盐溶液-有机相的混合液为流动相，流动相pH范围5～8，所述酸铵盐溶液为0.01mol/L乙酸铵溶液；所述有机相为乙腈，所述流动相中酸铵盐溶液-有机相比例按照0、25-28、50、52-53、60-65min时间点，水相体积比为75-78％、75-78％、20-25％、75-78％、75-78％，进行梯度洗脱，流速为0.8-1.3ml/min；柱温为25-50℃，检测波长为205-300nm；

上机测定

取步骤a)制成的分析溶液5-40μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图；

所述有关物质为：杂质A的化学结构式为杂质B的化学结构式为杂质C的化学结构式为杂质D的化学结构式为杂质E的化学结构式为杂质F的化学结构式为杂质G的化学结构式为杂质H的化学结构式为杂质I的化学结构式为

2.如权利要求1所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于所述反相色谱柱的规格为：柱长介于100mm至300mm，色谱柱内径介于1mm至10mm，粒径介于1μm至10μm。

3.如权利要求2所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的柱长为250mm，色谱柱内径为4.6mm，粒径为5μm。

4.如权利要求1所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述样品为奈帕芬胺原料药或其制剂。

5.如权利要求4所述的RT-HPLC检测方法，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、丸剂、软膏剂乳膏剂、糊剂、吸入制剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、糖浆剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、酊剂、贴剂、口服溶液剂、植入剂、膜剂、洗剂、冲洗剂、煎膏剂、膏药、露剂、茶剂。