CN106676081B - 一种磷脂酶b及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术体外定向进化获得酶活提高的磷脂酶B突变体，及利用其制备甘油磷脂酰胆碱以及油脂脱胶的方法。得到磷脂酶B突变体PLBM，酶活较野生型磷脂酶B的酶活提高了25％。

Description

一种磷脂酶B及其应用
技术领域：
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术体外定向进化获得酶活提高的磷脂酶B突变体，及利用其制备甘油磷脂酰胆碱以及油脂脱胶的方法。
背景技术：
磷脂酶B(PLB)广泛分布于动植物和微生物中，具有水解酶和溶血磷脂酶-转酰基酶的活性。水解酶的活性可清除磷脂和溶血磷脂中的脂肪酸，转酰基酶活性则将游离脂肪酸转移到溶血磷脂而生成磷脂。
甘油磷脂酰胆碱(L-alpha glycerylphosphorylcholine,L-α-GPC)由胆碱、甘油和磷酸盐组成，是合成乙酰胆碱神经递质的前体。在治疗人体大脑的精神混乱和神经混乱方面具有重要的医药应用价值，如治疗阿尔茨海默氏症、小脑性共济失调、精神分裂症和双相情感障碍等，但是就作为药用原料及相关研究而言需要较高纯度的L-α-GPC。然而遗憾的是天然L-α-GPC的含量较少，故制备纯度高、质量好的甘油磷脂酰胆碱产品具有重要意义。
酶法制备甘油磷脂酰胆碱是指在一定条件下，利用PLB能够水解磷脂Sn-1和Sn-2位脂肪酸酰基的作用催化磷脂酰胆碱反应生成甘油磷脂酰胆碱，该方法相比化学合成具有反应条件温和、副产物少、产品得率高、质量好等优点。
酶法脱胶是油脂精炼过程的第一步，其主要目的是脱除毛油中的胶质。毛油中的胶质指的是磷脂、糖、蛋白质和其他粘液质的混合物，但主要成分是指磷脂，因此脱胶也常被称为脱磷。PLB能将Sn-1和Sn-2位的酯键都水解，生成相应的甘油酰磷脂，与溶血磷脂相比，甘油酰磷脂具有更强的亲水性，通过水合作用可以方便地除去，因此被应用到酶法脱胶中。酶法脱胶因其反应条件温和、适用范围广、精炼得率高、污染物排放少等特点，受到了广泛的关注。
酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。通常手段是利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏、高通量的筛选技术，从而能够在短时间内得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶，与此不同，需要事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，并根据这些因素有的放矢做对其DNA进行改造的是定点突变。其中，易错PCR是指在扩增目的基因的同时，利用Taq酶不具备3’→5’校对功能，同时改变反应体系中Mn2+、Mg2+和各种dNTP的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出连续易错PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的产物作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要的有益突变。因此，具有独有的优势。
毕赤酵母属于单细胞低等真核生物，是表达外源基因比较理想的工具。它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，还因为含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，可用甲醇严格地调控外源基因的表达。另外，培养成本低，产物易分离。所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐。能够对外源蛋白基因进行稳定遗传，且作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型。此外，毕赤酵母细胞表面展示系统不但具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化等优点，而且，经该系统得到的全细胞催化剂可以重复利用从而降低生产成本。
在本发明中，野生型磷脂酶B基因及其突变体基因在毕赤酵母表达系统中表达，得到产高活力磷脂酶B，纯化后应用到油脂脱胶中，并与磷脂酰胆碱反应，催化制备甘油磷脂酰胆碱。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种磷脂酶B突变体，以及利用其制备甘油磷脂酰胆碱及应用到油脂脱胶中的方法，磷脂酶B突变体的酶活比野生型磷脂酶B的酶活提高了25％。
实现本发明目的技术路线概述如下：
通过基本的分子生物学技术手段获得野生型的磷脂酶B基因(SEQ ID NO：1)，之后由易错PCR技术对野生型磷脂酶B基因随机突变，得到突变体基因(SEQ ID NO：3)，构建重组载体，并实现了其在毕赤酵母GS115中的高效表达，得到磷脂酶B突变体。通过发酵、提取等技术获得磷脂酶B突变体，并由磷脂酶B突变体催化磷脂酰胆碱制备甘油磷脂酰胆碱及在油脂脱胶中的应用。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.磷脂酶B突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示磷脂酶B突变体中突变的氨基酸。如Leu25Ala，表示位置25的氨基酸由野生型磷脂酶B的Leu替换成Ala。位置的编号对应于SEQID NO：2中野生型磷脂酶B的氨基酸序列编号。核苷酸的变化同样采用“原始核苷酸位置替换的核苷酸”来表示，位置编号对应SEQ ID NO：1中野生型磷脂酶B的核苷酸序列编号。
在本发明中，plb表示野生型磷脂酶B的基因序列，即原始序列(如SEQ ID NO：1所示)，plbm则表示磷脂酶B突变体的基因序列(如SEQ ID NO：3所示)；PLB表示野生型磷脂酶B(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，PLBM表示磷脂酶B突变体(其氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示)
磷脂酶B 碱基 氨基酸
PLB 第73位为T、第74位为T 第25位为Leu
PLBM 第73位为G、第74位为C 第25位为Ala
所述的磷脂酶B突变体的表达宿主为毕赤酵母GS115，表达载体为pPIC 9K；
所述的磷脂酶B突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115，展示载体为pPIC9K-Flo。
本发明的实验步骤具体如下：
1、通过易错PCR对来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TCCC 31028的野生型磷脂酶B基因进行随机突变，得到磷脂酶B突变体编码基因；
2、分别含有磷脂酶B突变体基因和野生型磷脂酶B基因的毕赤酵母重组菌株及以此制备磷脂酶B的过程包括如下步骤：
(1)将扩增得到的野生型磷脂酶B编码基因plb和易错PCR随机突变获得的磷脂酶B突变体编码基因plbm进行酶切，将得到的plb和plbm基因分别与表达载体pPIC 9K通过连接得到新的重组载体；
(2)将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到的重组菌株经过遗传霉素筛选和磷脂酶B的酶活测定，得到野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体的高产菌株；
(3)之后进行发酵，制备野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体。
3、分别含有plb和plbm的毕赤酵母细胞表面展示重组菌株及以此制备高活力磷脂酶B全细胞催化剂的过程包括如下步骤：
(1)将扩增得到的plb和plbm进行酶切，将得到的plb和plbm分别与毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo通过连接得到新的重组载体；
(2)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶B重组菌株。
(3)将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体全细胞催化剂。
4、利用本发明所述野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体生产甘油磷脂酰胆碱的方法：
每200mg磷脂酰胆碱底物，添加200mg磷脂酶B酶粉或100mg磷脂酶B全细胞催化剂，反应温度20-45℃，反应pH4-8，反应4-16h，随后通过萃取获得甘油磷脂酰胆碱：
(1)将磷脂酰胆碱、CaCl2溶于pH4.0-pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，或pH 5.5–7.0的bis-Tris–HCl缓冲液，或pH 7.0–8.0的Tris–HCl缓冲液中；
(2)加入磷脂酶B，在20到45℃下反应4-24h。
5、利用本发明所述野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体进行油脂脱胶的方法：
(1)将经过酸处理过的植物油调至pH到4.5-6.0；
(2)加入磷脂酶B和一定量的去离子水脱胶1-5h；
(3)将脱胶后的植物油升温至95℃，灭酶10min；
(3)进行胶质分离，得到脱胶油。
附图说明：
图1为本发明野生型磷脂酶B基因的PCR扩增电泳图
其中：M为DNA Marker，1为plb基因；
图2为本发明重组质粒pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pPIC 9K-plb经EcoRI和NotI双酶切；2为pPIC9K-plbm经EcoRI和NotI双酶切。
图3为本发明重组质粒pPIC 9K-Flo-plb和pPIC 9K-Flo-plbm酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pPIC 9K-Flo-plb经过SnaBI和EcoRI双酶切；2为pPIC9K-Flo-plbm经过SnaBI和EcoRI双酶切。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：野生型磷脂酶B基因的获得
1.野生型磷脂酶B基因plb来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TCCC31028，提取其基因组DNA，其中酿酒酵母基因组DNA的提取步骤如下：
(1)从培养菌体的平板上挑取一环菌接种于50mL适当培养基中，30℃，250r/min培养16-18h。
(2)之后取1mL培养液于1.5mL EP管中，12000r/min离心2min，倒上清，用200μL裂解液重悬，加入石英砂，振荡20-30min。
(3)加入裂解液500uL，12000r/min离心5min，取上清。
(4)加入等体积的Tris平衡酚：氯仿＝1：1，混合均匀，12000rpm离心5min，将上清转移到另一EP管中。
(5)反复抽提两次，直至无蛋白层出现，最后再用等体积氯仿抽提一次。
(6)加入等体积的异丙醇沉淀DNA，12000r/min离心5min，弃去上清，用500μL75％乙醇洗涤2次，每次吹打后12000r/min离心5min。
(7)将EP管倒置于滤纸或置于55℃金属浴中，晾干至无酒精味后用TE缓冲液或灭菌水溶解，-20℃保存。
2.设计plb的扩增引物，序列如下：
上游P1(SEQ ID No：5)：5’-CCGGAATTCGCAGATTCGTCGTCCACTAC-3’
下游P2(SEQ ID No：6)：5’-
ATAAGAATGCGGCCGCAATTAGTCCAAATAATGCTGTTATG-3’
PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：
2×LA buffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L) 2μL
上游引物P1(20μmol/L) 5μL
下游引物P2(20μmol/L) 5μL
酿酒酵母基因组DNA 2μL
LA Taq DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
扩增程序的设置为：
a.预变性:95℃5min；
b.变性：95℃30s；
c.退火：75℃45s；
d.延伸：72℃2min；
e.b-d反应30个循环；
f.延伸:72℃10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型磷脂酶B基因的条带，共2064bp(见图1)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到了野生型磷脂酶B基因，即plb。
实施例2：磷脂酶B突变体基因plbm的获得
1.基于易错PCR技术进行随机突变
在易错PCR反应体系中，以P1和P2作为上下游引物，以plb为模板，进行易错PCR，获得plbm.
其扩增的反应条件为：
扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，70℃退火40s，72℃延伸2min，反应30个循环；72℃延伸10min。
2.将磷脂酶B易错PCR产物克隆入表达载体pET28a中，转化大肠杆菌BL21，接种于每孔含200μL LB液体培养基(含30μg/mL的Kan)的96孔细胞培养板中，于37℃条件下200r/min摇床培养，当OD600达到0.6，向每个孔中加入IPTG(终浓度1mmol/L)，在16℃下诱导16h，4℃下4000r/min离心15min后收集菌体，重悬于15mL预冷的pH为5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，用低温超高压连续流动细胞破碎仪破碎细胞，破碎结束后，在4℃下12000r/min离心45min，收集上清液获得粗酶液，随后进行酶活力检测。
3.酶活力检测
(1)磷脂酶B酶活测定原理
在40℃条件下,1,2-bis(heptanoylthio)Glycerophosphocholine被PLB水解释放出的巯基与5.5′-二硫代硝基苯甲酸(5.5-dithio-nitroben-zoic acid,DTNB)结合,产生黄色化合物,在410nm吸光度增加,可据此计算出酶的活力。
(2)磷脂酶B酶活测定方法
①基础液：0.2mol/L，pH＝5.5醋酸-醋酸钠缓冲液90ml，加入20mmol/LCaCl2，5mmol/L DTNB各20ml，充分混匀；
②工作液：5mmol/L1,2-bis(heptanoylthio)Glycerophosphocholine 1ml加基础液15ml，充分混匀；
③对照液：蒸馏水1ml，加基础液15ml，充分混匀。
磷脂酶B的测定步骤：
混匀，40℃温育10min，测410nm波长A值，空白调零。
酶活力计算
磷脂酶B酶活力(U/mL)＝73.5×(A测定孔-A对照孔)
(3)酶活力定义为
以1,2-bis(heptanoylthio)Glycerophosphocholine为底物，在40℃，pH＝5.5的条件下，每分钟产生1nmol游离巯基的酶量定义为一个酶活力单位，记为U/mL。
(4)磷脂酶B酶活的测定
测定原始磷脂酶B和易错PCR产物的酶活，PLBM的酶活比突变前提高了25％。
4.序列测定
测序(北京华大生物工程公司)结果表明，此时扩增得到的包含Leu25Ala的磷脂酶B突变体基因plbm，见序列3。
实施例3：构建毕赤酵母游离表达重组菌
1、野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体表达载体pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm的构建
将plb和plbm分别与毕赤酵母表达载体pPIC 9K经过EcoRI和NotI双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，选择Ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功(见图2)，即得到重组表达载体pPIC9K-plb和pPIC 9K-plbm。
2.构建野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体表达重组菌株
(1)质粒DNA的线性化
在转化毕赤酵母之前，用SalI限制性内切酶对重组表达质粒pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm进行线性化酶切。
(2)线性化质粒pPIC 9K-plb和pPIC 9K-plbm电转至毕赤酵母
①将感受态细胞分别与线性化质粒pPIC 9K-plb和pPIC 9K-plbm加入到1.5mL预冷的离心管中，吹打混匀，随后加入预冷的电转杯中；
②对电转杯冰浴10min，随后电转化；
③电击后，立即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液于电转杯中，并将电转液转移到新的1.5mL离心管中；
④30℃静置培养1-2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200μL涂布在MD培养基上。
(3)阳性转化子的鉴定及磷脂酶B高产菌株的筛选
①涂有电转液的MD平板在30℃培养2-3d；
②挑取转化子，提取酵母基因组，稀释100倍后作为模板进行PCR。另以转入空质粒pPIC 9K的毕赤酵母GS115/pPIC 9K作为对照，确定阳性转化子。
③确定阳性转化子后，先挑取在含不同浓度遗传霉素抗性平板上单菌落比较大的高遗传霉素抗性转化子，随后分别测定挑选出的转化子的磷脂酶B酶活，从而得到磷脂酶B的高产菌株GS115/pPIC 9K-plb和GS115/pPIC 9K-plbm。
实施例4：毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶B重组菌的构建
1.重组质粒pPIC9K-Flo-plb和pPIC9K-Flo-plbm的构建
将扩增得到的plb和plbm分别与毕赤酵母表面展示表达载体pPIC 9K-Flo经过SnaBI和EcoRI双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌JM109感受态中，选择Ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功后(见图3)，即得到重组表达载体pPIC9K-Flo-plb和pPIC9K-Flo-plbm。
2.毕赤酵母重组菌的构建
将测序验证正确的重组表达载体pPIC9K-Flo-plb和pPIC9K-Flo-plbm经SalI线性化后，用电转化法转化毕赤酵母GS115，MD平板筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶B重组菌GS115/pPIC 9K-Flo-plb和GS115/pPIC 9K-Flo-plbm。
实施例5：磷脂酶B在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备
①挑取YPD平板上的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC 9K-plb和GS115/pPIC 9K-plbm接种至50ml的YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；
②以2％的接种量转接至BMGY培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至BMMY培养基；
③继续培养，30℃，250r/min，每隔12h补加250μL甲醇。在培养5天后，离心得上清，即得到磷脂酶B的粗酶液；野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体重组菌发酵后粗酶液的酶活分别为191.3U/ml和239.1U/ml。
④然后采用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得磷脂酶B纯酶酶粉。
实施例6：毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶B全细胞催化剂的制备
①挑取YPD平板上的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC 9K-Flo-plb和GS115/pPIC 9K-Flo-plbm接种至50ml的YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；
②以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至BMMY培养基；
③继续培养，30℃，250r/min，每隔12h补加250μL甲醇。在培养5天后，离心收集取菌体，用过膜水冲洗1-2次，经真空冷冻干燥制得毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶B细胞催化剂。野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体细胞催化剂酶活分别为268和337U/(g·干细胞)。
实施例7：以野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体制备甘油磷脂酰胆碱
底物为200mg的磷脂酰胆碱，催化剂为实施例5或实施例6制备的毕赤酵母游离表达的或毕赤酵母表面展示的野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体，浓度分别为酶粉200mg，全细胞催化剂为100mg，酶激活剂为10mmol/L的CaCl2，反应温度40℃，反应pH5.5(磷脂酰胆碱、CaCl2溶于pH5.5的bis-Tris–HCl缓冲液)，在磁力搅拌器搅拌作用下反应24h，随后通过萃取获得甘油磷脂酰胆碱。其中野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体酶粉催化制备甘油磷脂酰胆碱的转化率分别为11％、18％，野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体全细胞催化剂转化率分别为15％、26％。
实施例8：野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体应用于油脂脱胶
准确称取100g植物油放于250ml的具塞锥形瓶中，水浴加热到70℃，加入0.13ml浓度为45％的柠檬酸溶液，10000r/min均质1min,在70℃条件下继续搅拌(500r/min)反应25min,随后将温度降至50℃，加入浓度为4％的氢氧化钠溶液，将反应体系的pH调至5.0，在500r/min搅拌5min后，加入3ml去离子水和800mg实施例5制备的酶粉或400mg实施例6制备的全细胞催化剂，10000r/min均质1min,而后在温度为40℃条件下继续搅拌(500r/min)反应5h，酶反应结束后将反应体系温度升至95℃，灭酶10min，随后迅速转入离心机10000r/min离心10min,收集上层油层进行磷含量及脱磷率分析。
其中毕赤酵母游离表达野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体酶粉使植物油的磷含量分别降至10mg/kg、5mg/kg，毕赤酵母表面展示野生型磷脂酶B和磷脂酶B突变体全细胞催化剂使植物油的磷含量分别降至8mg/kg、3mg/kg。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种新型磷脂酶B及其应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2064
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）TCCC 31028
<400> 1
gcagattcgt cgtccactac tggtgatggt tatgctccat caataattcc ttgtcccagt 60
gatgatacct ctttagttag aaacgcgtct ggcttatcta ccgctgaaac tgattggtta 120
aagaaaagag atgcgtacac taaagaagct ttacattcct tcttaagcag agctacttct 180
aacttcagtg acacttcttt gctatccact cttttcagta gtaactcttc caatgtaccc 240
aaaattggta ttgcatgctc tggtggtggt tatcgtgcca tgttgggtgg tgctggtatg 300
attgctgcta tggacaatcg tactgatggt gctaacgagc atggtcttgg tggtttacta 360
caaagttcca cgtatctatc gggtttgtcc ggtggtaact ggttgactgg tactttggca 420
tggaacaatt ggacctctgt acaggaaatt gtagaccata tgagtgagag cgattccatc 480
tggaatatca cgaaatccat tgtgaaccct ggtggctcta atttgaccta cacaattgaa 540
agatgggagt ccattgtaca agaagtgcag gctaagtctg atgcaggctt caatatatct 600
ttgtcggatt tgtgggcccg tgcactttct tacaacttct ttccaagctt gccagatgct 660
ggctccgctt tgacttggtc ctctttgaga gatgttgatg tgttcaaaaa cggtgaaatg 720
cctttaccaa ttactgttgc agatggtaga tacccaggta ccaccgtgat aaacttgaat 780
gccactcttt tcgagttcac tccatttgaa atgggttctt gggatccttc tttgaacgct 840
tttacggatg tgaaatatct aggtaccaac gttacaaatg gtaaaccggt caacaaggat 900
caatgcgttt ctggttacga taatgctgga tttgtaattg ccacatccgc cagtttattc 960
aacgaatttt ccctggaagc ttccacttcg acctattata aaatgattaa tagttttgcc 1020
aacaagtacg ttaacaacct atcccaagat gacgatgata ttgcaattta cgctgcaaat 1080
ccattcaagg atacagaatt tgttgaccgc aattacactt ccagtattgt tgatgccgat 1140
gatttgtttt tagttgatgg tggtgaggac ggccaaaatt tgccgttggt tccactaatc 1200
aagaaggaac gtgacttgga tgtggtgttc gcattggata tatccgacaa tactgatgaa 1260
tcatggccaa gtggtgtgtg catgacgaac acttatgagc gccagtattc taagcaaggt 1320
aaaggaatgg ctttcccata tgttccagac gttaacacct tccttaactt gggcttaact 1380
aataagccaa cgttttttgg ttgtgatgca aaaaatttga cggacttgga gtatattcca 1440
cctttagttg tatatatccc aaacacaaaa cattcattca atggtaacca aagtactttg 1500
aagatgaact acaatgttac agaacgtctt ggaatgatca gaaatggttt tgaagctgct 1560
acaatgggca actttacgga tgactctaac tttttaggtt gcataggttg tgccatcatt 1620
agacgtaagc aagaaagcct aaatgccacc ttgccccctg aatgtaccaa atgttttgcg 1680
gattactgct ggaacggcac actaagtacc tcagctaatc ctgaactatc gggaaatagt 1740
acgtatcaaa gcggtgctat tgcctctgca atctctgagg ctactgacgg tattccaata 1800
acggctctct taggttcatc aacctccgga aatactacat caaactcaac aacctcgact 1860
tcatcaaatg tcacttctaa ctcaaactct tcgtcaaata caactttaaa ctcaaattct 1920
tcatcctctt caatttcttc ctctacagct cgttcttctt cctctacggc aaacaaagcg 1980
aatgctgcgg ctatttccta tgcgaacact aatactctaa tgagtttgtt aggtgccata 2040
acagcattat ttggactaat ttag 2064
<210> 2
<211> 687
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）TCCC 31028
<400> 2
Ala Asp Ser Ser Ser Thr Thr Gly Asp Gly Tyr Ala Pro Ser Ile Ile
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ser Asp Asp Thr Ser Leu Val Arg Asn Ala Ser Gly Leu
20 25 30
Ser Thr Ala Glu Thr Asp Trp Leu Lys Lys Arg Asp Ala Tyr Thr Lys
35 40 45
Glu Ala Leu His Ser Phe Leu Ser Arg Ala Thr Ser Asn Phe Ser Asp
50 55 60
Thr Ser Leu Leu Ser Thr Leu Phe Ser Ser Asn Ser Ser Asn Val Pro
65 70 75 80
Lys Ile Gly Ile Ala Cys Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Met Leu Gly
85 90 95
Gly Ala Gly Met Ile Ala Ala Met Asp Asn Arg Thr Asp Gly Ala Asn
100 105 110
Glu His Gly Leu Gly Gly Leu Leu Gln Ser Ser Thr Tyr Leu Ser Gly
115 120 125
Leu Ser Gly Gly Asn Trp Leu Thr Gly Thr Leu Ala Trp Asn Asn Trp
130 135 140
Thr Ser Val Gln Glu Ile Val Asp His Met Ser Glu Ser Asp Ser Ile
145 150 155 160
Trp Asn Ile Thr Lys Ser Ile Val Asn Pro Gly Gly Ser Asn Leu Thr
165 170 175
Tyr Thr Ile Glu Arg Trp Glu Ser Ile Val Gln Glu Val Gln Ala Lys
180 185 190
Ser Asp Ala Gly Phe Asn Ile Ser Leu Ser Asp Leu Trp Ala Arg Ala
195 200 205
Leu Ser Tyr Asn Phe Phe Pro Ser Leu Pro Asp Ala Gly Ser Ala Leu
210 215 220
Thr Trp Ser Ser Leu Arg Asp Val Asp Val Phe Lys Asn Gly Glu Met
225 230 235 240
Pro Leu Pro Ile Thr Val Ala Asp Gly Arg Tyr Pro Gly Thr Thr Val
245 250 255
Ile Asn Leu Asn Ala Thr Leu Phe Glu Phe Thr Pro Phe Glu Met Gly
260 265 270
Ser Trp Asp Pro Ser Leu Asn Ala Phe Thr Asp Val Lys Tyr Leu Gly
275 280 285
Thr Asn Val Thr Asn Gly Lys Pro Val Asn Lys Asp Gln Cys Val Ser
290 295 300
Gly Tyr Asp Asn Ala Gly Phe Val Ile Ala Thr Ser Ala Ser Leu Phe
305 310 315 320
Asn Glu Phe Ser Leu Glu Ala Ser Thr Ser Thr Tyr Tyr Lys Met Ile
325 330 335
Asn Ser Phe Ala Asn Lys Tyr Val Asn Asn Leu Ser Gln Asp Asp Asp
340 345 350
Asp Ile Ala Ile Tyr Ala Ala Asn Pro Phe Lys Asp Thr Glu Phe Val
355 360 365
Asp Arg Asn Tyr Thr Ser Ser Ile Val Asp Ala Asp Asp Leu Phe Leu
370 375 380
Val Asp Gly Gly Glu Asp Gly Gln Asn Leu Pro Leu Val Pro Leu Ile
385 390 395 400
Lys Lys Glu Arg Asp Leu Asp Val Val Phe Ala Leu Asp Ile Ser Asp
405 410 415
Asn Thr Asp Glu Ser Trp Pro Ser Gly Val Cys Met Thr Asn Thr Tyr
420 425 430
Glu Arg Gln Tyr Ser Lys Gln Gly Lys Gly Met Ala Phe Pro Tyr Val
435 440 445
Pro Asp Val Asn Thr Phe Leu Asn Leu Gly Leu Thr Asn Lys Pro Thr
450 455 460
Phe Phe Gly Cys Asp Ala Lys Asn Leu Thr Asp Leu Glu Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Pro Leu Val Val Tyr Ile Pro Asn Thr Lys His Ser Phe Asn Gly Asn
485 490 495
Gln Ser Thr Leu Lys Met Asn Tyr Asn Val Thr Glu Arg Leu Gly Met
500 505 510
Ile Arg Asn Gly Phe Glu Ala Ala Thr Met Gly Asn Phe Thr Asp Asp
515 520 525
Ser Asn Phe Leu Gly Cys Ile Gly Cys Ala Ile Ile Arg Arg Lys Gln
530 535 540
Glu Ser Leu Asn Ala Thr Leu Pro Pro Glu Cys Thr Lys Cys Phe Ala
545 550 555 560
Asp Tyr Cys Trp Asn Gly Thr Leu Ser Thr Ser Ala Asn Pro Glu Leu
565 570 575
Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Gln Ser Gly Ala Ile Ala Ser Ala Ile Ser
580 585 590
Glu Ala Thr Asp Gly Ile Pro Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ser Ser Thr
595 600 605
Ser Gly Asn Thr Thr Ser Asn Ser Thr Thr Ser Thr Ser Ser Asn Val
610 615 620
Thr Ser Asn Ser Asn Ser Ser Ser Asn Thr Thr Leu Asn Ser Asn Ser
625 630 635 640
Ser Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Thr Ala Arg Ser Ser Ser Ser Thr
645 650 655
Ala Asn Lys Ala Asn Ala Ala Ala Ile Ser Tyr Ala Asn Thr Asn Thr
660 665 670
Leu Met Ser Leu Leu Gly Ala Ile Thr Ala Leu Phe Gly Leu Ile
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<210> 3
<211> 2064
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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gatgatacct ctgcagttag aaacgcgtct ggcttatcta ccgctgaaac tgattggtta 120
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ttgtcggatt tgtgggcccg tgcactttct tacaacttct ttccaagctt gccagatgct 660
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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165 170 175
Tyr Thr Ile Glu Arg Trp Glu Ser Ile Val Gln Glu Val Gln Ala Lys
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Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Gln Ser Gly Ala Ile Ala Ser Ala Ile Ser
580 585 590
Glu Ala Thr Asp Gly Ile Pro Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ser Ser Thr
595 600 605
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ataagaatgc ggccgcaatt agtccaaata atgctgttat g 41

Claims (8)

1.一种磷脂酶B突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述磷脂酶B突变体的编码基因。
3.权利要求2所述磷脂酶B突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID No.3所示。
4.权利要求1所述磷脂酶B突变体的用途，其特征在于，用于制备甘油磷脂酰胆碱，步骤如下：
（1）将磷脂酰胆碱、CaCl2溶于pH4.0-pH8.0的缓冲液中；
（2）加入磷脂酶B，在20 到45℃下反应4-24h。
5.权利要求1所述磷脂酶B突变体的用途，其特征在于，用于油脂脱胶，步骤如下：
（1）将经过酸处理过的植物油调至pH到4.5-6.0；
（2）加入磷脂酶B和一定量的去离子水脱胶1-5h；
（3）将脱胶后的植物油升温至95℃，灭酶10min；
（3）进行胶质分离，得到脱胶油。
6.一种包含权利要求2所述的基因的表达载体或宿主细胞。
7.如权利要求6所述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pPIC 9K，宿主细胞为毕赤酵母GS115；或者，表达载体为pPIC9K-Flo，宿主细胞为毕赤酵母GS115。
8.权利要求1所述磷脂酶B突变体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到了新的重组载体；
（2）将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高活力磷脂酶B突变体。
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