CN1066267A - 有机铬配位化合物及富有机铬酵母的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备有葡萄糖耐量因子(GTF)活 性的三元铬配位化合物及富集了该化合物的酵母粉 的制备方法，以及它们在治疗糖尿病及其并发症特别 是心血管系统并发症及营养保健品的应用。

Description

本发明涉及一种具有葡萄糖耐受因子（GTF）活性的新的有机铬配位化合物（以下简称配合物）、富集了这种有机铬配位化合物的啤酒酵母（以下简称富有机铬酵母）及它们的制备方法。

60年代后期，人们发现食物中铬（无机盐），特别是当加入啤酒酵母的含铬提取物时，可提高人体生物学系统中的葡萄糖氧化作用（Walter  Mertz，Physiological  Rev.49：163，1969）。虽然对其机理尚未完全了解，但已有证据表明，给患糖尿病个体口服上述啤酒酵母提取物，可使胰岛素分泌量恢复到正常水平。另外Toepfer  E.W.等人（“Food  in  Relation  to  Biological  Activity”，J.Arg.Food  Chem.，21：69，1973）讨论了食物中铬含量与其对葡萄糖氧化活性之影响间的关系。

虽然这种啤酒酵母可为某些患病个体提供据信有GTF活性的有机铬配合物，但因其含量太低而难于在医疗实践中广泛应用。为此，近年来有些研究者尝试用化学合成方法制备有相同生物学活性的有机铬配合物，如美国专利4，242，257号公开了一种得到葡萄糖耐受因子的方法，该方法包括使烟酸的碱金属盐与三价铬反应。美国专利4，315，927号公开了一种有高机体摄入量的哌啶甲酸铬化合物及其在治疗酒精中毒性疾病中的应用。另外，杨家灿等人用三价铬、烟酸和氨基酸（包括甘氨酸、L-谷氨酸和半胱氨酸）合成了铬的多元配位化合物（参见华西医科大学学报，19（2）：167-169，1988），并描述了该化合物在治疗高脂血症中的应用。

另一方面，为了使啤酒酵母中铬浓度达到一个商业上有价值的水平，也进行了很大的努力。如Andrew  Szalay的美国专利4，343，905号中公开了以化学方法合成用酵母浓缩有机铬的方法，该方法包括首先在水介质中使氧化铬与烟酸、甘氨酸、L-谷氨酸及L-半胱氨酸反应，得到由氨基酸和氧化铬溶液组成的营养液及含铬配合物培养基。然后将该培养基与预制备的啤酒酵母溶液混合，发酵24小时后得到GTF铬配合物含量约为200μg/g干重的酵母粉。然而，该专利说明书中并没有明确说明所加的无机铬（氧化铬）是否已被酵母细胞同化或有机化，也没有说明最后测得铬浓度是否包括了仍保留有培养基中的无机铬。另外，该专利申请人并没有就其合成产物的结构特征提供任何令人信服的检测数据。再者，就其化学合成步骤来说，因为是合成五元配合物，故所需原料量相对较大（每25升水介质中含固体物总重量平均值为1505g）。

本发明人经过长期反复研究，成功地合成了三元铬配合物，并在此基础上利用普通啤酒酵母在含该三元铬配合物的培养基中发酵，得到富集了高浓度有机铬配合物的细胞培养物，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种新的具有GTF活性的三元铬配位化合物及其化学合成方法。

本发明的另一个目的是提供一种在啤酒酵母培养物中富集三价铬配合物的方法。

本发明的再一个目的是提供以本发明方法生产的富集高铬配合物的酵母干粉产品，及其作为糖尿病和心血管并发症之治疗和/或预防剂，以及作为心血管疾病治疗和/或预防剂及减肥保健品的应用。

为了实现上述目的，本发明人首先以三元铬金属配合物合成方法合成了包括三价铬、烟酸和甘氨酸的三元有机铬配合物。简单地说，该方法包括首先在乙醇介质中加入适当量的醋酸铬，然后再向醋酸铬溶液内加入烟酸，在偏酸性PH条件下加热回流足够长时间后，再加入选择量的甘氨酸，继续回流直到反应完成，然后将反应溶液减压浓缩，得到本发明的三价铬配位化合物。

尽管在体外生物学实验中显示本发明的三元铬配合物具有较高的GTF活性，但为了使之更接近于天然来源的GTF，以便以一种更易于被使用者接受的形式应用于医疗实践中，本发明人进一步完成了利用普通啤酒酵母富集本发明GTF三元铬配合物的工作，并在实验室工作的基础上，经过反复模索实现了中试规模生产。该生物富集方法包括将含有三元铬配合物的溶液按适当比例加到预制备的啤酒酵母发酵培养基中保温的步骤。

附图1显示本发明三元铬配位化合物和无机铬盐（三氯化铬）对酵母细胞生长的影响。

附图2显示本发明富有机铬酵母细胞的能谱分析结果。

以下结合附图详细描述本发明的方法，以进一步说明本发明的上述目的及优点。

三价铬配位化合物的制备

为了制备三价铬配合物，首先在装有750ml、75～95%乙醇的1000ml容积的四口烧瓶内加入占总反应体积0.26-1.06%（w/v）（1.98-7.96g）的醋酸铬（或其他水溶性三价铬有机或无机铬盐或氧化物），然后在持续搅拌下加入占总反应体积0.1～0.55%（w/v）、（0.75-4.61g）的烟酸，同时加入适当量酸使反应混合物的PH保持在3-7之间。将此烧瓶固定在配有搅拌器的回流装置上，加热回流2-5小时，然后在反应混合物中加入占总反应体积0.1～0.6%（w/v）的甘氨酸（0.75-4.5g），持续搅拌下继续回流3-6小时。

当反应溶液由绿色变为深紫红色时停止反应，于室温下静止冷却后，在减压下除去乙醇，得到一种深紫红色的透明液体，即为本发明的三元铬配合物。

本领域技术人员可以理解到，在合成配位化合物时，各配位组分的比例是极其严格并且需要特别小心掌握的，否则将因所加各配位体比例不当，导致合成反应混合物混浊，以致出现大量沉淀物，进而导致产物分离困难和原料浪费;或者造成合成产物不稳定，以致消减了产物的生理学活性。在本发明方法中，由于在大量实验的基础上找到了最佳配位体比例，并且在合成操作中严格控制各配位体的加入量，从而使得反应完全，反应产物始终保持澄清透明，基本上没有出现明显的沉淀。

在实验室条件下，我们分别对三元、四元和五元的不同配体进行了反复试验和筛选。筛选方法包括以分光光度法检测262nm处紫外吸收值、测定合成产物的三价铬（Cr⁺³）含量、以及红外光谱分析。结果发现，本发明的三元配合物与已知的五元配合物具有基本相同的检测值，而本发明三元配合物的结合率及有机铬转化率均高于五元配合物，分别高为9.2%和5.3%。该三元配合物的红外光谱与Toepfer EW，等人（J.Agric.Food Chem.22（1）：162，1977）对天然GTF提取物所作检测的结果几乎完全相同。

使用质谱分析法检测（溶剂：H₂O+甲醇;扫描范围：10-900），测得本发明配合物的平均分子量范围为350-440道尔顿，且基本上没有杂质峰。

使用核磁共振仪（JEOL  JNM-GX  400型），并参考Cooper，J，A等人（Inorganic  Chemica  Acta，92：23，1984）对铬与氨基酸配位化合物的结构分析资料，我们推测本发明的三价铬配合物的配位结构如下：

虽然目前尚不能完全证实准确结构，但可以相信本发明配合物的配位比优势与结构间存在着极为密切的关系，而且实质上没有上述结构的异构体。

为了进一步证实本发明方法的可行性，我们使用分光光度法和等离子法分别对从实验室样品和中试规模生产的大批量试样（150L）共七批产品进行了Cr⁺²含量分析，结果用分光光度法测得Cr⁺³含量为4832-5872μg/ml;用等离子法测得Cr⁺³结合率为9.2-10.2%，有机铬转化率为85～95%。用两种方法对七批样品所作检测结果示于下列表1中。

表1.对七批有机铬制剂中铬含量测定

批号 反应体积 Cr⁺³Cr⁺³有机铬转化率

  （L）  （Ug/ml）  （%）  （%）

91-11-29  0.75  5872  9.4  87.0

91-12-01  0.75  5864  9.4  87.0

91-12-02  0.75  4832  9.2  85.0

91-12-23  7.50  5660  9.6  89.0

91-12-28  7.50  5860  10.2  94.4

92-03-05  150.00  5060  9.2  85.0

92-03-07  150.00  5244  9.7  90.0

为了检验本发明三元铬配合物对啤酒酵母细胞生长的影响，在三组100ml培养瓶内各加入50ml液体培养基接种酵母菌，再分别加入1ml浓度高于5mg的有机铬配合物或用作合成原料的三氯化铬，并以等体积培养基作为空白对照。然后于25℃下摇床培养。24小时后，分别取1ml充分搅拌的细胞悬液样品进行细胞计数，并在普通光学显微镜下观察细胞形态。结果如表2图1所示。从中可以看出，本发明的三元铬配合物可促进酵母细胞的生长，平均细胞计数明显高于对照组，细胞形态正常且生长旺盛;相反，加三氯化铬组则可见细胞数目明显减少（只为加有机铬组的一半以下），而且细胞形态异常，细胞染色浅，核形畸异，有多数空泡。这一结果也可以作为本发明的有机铬配合物具有完全不同无机铬的生物学活性，以及本发明的合成方法切实可行的一个证据。

表2.三元铬配合物和三氯化铬对酵母细胞生长的影响

分组	培养液含     细胞数   细胞生长率cr+3(ug)       （1×107/ml)        (%)
		空白酵母对照三元铬配合物无机三氯化铬	┄               9.45┄       11.20        100.05000           13.00        125.05000          12.60         121.05000           4.25          40.95000           3.60          34.6

在上述分析的基础上，我们进一步检测了本发明三元铬配合物在离体条件下对啤酒酵母细胞糖代谢能力的影响，以证实其体外生物学活性。简单地说，本实验是根据活酵母细胞在加有高浓度葡萄糖和胰岛素的营养培养基中，在加或不加本发明三元铬配位化合物的情况下培养12-24小时，然后测定酵母细胞培养液中的酸度改变及残余糖含量，以估计三元铬配合物对活酵母细胞利用糖能力的影响。实验分为五组：（1）.空白对照组：只有活酵母细胞培养物;（2）.配合物组：酵母细胞培养物+三元铬配合物;（3）.胰岛素组：酵母细胞培养物+胰岛素;（4）.配合物+胰岛素组：三元铬配合物+胰岛素;（5）.醋酸铬+胰岛素组：以醋酸铬代替第4组中的三元铬配位化合物。结果示于下列表3中。

表3.三元铬配位化合物对酵母细胞糖代谢能力的影响

分组	酸度改变	0.01N(NaOH)(ml)	残糖度（巴林）
				空白对照配合物胰岛素配合物＋胰岛素醋酸铬＋胰岛素	++++++	1.92.12.24.62.0	6.26.56.74.36.3

从上表可以看出，在活酵母培养物中单纯加配合物或胰岛素对细胞糖代谢能力无明显影响，而只有在同时加入本发明的三元铬配合物和胰岛素时才观察到细胞代谢能力的提高，培养基内产酸量约提高一倍以上，糖消耗量比空白对照组的高50%以上。以醋酸铬代替本发明的配合物时，既使有胰岛素存在也不会提高酵母细胞利用糖的能力。

在啤酒酵母中富集有机铬配合物

为了验证按本发明方法制备的有机铬三元配合物在啤酒酵母中的生物利用率和富集率，制备有更广泛实用价值和更接近于天然GTF产品的富三价有机铬酵母，我们训化并选育了一株具高铬富集率的汉森氏啤酒酵母菌株（Saccharomyces  cerevisiae  hansen）并定名为汉森氏啤酒酵母TA128菌株。

取固体斜面TA128菌株少许，接种于100ml种子培养液中，置20-35℃温度下静止培养12-24小时。然后将细胞悬浮液倾入含1000ml添加了0.1-4.0%（v/v）有机铬配合物的上述液体培养基的培养液中，在上述温度下继续培养10-20小时。将该种子菌的悬浮液接种在已消毒灭菌的100L发酵罐中。于25～35℃下按酵母细胞常规发酵方法发酵。当细胞处于对数生长期时，向发酵罐内加入0.1-4.0%（v/v）按前述方法制备的有机铬配合物水溶液。继续发酵10-22小时，然后将整个培养物加热到大约80～95℃以杀死酵母细胞。待温度降至室温后连续离心（4000×g，15分钟）分离酵母细胞，得到浓缩的酵母泥。用去离子水洗涤细胞后，将其稀释到适当浓度。然后用常规技术喷雾干燥，得到本发明的富有机铬酵母粉。

按上述方法制备的富有机铬酵母粉外观呈黄色或灰黄色，颗粒均匀，具有酵母的特殊香味。于显微镜下检查，可见大多数细胞呈现园形或椭园形，大小正常。其干燥失重不超过8.5%。蛋白质含量（Lowry氏法）不低于总重量的40%。铬含量在2.5-6.5mg/g干粉以上。

为了证实本发明的富有机铬酵母在实质上富集了三价有机铬，我们还进行了细胞内有机铬含量分析。

首先将富有机铬酵母细胞低温快速冷冻，然后用超薄切片机制备超薄组织切片（厚度100mm），切片经冷冻干燥10小时后，喷涂厚度约50A的碳薄，然后在PHILIPS  EM400T透射电镜下观察酵母细胞，并由配接在400T上的EDA×9100能谱仪检测细胞内微量元素含量。在完全相同的条件下，随机检测若干个酵母细胞的细胞内微量元素能谱（图2），以国际公认的HALL方法计算铬峰的峰背比值，同时测酵母细胞外培养基中的铬含量，结果证明绝大部分（89.5%）有机铬存在于细胞内。

基于本发明三元铬配合物和富有机铬酵母的上述理化及生物学性质，我们成功地将它们用于治疗或预防糖尿病，特别是不依赖于胰岛素的Ⅱ型糖尿病及其心血管系统并发症，包括高脂血症和动脉硬化症。

为了上述治疗和/或预防目的，一般可将本发明的三元铬配合物或富有机铬酵母制成粉剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、分散剂等多种不同的剂型，并以口服方式给药。在这些医药组合物中，除含有作为有效成分的三元铬配合物或富有机铬酵母粉外，还可根据所选用的剂型添加各种已知的常规佐剂、赋形剂、增溶剂、甜味剂、表面活性剂、崩解剂及防腐剂以制成不同剂型的医药处方。为了用药方便，可将本发明的有机铬组合物制成单位剂量形式。给药剂量将依据被治疗者的病情、年龄、以身体一般状态而有所变化，但一般可每天给药1-3次，每日用药剂量一般为10～1000μg，较好是200-500μg。当用于预防目的减肥或保健目的，每日服药量为50-200μg。

实施例1

准确称取醋酸铬3.850g，溶解于750ml85%乙醇中，待醋酸铬充分溶解后加入烟酸2.50g，持续搅拌下使之完全溶解。然后加入适当冰醋酸，使溶液的PH达到酸性，并倒入1000ml四口园底烧瓶中。加热该反应混合物至回流温度，持续搅拌下回流3.5小时，然后再向反应混合物中加入2.45g甘氨酸。待甘氨酸溶解后，继续搅拌回流3.5小时，然后停止反应。将反应混合物在常温下搅拌过夜，次日于真空减压下除去乙醇，得到一种呈深紫红色的透明液体，即为本发明的三元铬的配位化合物。

实施例2

取两环培养并训化的固体斜面菌株TA128接种于100ml种子培养基（含有蛋白胨0.35g、酵母浸膏0.5g、KH₂PO₄0.2g、Mgso₄·7H₂O 0.1g、（NH₄）₂SO₄0.1g、蔗糖8.0g）中，于27℃下静止培养20小时。摇动细胞培养物使它成为悬浮状态，然后缓缓倒入含1000ml已添加了1.5%（V/V）有机铬配位化合物的上述液体培养瓶内，在前述温度下继续培养20小时，即得到用于发酵生产的种子菌悬浮液。在无菌条件下，将此种子菌接种在100L已灭菌的发酵液中，于30℃的温度及通气、搅拌条件下发酵培养3小时。当细胞处于对数生长期时，向发酵罐内加入1.5%（V/V）有机铬配合物溶液。在前述条件下，继续发酵16小时。然后将整个培养物加热到90℃杀死酵母细胞。待温度降到室温后，除去上清得到浓缩的酵母泥。然后用去离子水重新悬浮细胞以常规方法喷雾干燥，得到本发明的富有机铬酵母粉。

虽然上面已借助实施例对本发明作了详细描述，但本领域技术人员可在不背离本发明待批权要求的前提下进行各种改动，这些改动均包括在本发明范围内。

Claims (12)

1、一种制备三元铬配位化合物的方法，该方法在乙醇介质中加入适当量的醋酸铬，然后向该醋酸铬溶液内加入烟酸，在偏酸性PH条件下加热回流2-6小时，然后再加入选择量的甘氨酸，继续回流3-7小时，直到反应完成后，减压浓缩以回收产物。

2、根据权利要求1的方法，其中醋酸铬占总反应体积的0.26～1.06%（W/V）。

3、根据权利要求的方法，其中烟酸加入量占总反应体积的0.1～0.55%（W/V）。

4、根据权利要求的方法，其中甘氨酸的加入量占总反应体积的0.1～0.6%（W/V）。

5、根据权利要求1的方法，其中所说的偏酸性PH为PH3～7。

6、一种制备富三元铬配位化合物干酵母粉的方法，该方法包括将含有根据权利要求1的三元铬配位化合物的溶液按一定比例加到预制备的啤酒酵母发酵培养基中保温。

7、根据权利要求6的方法，其中在啤酒酵母发酵培养基中加入的三元配位化合物水溶液的量为0.1～4.0%（V/V）。

8、根据权利要求6的方法，其中所说的啤酒酵母是普通汉森氏啤酒酵母。

9、根据权利要求6的方法，该方法进一步包括加热破坏细胞及喷雾干燥的步骤。

10、按前述权利要求1和/或6的方法制备的三元铬配位化合物和/或富有机铬酵母粉在治疗糖尿病和及其并发症中的应用。

11、按前述权利要求1和/或6的方法制备的三元铬配位化合物和/或富有机铬酵母粉在治疗心血管疾病中的应用。

12、按前述权利要求1和/或6的方法制备的三元铬配合物和/或富有机铬酵母粉作为减肥等保健品的应用。

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