CN106619628B

CN106619628B - 苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用

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Publication number: CN106619628B
Application number: CN201710047161.XA
Authority: CN
Inventors: 苏佳灿; 陈晓; 智信; 胡宏岗; 赵庆杰; 曹烈虎
Original assignee: Shanghai Changhai Hospital
Current assignee: Shanghai Changhai Hospital
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: CN106619628A

Abstract

本发明涉及医药领域，具体是苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用，所述的苦参碱衍生物的结构如通式I所示。本发明为苦参碱衍生物提供了一种新用途，也为绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供了新的思路。

Description

苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用。

背景技术

苦参碱是从豆科槐属植物苦豆子、苦参等中分离得到的生物碱，广泛存在于苦参(Sophora flavescens ait)的根、植株和果实中，属于四环喹嗪啶类化合物，主要包括苦参碱、槐果碱和氧化苦参碱等，具有抗氧化、抗炎等多种药理作用。近年来，苦参碱(matrine)因其在研究与临床中表现出显著的抗炎活性，受到研究者的极大关注。研究证实，苦参碱主要通过抑制NF-κB激活来发挥作用。Cui等(Cui,Zhang,Neuroprotection and underlyingmechanisms of oxymatrine in cerebral ischemia of rats,Journal/Neurol Res,2011,33:319-324)报道在脑组织缺血性模型中，氧化苦参碱能够明显抑制NF-κB的激活，拮抗局部缺血，保护神经组织。苦参碱在肝癌细胞也能抑制NF-κB(Luo,He,[Inhibitoryeffect of pyrrolidine dithiocarbamate combined with matrine on the growth ofhuman hepatocellular carcinoma xenografts],Journal/Zhonghua Gan Zang Bing ZaZhi,2011,19:275-280)。Li等(Li,Zhang,Matrine inhibits the invasive propertiesof human osteosarcoma cells by downregulating the ERK-NF-kappaB pathway,Journal/Anticancer Drugs,2014,25:1035-1043)报道苦参碱通过降低基质金属蛋白酶-2，9的表达，p50和p65核心因子的转录，IκB-β磷酸化水平，抑骨肉瘤细胞体内外增殖和体外细胞转移。Zhang等(Zhang,Liu,Antiinflammatory effects of matrine in LPS-inducedacute lung injury in mice,Journal/Eur J Pharm Sci,2011,44:573-579)报道，苦参碱能够抑制NF-κB，抑制脂多糖诱导的肺损伤TNF-a,IL-6和HMGB1分子表达，减轻肺水肿和血管通透性。

天然苦参碱的生物利用度差，限制了其应用。我们通过结构修饰、活性测定构效关系等手段进一步优化其结构，降低毒性、提高活性及生物利用度。槐果碱与苦参碱在结构上非常相似，存在α-β不饱和己内酰胺。对它的双键进行结构修饰后可获得一系列新型苦参碱衍生物。我们以槐果碱为原料，经Lawesson’s试剂处理将其羰基氧原子转换成硫原子，再通过加成反应在13位引入一系列的含胺基团，制备得到13-甲氨基-18-硫代苦参碱M19。对其抗炎活性研究表明(Hu,Wang,Synthesis and in vitro inhibitory activity ofmatrine derivatives towards pro-inflammatory cytokines,Journal/Bioorg MedChem Lett,2010,20:7537-7539,Xu,Hu,Bioactive compound reveals a novel functionfor ribosomal protein S5in hepatic stellate cell activation and hepaticfibrosis,Journal/Hepatology,2014,60:648-660)：M19能够显著抑制LPS诱导巨噬细胞激活并显著抑制NF-κB的激活。

骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是以骨量降低、骨组织显微结构发生改变，以骨脆性增加、骨强度下降、易骨折为特征的一种慢性炎症性疾病。骨吸收与骨形成的失衡是骨质疏松的病理生理学基础，由促骨形成的成骨细胞和促骨吸收的破骨细胞调控(Del Puente,Esposito,Physiopathology of Osteoporosis:From Risk Factors Analysis toTreatment,Journal/J Biol Regul Homeost Agents,2015,29:527-531)。研究表明，在慢性炎症过程中转录因子NF-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)大量激活，骨质疏松的发生与细胞核因子κB的持续激活关系密切(Abu-Amer,NF-kappaB signaling and boneresorption,Journal/Osteoporos Int,2013,24:2377-2386)。NF-κB激活能够显著促进破骨细胞的分化、功能与存活。炎症因子激活破骨细胞中的NF-κB转录因子，激活下游信号通路，引起相关基因转录翻译，最终导致破骨细胞分化、成熟与活化，引起骨吸收，造成骨质疏松。研究证实，抑制NF-κB表达和转录活性后能够显著改善骨质疏松情况(Yuan,Xu,Leonurine hydrochloride inhibits osteoclastogenesis and prevents osteoporosisassociated with estrogen deficiency by inhibiting the NF-kappaB and PI3K/Aktsignaling pathways,Journal/Bone,2015,75:128-137,Zhang,Liu,HistoneAcetyltransferase GCN5Regulates Osteogenic Differentiation of MesenchymalStem Cells by Inhibiting NF-kappaB,Journal/J Bone Miner Res,2016,31:391-402,Yang,Blair,The Proteasome Inhibitor Carfilzomib Suppresses ParathyroidHormone-induced Osteoclastogenesis through a RANKL-mediated SignalingPathway,Journal/J Biol Chem,2015,290:16918-16928,Guan,Zhao,Epoxyeicosanoidssuppress osteoclastogenesis and prevent ovariectomy-induced bone loss,Journal/FASEB J,2015,29:1092-1101)。

已有的文献和诊疗指南报道，用于治疗绝经后骨质疏松症的药物主要有：骨吸收抑制剂(包括双膦酸盐、雌激素疗法和选择性雌激素受体调节剂)和骨形成促进剂(甲状旁腺激素)。目前治疗绝经后骨质疏松症的治疗药物之间没有存在相互通用的文献报道和临床实践。

目前尚未有任何文献报道苦参碱衍生物具有治疗绝经后骨质疏松症的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苦参碱衍生物的新用途，特别是在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用。

本发明在前期的实验中，通过HE切片和Micro-CT结果证明苦参碱衍生物可明显减轻小鼠去卵巢后的骨质丢失，对肝肾功能无明显影响。

本发明的第一方面，提供一种苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用，所述的苦参碱衍生物的结构如通式I所示：

其中X是氧原子或硫原子；

其中Y选自i或ii或iii：

i.取代氧基，选自甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基或苄氧基，优选的是甲氧基；

ii.取代硫基，选自甲硫基，乙硫基，正丙硫基，正丁硫基，正戊硫基，正己硫基，苯硫基，苄硫基或对甲苯硫基，优选的是对甲苯硫基；

iii.氨基、取代氨基或环氨基，取代氨基为单取代或多取代，氨基的取代基选自饱和或不饱和烃基，饱和烃基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、正戊基、环戊基、正己基或环己基；不饱和烃基为烯丙基、炔丙基、苄基或取代苄基，取代苄基可位于苯环的邻、间、对位，单取代或多取代，苄基的取代基选自(a)卤素，F、Cl、Br、I；或(b)甲基、乙基、正丙基、异丙基；或(c)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基；环氨基为哌啶基、四氢吡咯基和哌嗪基。

所述的苦参碱衍生物还可以是上述通式化合物药学上可接受的盐类，如盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢溴酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐等。

本发明所述的苦参碱衍生物的制备方法可参考专利文献CN101704817A。本发明合成的部分优选化合物(具有以下通式)的化学结构、产率、核磁和质谱数据如表1所示。

表1部分优选化合物的结构、产率、质谱和分子式

优选的，所述的苦参碱衍生物为13-甲氨基-18-硫代苦参碱(M19)，其结构式如下所示：

体内动物实验表明M19化合物对小鼠绝经后骨质疏松症的具有显著的保护作用，实验结果显示M19能够显著抑制去卵巢小鼠骨量丢失，增加骨小梁数量，可用于制备抗骨质疏松药物。

优选的，所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物为注射剂，给药方式包括：静脉、局部给药等。

优选的，所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物除包含治疗有效量的上述苦参碱衍生物，还含有常规药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明为苦参碱衍生物提供了一种新用途，也为绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供了新的思路。

附图说明

图1.体外实验中，M19抑制破骨细胞形成。A为M19的结构。B为MTT实验的结果。C为矿化结节的结果。D为从BMMC细胞中诱导出的TRAP阳性细胞的结果。E为从RAW264.7细胞中诱导出的TRAP阳性细胞的结果。*p＜0.05，**p＜0.01。

图2.M19抑制破骨细胞发生相关标志物的表达。图2为五组中TRAP，Cathepsin K，TRAF 6，MMP9和CTR的蛋白质印迹结果和半定量分析结果。下图为目的条带扫描图，上图为光密度分析，Beta actin作为参照蛋白。数据表示为平均值±方差，实验设置3次独立的生物学重复。**p＜0.01，*p＜0.05，vs诱导组。①RW264.7细胞对照组；②RW264.7细胞M-CSF和Rankl诱导组；③M19低浓度处理且诱导组；④M19中浓度处理且诱导组；⑤M19高浓度处理且诱导组。

图3.M19抑制破骨细胞形成中的NF-κB，MAPK和PI3K/Akt三个通路。A为p65以及激活的p65的免疫荧光图片。B为核位置的荧光强度与整个细胞荧光强度的比值。C为NF-κB通路相关蛋白，p65，p50及IkBa蛋白磷酸化检测结果。D为MAPK通路三组蛋白的磷酸化检测结果。E为MAPK通路蛋白Rps5表达及PI3K和Akt蛋白磷酸化检测结果。F为各组细胞内NFATc1基因mRNA的半定量检测结果。下图为目的条带扫描图，上图为光密度分析，蛋白和mRNA含量以Beta actin为内参，磷酸化检测则以总蛋白为参照。数据表示为平均值±方差，实验设置3次独立的生物学重复。①RW264.7细胞对照组；②RW264.7细胞M-CSF和Rankl诱导组；③M19高浓度处理且诱导组。**p＜0.01，*p＜0.05，vs诱导组。

图4.在小鼠体内实验中，M19对小鼠去卵巢后骨量丢失具有明显的抑制作用，对小鼠肝脏组织形态无明显损害。A为6周后小鼠股骨远端干骺端切片HE染色，显示去卵巢组小鼠骨小梁数目较正常组明显减少，给予M19后小鼠股骨远端干骺端骨小梁面积明显多于卵巢切除组。B为6周后小鼠股骨远端Micro-CT二维和三维表现，显示去卵巢组小鼠骨小梁数目较正常组明显减少，给予M19后小鼠股骨远端干骺端骨小梁数目明显多于卵巢切除组。C为使用计算机软件对骨小梁数量(Tb.N)、骨表面积和组织体积之比(BS/TV)、相对骨体积或骨体积分数(BV/TV)、骨小梁连接数(Tb.Pf)的分析结果，发现差异具有统计学意义。D为6周后小鼠血清中IL-6，TNF-α和TRAP的含量及统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1.M19对C57小鼠去卵巢后骨质丢失具有抑制作用

一、实验材料：

苦参碱衍生物M19全称为13-甲氨基-18-硫代苦参碱。合成方法：以槐果碱为原料，经Lawesson’s试剂处理将其羰基氧原子转换成硫原子，再通过加成反应在13位引入一系列的含胺基团，制备得到13-甲氨基-18-硫代苦参碱M19。(Xu,Hu,Bioactive compoundreveals a novel function for ribosomal protein S5in hepatic stellate cellactivation and hepatic fibrosis,Journal/Hepatology,2014,60:648-660)。采用PBS将M19稀释成不同浓度的药物溶液。

二、实验方法：

(一)动物实验

1、6-8周雌性C57小鼠，购自第二军医大学实验动物中心分组情况：将30只C57小鼠随机分为3组，每组为10只，分别为假手术组、去卵巢组、M19干预组

去卵巢组：采用外科手术摘除小鼠双侧卵巢。

假手术组：除不切除小鼠卵巢外其余操作与去卵巢组相同。

M19干预组：切除小鼠双侧卵巢后每日一次腹腔注射给予小鼠2mg/10g的M19

2、饲养6周后处死小鼠，取小鼠的双侧股骨及血清。

(1)小鼠股骨使用多聚甲醛溶液进行固定、EDTA脱钙后，石蜡包埋切片(4mm)，进行苏木精-伊红(HE staining)染色，显微镜下观察小鼠股骨远端干骺端并拍照。

(2)将固定的小鼠股骨行Micro-CT检查，采用SKYSCAN 1176微型CT机对小鼠股骨远端行Micro-CT扫描，构建小鼠股骨远端干骺端二维及三维图像，并使用CT机自带软件对股骨骨小梁数量，骨表面积和组织体积之比，进行分析，相对骨体积，骨矿物质密度，骨小梁连接数进行分析，获得定量结果。

(3)取得的血清在4度条件下冷藏1小时后2500转10min进行离心，取得上清液。对血清中IL-6，TNF-α和TRAP进行检测。

(二)细胞实验

1.首先进行M19的细胞毒性试验，采用MTT试验方法。MTT浓度为5mg/ml，将BMMCs细胞以10×10⁴/ml的密度接种于96孔板，每个孔100μl。经过在37度，5％二氧化碳的条件下24小时的培养之后，加入M19，浓度梯度分别为1.2，3.7，11.1，33.3and 100μM。经过48小时的培养后，加入MTT溶液等待2小时。在490nm吸光度下使用ELISA板读数器计数细胞数目。

2.从C57小鼠骨髓中获得骨髓干细胞，进行培养。培养液使用DMEM低糖培养基，双抗，胎牛血清混合培养液。使用EDTA酶进行消化传代。实验分为两组。在进行成骨细胞诱导的同时，一组不做干预，另一组给予5μM的M19，分别在7，14，21天观察矿化结节形成情况，并拍照。

3.实验分为5组。第一组为RW264.7细胞对照组；第二组为RW264.7细胞且使用M-CSF和RANKL诱导组；第三组为1μM M19处理且使用M-CSF和RANKL诱导组；第四组为2μM M19处理且使用M-CSF和RANKL诱导组；第五组为5μM M19处理且使用M-CSF和RANKL诱导组。处理时间为细胞诱导后第三天，细胞再经4天诱导。细胞完成总计7天的诱导后，进行TRAP染色，观察破骨细胞诱导的数量并计数进行统计学分析。相同方法，培养BMMCs细胞进行干预。

4.对3中得到的细胞进行western blot检测，对TRAP，Cathepsin K，TRAF6，MMP9和CTR等破骨细胞生成指标进行分析，同时以β蛋白为标准，对上述指标进行半定量，得出统计学分析结果。

5.对3中得到的细胞使用免疫荧光对p65入核数目进行观察，并计算的核位置的荧光强度与整个细胞荧光强度的比值。视野选择随机视野，每个视野中选取10个细胞，最终得出平均值进行分析。

6.实验分为三组，分别为RAW264.7(对照组)，RAW264.7+RANKL+M-CSF(诱导组)和RAW264.7+M19+RANKL+M-CSF(M19处理且诱导组)，M19使用5μM，处理时间为细胞诱导后第三天，细胞再经4天诱导。细胞完成总计7天的诱导后，收集细胞，提取细胞总蛋白，免疫印迹法分别检测NF-κB通路，MAPK通路和Rps5/PI3K/Akt通路，同时，提取细胞Total RNA，RT-PCR检测破骨关键转录因子NFATc1mRNA含量。

三、实验结果

图1A为M19的化学结构。图1B为MTT实验的结果。结果显示，当M19的浓度为量为11.1μM时，对细胞基本无毒性，所以后续实验最高选择5μM为最高干预剂量。图1C为矿化结节结果，结果表明M19不能增加矿化结节的量，从而表明M19对成骨作用没有明显的促进作用。图1D为RAW264.7细胞的培养7天后进行TRAP染色的结果，图1E为BMMCs细胞的培养7天后进行TRAP染色的结果。结果中显示，当使用M-CSF和Rankl诱导后破骨细胞数量明显增加(P<0.01)，而当使用M19进行干预后破骨细胞数量明显减少，并且有计量依赖性，M19的浓度为5μM时破骨细胞数量最少(P<0.05)。结果说明，M19能抑制破骨细胞生成*P<0.05，**P<0.01。

图2为破骨细胞生成指标进行检测的结果，具体测量指标为TRAP,Cathepsin K,TRAF 6,MMP9和CTR。RW264.7细胞经7天M-CSF(20ng/ml)和Rankl(50ng/ml)诱导，细胞中TRAP，Cathepsin K，TRAF6，MMP9和CTR各组蛋白表达均明显增强，与对照组比较，差异显著(P＜0.01)。细胞诱导的过程中加入M19(0.1，1和5μM)，可以明显抑制各组蛋白上升趋势，且药物使用终浓度与蛋白表达的抑制程度呈梯度依赖，与诱导组比较，高剂量药物处理组各组蛋白指标均明显降低，数据具有统计学差异(P＜0.05)，这说明M19可以明显抑制M-CSF和Rankl诱导的RW264.7细胞破骨分化。

图3A为P65的免疫荧光结果。图3B为p65激活即入核百分比。图中显示，当使用M-CSF和Rankl进行诱导后p65的入核比例明显增多(P<0.01)，而同时使用M19进行干预时，结果显示p65的激活显著减少(P<0.01)。说明M19能够一直p65的激活。图3C显示，与对照组相比较，诱导组细胞内p65，p50和IκBa的磷酸化均明显升高，组间差异显著(P＜0.05)，5μM的M19处理，能够明显抑制胞内p65，p50和IκBa的磷酸化，与诱导组比较，数据均有统计学差异(P＜0.05)。MAPK通路检测数据(图3D)显示，与对照组相比较，诱导组细胞内ERK和JNK和均明显升高，组间差异显著(P＜0.05)，5μM的M19处理，能够明显抑制胞内ERK和JNK磷酸化，与诱导组比较，数据均有统计学差异(P＜0.05)，P38组间趋势与上面两组蛋白一致，但无组间统计学差异(P＞0.05.Rps5/PI3K/Akt通路检测数据(图3E)显示，与对照组相比较，诱导组细胞内Rps5，Akt和c-fos蛋白表达或者磷酸化均明显升高，组间差异显著(P＜0.05)，5μM的M19处理，能够明显抑制胞内Akt和c-fos磷酸化，与诱导组比较，数据均有统计学差异(P＜0.05)，5uM的M19处理，能够促进胞内Rps5表达，与诱导组比较，数据有统计学差异(P＜0.01)。NFATc1mRNA含量检测数据表明，与对照组相比较，诱导组细胞内NFATc1基因mRNA含量明显高于对照组(P＜0.05)，M19亦表现出明显的NFATc1转录抑制作用(P＜0.05，vs诱导组)。图3F为上述三组细胞中的核转录因子NFATc1mRNA的含量。其结果跟上述有相同的趋势。结果表明，M19通过抑制NF-κB通路，MAPK通路和Rps5/PI3K/Akt通路等3个通路，从而最终抑制骨关键转录因子NFATc1的表达，从而发挥抑制破骨细胞生成，减少骨质流失的作用。

图4A为6周后小鼠股骨远端干骺端切片HE染色。图片显示去卵巢组小鼠骨小梁数目较正常组明显减少，骨小梁间距增大，表现为骨质疏松；给予M19后小鼠股骨远端干骺端骨小梁数目明显多于卵巢切除组。骨小梁面积统计结果也显示去卵巢后骨质流失，给予M19后骨质流失缓解。图4B为6周后小鼠股骨远端Micro-CT二维和三维结构。图片显示去卵巢组小鼠骨小梁数目较正常组明显减少，给予M19后小鼠股骨远端干骺端骨小梁数目明显多于卵巢切除组。图4C为对股骨远端使用计算机软件分析，统计骨小梁数量(Tb.N)、骨表面积和组织体积之比(BS/TV)、相对骨体积或骨体积分数(BV/TV)、骨小梁连接数(Tb.Pf)和骨密度(BMD)后发现M19组小鼠显著优于去卵巢组小鼠，但不及假手术组，且差异具有统计学意义(p<0.05)。图4D为血清学检测结果。图片中显示，IL-6，TNF-α和TRAP等破骨指标在去卵巢组中明显多于假手术组，给予M19干预后，其水平降低，说明M19干预的小鼠体内破骨活性低于去卵巢组，表示M19干预后其骨质流失减少。

四、结果讨论

女性绝经后骨质疏松症属于原发性骨质疏松症，与雌激素水平降低后破骨细胞分化增多、成骨减少有关。去卵巢组小鼠模型人类绝经，在去卵巢6周后表现出显著的骨质疏松表现，主要表现为骨小梁数量明显减少、骨皮质变薄等。目前研究表明，骨质疏松症的发生与骨骼的慢性炎症有关。慢性炎症使得破骨细胞过度激活，造成骨质显著丢失。

其中核转录因子NF-κB与破骨细胞的过度激活有密切关联。作为一种NF-κB激活的抑制剂，M19显著减少了去卵巢后小鼠骨量的丢失，表现为骨小梁数目、骨表面积和组织体积之比、相对骨体积或骨体积分数和骨小梁连接数的增加。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用，所述的苦参碱衍生物为13-甲氨基-18-硫代苦参碱，其结构式如下所示：

2.根据权利要求1所述的苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用，其特征在于，所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物为注射剂。

3.根据权利要求1所述的苦参碱衍生物在制备预防或治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用，其特征在于，所述的预防或治疗绝经后骨质疏松症药物还含有常规药用赋形剂。