CN106619169B - 一种花色苷脂质体冻干粉及其制备方法 - Google Patents

一种花色苷脂质体冻干粉及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型花色苷脂质体冻干粉，采用甘露糖赤藓糖醇脂或者甘露糖赤藓糖醇脂/磷脂混合物为壁材制备所得，具体制备方法包括以下步骤：(1)将甘露糖赤藓糖醇脂溶于有机溶剂中得到溶液甲；(2)将花色苷溶解在溶剂中得到溶液乙；(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液混匀，超声处理后静置平衡，然后置于旋转蒸发仪中减压蒸发得到脂质膜；(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后膜过滤，得到脂质体悬液；(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入冻干保护剂，经冷冻干燥即可。本发明制备所得花色苷脂质体稳定性好；制备方法简单、成本低；丰富了脂质体的制备壁材，可应用于食品和化妆品领域。

Description

一种花色苷脂质体冻干粉及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种新型花色苷脂质体冻干粉及其制备方法。
背景技术
花色苷是一种安全、无毒的天然食用色素，其来源丰富，且具有很高的营养和药理价值，在食品、化妆品和医药领域有着巨大应用潜力。但是由于花色苷稳定性较差、易降解、生物利用度低，限制了其广泛应用。近年来，花色苷的稳态技术，尤其是脂质体制备技术成为了该领域的研究热点。通过将花色苷包埋在脂质体中，既能在空间上防止花色苷与水分子接触失活，也能稳定花色苷的生物活性，改善花色苷的释放速度，增加其生物可利用度。中国发明专利(申请号：CN201210177952.1)公开了一种花色苷提取物脂质体及其制备方法，其利用类脂作为载运体系；中国发明专利(申请号：CN201610054330.8)公开了一种杨梅花色苷纳米脂质体的制备方法，其采用大豆卵磷脂和胆固醇作为壁材，制得杨梅花色苷脂质体悬液。中国发明专利(申请号：CN201310413928.8)公开了一种花青素脂质体的制备方法，该方法采用了pH梯度结合逆向蒸发的方法，利用磷脂和胆固醇作为脂质体壁材，获得花青素脂质体。由此可见，现在制备脂质体采用天然磷脂与胆固醇按照一定比例复配为壁材，但是所得脂质体性质不稳定、生物利用度低，且壁材种类单一。
发明内容
本发明提供了一种新型的花色苷脂质体冻干粉的制备方法。
本发明还并提供了根据上述制备方法制备所得的新型花色苷脂质体冻干粉。
本发明所述的一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘露糖赤藓糖醇脂溶于第一溶剂中得到溶液甲；
(2)将花色苷溶解在第二溶剂中得到溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液混匀，超声处理后静置，然后置于旋转蒸发仪中减压蒸发得到脂质膜；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后膜过滤，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥即可。
步骤(1)中，所述甘露糖赤藓糖醇脂是由Ustligo maydis或Pseudazyma属菌株发酵合成，再经分离纯化得到，纯度为95％以上。
具体合成步骤如下：
菌种Pseudozyma aphidis DSMZ70725购买于德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)；Ustligo maydis(编号5.203)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)。将上述购买的菌株之一转接于斜面培养基(3.0g/L酵母提取物，3.0g/L麦芽提取物，5.0g/L蛋白胨，10.0g/L葡萄糖，15.0g/L琼脂，蒸馏水)中，28℃下活化2d，然后将其转接到液体培养基(4.0g/L葡萄糖，3.0g/L NaNO3，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.3g/L KH2PO4，1.0g/L酵母提取物，蒸馏水，pH 6.0)中，于28℃、220rpm条件下培养3d。将培养好的种子液接入发酵培养基(85mL/L大豆油，3.0g/L NaNO3，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.3g/LKH2PO4，1.0g/L酵母提取物，蒸馏水)中，于28℃、220rpm条件下培养6d。将发酵产物用乙酸乙酯萃取，离心，上清旋转蒸发去除有机试剂，获得甘露糖赤藓糖醇脂粗产物。采用硅胶柱层析纯化产物，首先将玻璃层析柱(3×40cm)洗净烘干，并用氯仿润湿。用200～300目硅胶湿法装柱，静置12h平衡，保证硅胶柱内无气泡。将粗产物1.0g溶于3mL氯仿，上样。用600mL有机溶剂氯仿:丙酮＝7:3洗脱得到组分，控制洗脱速率为0.8mL/min。洗脱的组分旋转蒸发去除有机试剂，得到MEL-A。
步骤(1)中，将甘露糖赤藓糖醇脂(MEL-A)溶于第一溶剂中得到溶液甲，其中，所述第一溶剂为正己烷、氯仿或乙醚，配制所得溶液甲的浓度为15.0～20.0mg/L。优选的，配制所得溶液甲的浓度为15.0～17.5mg/L。
优选的，步骤(1)中，使用甘露糖赤藓糖醇脂和磷脂混合物替换甘露糖赤藓糖醇脂。进一步的，将甘露糖赤藓糖醇脂和磷脂按照1～4:1的质量比混合溶于第一溶剂中，配制所得溶液甲的浓度为15.0～25.0mg/L。其中，所述磷脂为二月桂酰基卵磷脂或大豆卵磷脂。
进一步优选的，甘露糖赤藓糖醇脂和磷脂的质量比为1～3:1。
步骤(2)中，所述的第二溶剂为蒸馏水或磷酸盐缓冲液，配制所得溶液乙的浓度为100.0～800.0mg/L。
其中，所述磷酸盐缓冲液pH为3.0～5.0、离子浓度为0.05～0.1M。
步骤(2)中，所述花色苷从富含花色苷的植物花、茎、叶、果实等原料中提取分离纯化得到，具体步骤为：按照每100g原料，加入440mL浓度为50％的柠檬酸酸化乙醇(pH3.0)，在40℃水浴中避光超声浸提60min。提取结束后，在4000rmp离心，上清液旋转蒸发浓缩为花色苷粗提液。在25℃条件下，将花色苷粗提液在AB-8型树脂吸附平衡5h，解吸平衡时间为4h，用75％乙醇溶液解吸。上样速率为2.0mL/min，上样体积为500mL粗提液，用3倍柱床体积的75％乙醇，以1.0mL/min洗脱速率洗脱。将洗脱液旋转蒸发浓缩，得到花色苷。
步骤(2)中，所述花色苷也可以直接购买获取，CAS：7084-84-4，6906-38-3，18466-51-8。
步骤(3)中，将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液按照体积比1～5:1混匀。
优选的，所述甲、乙溶液体积比，优选为2～4:1。
步骤(3)中，超声处理温度为30～40℃，时间为5～10min，超声功率为100～300W，静置15～20min。
步骤(3)中，旋转蒸发仪的真空度为0.001～0.1MPa，转速为10～120rpm，温度为35～55℃。
步骤(4)中，向步骤(3)所得脂质膜中加pH 5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.22～0.45μm滤膜，得到脂质体悬液。
步骤(5)中，向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为5.0％～12.0％冻干保护剂，冻干保护剂为甘露醇、蔗糖、海藻糖或麦芽糊精。
优选的，步骤(5)中，所述冻干保护剂为质量分数为10.0％的甘露醇、8.0％的海藻糖或10.0％的蔗糖。
进一步的，步骤(5)中，真空冷冻干燥的温度为-10～-50℃，真空度为0.001～0.1MPa，时间为48～72h。
采用上述制备方法制备所得花色苷脂质体冻干粉也在本发明的保护范围内。
有益效果：本发明专利将甘露糖赤藓糖醇脂MEL-A用于花色苷脂质体的制备，一方面丰富了脂质体制备的壁材来源，另一方面获得了一种新型的花色苷脂质体冻干粉；制备所得花色苷脂质体冻干粉稳定性好、易保存、生物利用度高，可应用于食品和化妆品领域；制备方法中所用材料安全无毒，方法简单、成本低。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出详细说明。
二月桂酰基卵磷脂：CAS：127641-86-5。
大豆卵磷脂：CAS：8002-43-5。
甘露糖赤藓糖醇脂MEL-A的制备：
由Ustligo maydis或Pseudazyma属菌种发酵合成MELs，再经分离纯化得到甘露糖赤藓糖醇脂MEL-A，纯度为95％以上。具体包括如下步骤：
菌种Pseudozyma aphidis DSMZ70725购买于德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)；Ustligo maydis(编号5.203)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)。将上述购买的菌株之一转接于斜面培养基(3.0g/L酵母提取物，3.0g/L麦芽提取物，5.0g/L蛋白胨，10.0g/L葡萄糖，15.0g/L琼脂，蒸馏水)中，28℃下活化2d，然后将其转接到液体培养基(4.0g/L葡萄糖，3.0g/L NaNO3，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.3g/L KH2PO4，1.0g/L酵母提取物，蒸馏水，pH 6.0)中，于28℃、220rpm条件下培养3d。将培养好的种子液接入试验设计的发酵培养基(85mL/L大豆油，3.0g/L NaNO3，0.3g/L MgSO4·7H2O，0.3g/L KH2PO4，1.0g/L酵母提取物，蒸馏水)中，于28℃、220rpm条件下培养6d。将发酵产物用乙酸乙酯萃取，离心，上清旋转蒸发去除有机试剂，获得甘露糖赤藓糖醇脂粗产物。采用硅胶柱层析纯化产物，首先将玻璃层析柱(3×40cm)洗净烘干，并用氯仿润湿。用200～300目硅胶湿法装柱，静置12h平衡，保证硅胶柱内无气泡。将粗产物1.0g溶于3mL氯仿，上样。用600mL有机溶剂氯仿:丙酮＝7:3洗脱得到组分，控制洗脱速率为0.8mL/min。洗脱的组分旋转蒸发去除有机试剂，得到MEL-A。
花色苷的制备：
从富含花色苷的植物花、茎、叶、果实等原料中提取分离纯化得到，具体步骤为：按照每100g原料，加入440mL浓度为50％的柠檬酸酸化乙醇(pH3.0)，在40℃水浴中避光超声浸提60min。提取结束后，在4000rmp离心，上清液旋转蒸发浓缩为花色苷粗提液。在25℃条件下，将花色苷粗提液在AB-8型树脂吸附平衡5h，解吸平衡时间为4h，用75％乙醇溶液解吸。上样速率为2.0mL/min，上样体积为500mL粗提液，用3倍柱床体积的75％乙醇，以1.0mL/min洗脱速率洗脱。将洗脱液旋转蒸发浓缩，得到花色苷。
其中花色苷也可以直接购买获取。
花色苷脂质体的性能评价方法：
(1)花色苷脂质体的热稳定性评价是将花色苷脂质体溶于蒸馏水(pH3.0)，溶液分别置于50℃、60℃和70℃恒温水浴6h，每隔2h测定A520值，计算热降解率(P)：P＝(1-A/A0)×100％。式中:A为花色苷或花色苷脂质体加热后的吸光值，A0为花色苷或花色苷脂质体的初始吸光值。
(2)花色苷脂质体的包封率测定是将花色苷脂质体冻干粉溶于蒸馏水(pH3.0)，在12000rmp条件下离心20min，取上清，并向脂质体沉淀中加入甲醇和氯仿。采用高效液相色谱法测定脂质体和上清中花色苷的含量。计算公式：N(％)＝C/C0×100％，其中，C是脂质体中包封的花色苷含量，C0是脂质体花色苷的总量。
(3)花色苷脂质体冻干粉的性能参数通过评价花色苷脂质体冻干粉的色泽、冻干粉形态、溶解性来实现。
(4)体外抗氧化性评价是主要考察花色苷及花色苷脂质体的1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)自由基清除能力。取不同浓度0～60μg/mL的花色苷脂质体溶液4.0mL加入1.0mL 0.2mM DPPH甲醇溶液，混匀，于避光条件下静置30min，测定波长515nm下的OD值。对照为花色苷溶液。根据公式计算花色苷脂质体对DPPH自由基的清除率：自由基清除率(100％)＝[(A0-A1)/A0]×100，A0为DPPH的OD值(空白对照)，A1为含有样品的DPPH溶液的OD值。
(5)花色苷脂质体的生物利用度评价：主要考察花色苷及花色苷脂质体对人结肠癌细胞细胞株HT-29的抑制率。采用的MTT方法如下：将对数生长期细胞接种于96孔板，细胞密度约为105个/孔，培养24h后，每孔加入50～400μg/mL的花色苷及花色苷脂质体溶液100μL，每组设6个平行，对照孔加入RPMI-160培养液，继续培养24h。后取出并甩出孔内培养液，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，放入CO2培养箱继续培养4h。取出96孔板，每孔加入150μLDMSO，水平振荡器摇动，使孔内甲臜充分溶解，然后用酶标仪测定490nm的吸光度值。抑制率＝(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100％。采用药物抑制浓度Logit法计算花色苷及花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度(IC50)。
实施例1
一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将制备所得甘露糖赤藓糖醇脂MEL-A溶于正己烷中得到浓度为15.0mg/L的溶液；
(2)将花色苷溶解在蒸馏水中得到浓度为100.0mg/L的溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液按照体积比1:1混匀，在30℃、功率为100W下超声处理为5min，静置15min；然后置于旋转蒸发仪(真空度为0.1MPa，转速为120rpm，温度为55℃)中减压蒸发得到脂质膜；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入pH 5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.22μm滤膜，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为10.0％的甘露醇，在-10℃、真空度为0.001MPa下冷冻干燥48h即可。
根据花色苷脂质体的性能评价方法，测得花色苷脂质体的热降解率为50℃(9.21％)、60℃(20.01％)、70℃(23.45％)，对照花色苷的热降解率为50℃(9.67％)、60℃(19.54％)、70℃(35.42％)。花色苷脂质体呈紫色，形态松散，溶解性好，对花色苷的包封率为74.74％。对DPPH自由基的清除率IC50为123.25μg/mL，但高于对照组的89.14μg/mL。体外抑制细胞增殖实验显示，花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度IC50为135.50μg/mL(对照组花色苷的285.10μg/mL)。以上说明制备所得花色苷脂质体热稳定性好，生物利用度高。
实施例2
一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将制备所得甘露糖赤藓糖醇脂MEL-A溶于氯仿中得到浓度为20.0mg/L的溶液甲；
(2)将花色苷溶解在蒸馏水中得到浓度为300.0mg/L的溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液按照体积比3:1混匀，在40℃、功率为300W下超声处理为10min，静置20min；然后置于旋转蒸发仪(真空度为0.1MPa，转速为100rpm，温度为45℃)中减压蒸发得到脂质膜；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入pH 5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.45μm滤膜，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为10.0％的蔗糖，在-50℃、真空度为0.01MPa下冷冻干燥72h即可。
根据花色苷脂质体的性能评价方法，测得花色苷脂质体的热降解率为50℃(9.88％)、60℃(19.00％)、70℃(32.11％)，对照花色苷的热降解率为50℃(9.67％)、60℃(19.54％)、70℃(35.42％)。花色苷脂质体呈浅紫色，形态较松散，溶解性好，对花色苷的包封率为73.78％。对DPPH自由基的清除率IC50为89.40μg/mL，与对照组的89.14μg/mL差异不大。体外抑制细胞增殖实验显示，花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度IC50为180.62μg/mL(对照组花色苷的285.10μg/mL)。以上说明花色苷脂质体热稳定性好，生物利用度高。
实施例3
一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将制备所得甘露糖赤藓糖醇脂MEL-A溶于乙醚中得到浓度为17.5mg/L的溶液甲；
(2)将花色苷溶解在蒸馏水中得到浓度为800.0mg/L的溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液按照体积比4:1混匀，在30℃、功率为200W下超声处理为8min，静置18min；然后置于旋转蒸发仪(真空度为0.1MPa，转速为100rpm，温度为40℃)中减压蒸发得到脂质膜；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入pH 5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.25μm滤膜，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为8.0％的海藻糖，在-30℃、真空度为0.05MPa下冷冻干燥50h即可。
根据花色苷脂质体的性能评价方法，测得花色苷脂质体的热降解率为50℃(8.21％)、60℃(16.32％)、70℃(35.01％)，对照花色苷的热降解率为50℃(9.67％)、60℃(19.54％)、70℃(35.42％)。花色苷脂质体呈紫色，形态松散，溶解性较好，对花色苷的包封率为72.15％。对DPPH自由基的清除率IC50为65.20μg/mL，与低于对照组的89.14μg/mL。体外抑制细胞增殖实验显示，花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度IC50为154.68μg/mL(对照组花色苷的285.10μg/mL)。以上说明花色苷脂质体热稳定性好，生物利用度高。
实施例4
一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将制备所得甘露糖赤藓糖醇脂和大豆卵磷脂按照1:1的质量比混合溶于正己烷中，配制得浓度为15.0mg/L的溶液甲；
(2)将花色苷溶解在蒸馏水中得到浓度为500.0mg/L的溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液按照体积比2:1混匀，在35℃、功率为150W下超声处理为6min，静置20min；然后置于旋转蒸发仪(真空度为0.1MPa，转速为120rpm，温度为45℃)中减压蒸发得到脂质膜；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入pH 5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.35μm滤膜，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为10.0％的甘露醇，在-40℃、真空度为0.008MPa下冷冻干燥50h即可。
根据花色苷脂质体的性能评价方法，测得花色苷脂质体的热降解率为50℃(3.42％)、60℃(10.21％)、70℃(20.20％)，对照花色苷的热降解率为50℃(9.67％)、60℃(19.54％)、70℃(35.42％)。花色苷脂质体呈淡紫色，形态松散，溶解性较好，对花色苷的包封率为86.24％。对DPPH自由基的清除率IC50为103.64μg/mL，但略高于对照组的89.14μg/mL。体外抑制细胞增殖实验显示，花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度IC50为154.27μg/mL(对照组花色苷的285.10μg/mL)。以上说明花色苷脂质体热稳定性良好，生物利用度高。
实施例5
一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将制备所得甘露糖赤藓糖醇脂和二月桂酰基卵磷脂按照2:1的质量比混合溶于氯仿中，配制所得溶液甲的浓度为25.0mg/L；
(2)将花色苷溶解在pH为3.0～5.0、离子浓度为0.05～0.1M磷酸盐缓冲液中得到浓度为200.0mg/L的溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液按照体积比4:1混匀，在35℃、功率为300W下超声处理为5min，静置20min；然后置于旋转蒸发仪(真空度为0.1MPa，转速为120rpm，温度为40℃)中减压蒸发得到脂质膜；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入pH 5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.40μm滤膜，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为10.0％的蔗糖，在-20℃、真空度为0.008MPa下冷冻干燥50h即可。
根据花色苷脂质体的性能评价方法，测得花色苷脂质体的热降解率为50℃(5.19％)、60℃(11.19％)、70℃(15.65％)，对照花色苷的热降解率为50℃(9.67％)、60℃(19.54％)、70℃(35.42％)。花色苷脂质体呈淡紫色，形态松散，溶解性良好，对花色苷的包封率为81.23％。对DPPH自由基的清除率IC50为110.55μg/mL，但略高于对照组的89.14μg/mL。体外抑制细胞增殖实验显示，花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度IC50为180.60μg/mL(对照组花色苷的285.10μg/mL)。以上说明花色苷脂质体热稳定性良好，生物利用度高。
实施例6
一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将制备所得甘露糖赤藓糖醇脂和二月桂酰基卵磷脂按照3:1的质量比混合溶于乙醚中，配制所得溶液甲的浓度为20.0mg/L；
(2)将花色苷溶解在pH为3.0～5.0、离子浓度为0.05～0.1M磷酸盐缓冲液中得到浓度为600.0mg/L的溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液按照体积比3:1混匀，在40℃、功率为100W下超声处理为10min，静置15min；然后置于旋转蒸发仪(真空度为0.1MPa，转速为80rpm，温度为35℃)中减压蒸发得到脂质膜；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入pH 5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.38μm滤膜，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为8.0％的海藻糖，在-40℃、真空度为0.002MPa下冷冻干燥72h即可。
根据花色苷脂质体的性能评价方法，测得花色苷脂质体的热降解率为50℃(3.41％)、60℃(8.33％)、70℃(8.66％)，对照花色苷的热降解率为50℃(9.67％)、60℃(19.54％)、70℃(35.42％)。花色苷脂质体呈浅紫色，形态较松散，但略有皱缩，溶解性较好，对花色苷的包封率为90.74％。对DPPH自由基的清除率IC50为88.25μg/mL，略低于对照组的89.14μg/mL。体外抑制细胞增殖实验显示，花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度IC50为149.50μg/mL(对照组花色苷的285.10μg/mL)。以上说明花色苷脂质体热稳定性良好，生物利用度高。
对比例1
根据中国发明专利(申请号：CN201610054330.8)公开的一种杨梅花色苷纳米脂质体的制备方法制备了花色苷脂质体悬液，并将其制备成冻干粉。具体如下：
(1)将大豆卵磷脂与胆固醇(4.0mg/1.0mg)的比例溶解在乙醚中得溶液A，其中，固液比(mg/mL)为4:1；(2)将花色苷100mg溶解在1.0L pH7.4的磷酸盐缓冲液溶解稀释，得溶液B；(3)将A、B液按体积比1:1混合，先经磁力搅拌及水浴超声仪超声处理，再经磁力搅拌处理，使混合液变成澄清的单相，然后将混合液置于旋转蒸发仪中减压蒸发直至形成一层脂质薄膜；(4)向脂质薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；(5)将溶液C过滤膜，超声，放4℃冰箱中保存，即得花色苷的脂质体悬液；(6)将悬液加入10.0％甘露醇冻干保护剂，冷冻干燥制得花色苷脂质体冻干粉。
对此花色苷脂质体的性能进行了评价。测得该花色苷脂质体的热降解率为50℃(9.35％)、60℃(20.32％)、70℃(36.22％)。花色苷脂质体冻干粉呈紫色，形态松散，复水性好，花色苷脂质体的包封率为71.09％。对DPPH自由基的清除率IC50为92.04μg/mL。体外抑制细胞增殖实验显示，该花色苷脂质体对HT-29细胞株的半抑制浓度IC50为200.44μg/mL。
实施例1-6中利用甘露糖赤藓糖醇脂以及磷脂为壁材所制备的花色苷脂质体与对比例1相比，具有较好的热稳定性和生物利用度。

Claims (4)

1.一种花色苷脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将甘露糖赤藓糖醇脂溶于第一溶剂中得到溶液甲；
(2)将花色苷溶解在第二溶剂中得到溶液乙；
(3)将步骤(1)得到的甲溶液和步骤(2)得到的乙溶液混匀，超声处理后静置，然后置于旋转蒸发仪中减压蒸发得到脂质膜；其中，甲溶液和乙溶液按照体积比1～5:1混匀；
(4)向步骤(3)所得脂质膜中加入pH5.0～7.0、离子浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，搅拌溶解后过0.22～0.45μm滤膜，得到脂质体悬液；
(5)向步骤(4)所得脂质体悬液中加入冻干保护剂，经冷冻干燥即可；
步骤(1)中，所述第一溶剂为正己烷、氯仿或乙醚，配制所得溶液甲的浓度为15.0～20.0mg/L；
步骤(2)中，所述的第二溶剂为蒸馏水或磷酸盐缓冲液，配制所得溶液乙的浓度为100.0～800.0mg/L；
步骤(1)中，所述甘露糖赤藓糖醇脂是由Ustligo maydis或Pseudazyma属菌株发酵合成，再经分离纯化得到，纯度为95％以上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，使用甘露糖赤藓糖醇脂和磷脂混合物替换甘露糖赤藓糖醇脂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将甘露糖赤藓糖醇脂和磷脂按照1～4:1的质量比混合溶于第一溶剂中，配制所得溶液甲的浓度为15.0～25.0mg/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，向步骤(4)所得脂质体悬液中加入质量分数为5.0％～12.0％冻干保护剂，冻干保护剂为甘露醇、蔗糖、海藻糖或麦芽糊精。
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