CN116396990A - 一种利用微生物转化花色苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，更具体地，涉及一种利用微生物转化花色苷的方法，包括以下步骤：S1、采用冰冻的蓝莓，加入提取剂，进行超声粉碎，固液分离；S2、加入细胞培养基；S3、进行灭菌处理；S4、接种微生物，采用两步培养的方法进行细胞培养，加入抗氧化剂；S5、将细胞通透剂加入到S4的产物中，进行超声处理，进行离心，取上清液；S6、将多孔材料加入到上清液中，以多孔材料进行吸附，然后进行分离之后用乙醇作为解析溶剂进行解析，分离出多孔材料，收集解吸液，去除解吸液后获得花色苷。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地，涉及一种利用微生物转化花色苷的方法。
背景技术
花色苷(anthocyanin)是一类类黄酮化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中。由于其独特的功能性，而被应用于清除体内自由基、增殖叶黄素、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抑制脂质过氧化和血小板凝集、预防糖尿病、减肥、保护视力等。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，且对人体具有许多保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。
花色苷的高度不稳定性是其微生物生产过程中面临的一个难题。在植物中，花色苷合成后稳定的存储在液泡中，与植物不同的是，细菌细胞作为人工生产的宿主缺乏花色苷稳定机制。
基于此，本发明提供一直可以保持花色苷稳定性的生物转化的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用微生物转化花色苷的方法，以提高花色苷的稳定性。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种利用微生物转化花色苷的方法，包括以下步骤：
S1、采用冰冻的蓝莓，加入提取剂，进行超声粉碎，固液分离；
S2、加入细胞培养基；
S3、进行灭菌处理；
S4、接种微生物，采用两步培养的方法进行细胞培养，加入抗氧化剂；
S5、将细胞通透剂加入到S4的产物中，进行超声处理，进行离心，取上清液；
S6、将多孔材料加入到上清液中，以多孔材料进行吸附，然后进行分离之后用乙醇作为解析溶剂进行解析，分离出多孔材料，收集解吸液，去除解吸液后获得花色苷。
进一步的，在步骤S1中，超声波的频率为100-120W；超声时间为10分钟，这是因为随着超声时间的延长，粒径逐渐增大，短时间超声促进了花色苷的溶解，而长时间超声使分子聚集。超声处理主要通过改变花色苷分子间的相互作用，从而影响花色苷的稳定性。
进一步的，所述步骤S4中的培养条件为：第一步培养条件为pH为7，温度为30℃，培养3天，第二步培养条件为pH为5，温度为40℃，培养1天。在pH 7的培养基中培养细胞，可以维持细胞正常生长和外源酶表达；第二部的培养可以减少花色苷降解。
进一步的，所述步骤S2中的培养基包括牛肉膏粉12-13g/L、酵母膏粉4-4.5g/L，葡萄糖25-30g/L、乙酸钠5.0-5.5 g/L、硫酸镁0.2-0.3 g/L、磷酸氢二钾2.5-3.5g/L、柠檬酸三铵3.0-3.5g/L、硫酸锰0.06-0.08 g/L、吐温-801.25-1.35g/L。
进一步的，所述步骤S4中的微生物为嗜热栖热菌。
进一步的，所述步骤S4中的抗氧化剂为儿茶素，此外，添加相应的抗氧化剂在低pH值条件下维持细胞生存，也可以防止花色苷的稳定性，进而提高花色苷的产量。
进一步的，所述步骤S5中的细胞通透剂为多面体低聚倍半硅氧烷，细胞通透剂可以改变微生物细胞膜的通透性，使得到的产物全面释放。
进一步的，所述步骤S6中的多孔材料为联苯二甲酸和九水合硝酸铬通过水热法合成。
进一步的，1mmol的联苯二甲酸和1mmol九水合硝酸铬置于反应釜中，加入3.5mL水和0.03mL氢氟酸，然后180℃保持24h，反应完成后，降温至室温，离心取下层沉淀。
联苯二甲酸和九水合硝酸铬通过水热法合成采用的溶剂为水，因为花色苷具有水溶性的特点因此可以进入到多孔材料的孔道内，以此实现与其他物质的分离，另外，所述多孔材料内部具有大量的吸附位点也可以与花色苷结构中含有的大量羟基和苯环结构产生相互作用，使得得到的花色苷完全被吸附，避免了花色苷的浪费，提高了花色苷产量。
本发明的有益技术效果：本发明通过利用抗氧化剂的加入，以及二次培养的方法，避免了花色苷的降解，提高了花色苷的产率，通过多孔材料的吸附，提高了花色苷的纯度。
具体实施方式
实施例1
一种利用微生物转化花色苷的方法,包括以下步骤：
S1、采用冰冻的蓝莓，加入提取剂，进行超声粉碎，超声波的频率为100-120W；固液分离；
S2、加入细胞培养基；
S3、进行灭菌处理；
S4、接种微生物，采用两步培养的方法进行细胞培养，加入抗氧化剂；
S5、将细胞通透剂加入到S5的产物中，进行超声处理，进行离心，取上清液；
S6、将多孔材料加入到上清液中，以多孔材料进行吸附，然后进行分离之后用乙醇作为解析溶剂进行解析，分离出多孔材料，收集解吸液，去除解吸液后获得花色苷；
在本实施例中，所述步骤S4中的培养条件为：第一步培养条件为Ph为7，温度为30℃，培养3天，第二步培养条件为Ph为5，温度为40℃，培养1天。
在本实施例中，所述步骤S4中的微生物为嗜热栖热菌。
在本实施例中，所述步骤S4中的抗氧化剂为儿茶素。
在本实施例中，所述步骤S5中的细胞通透剂为多面体低聚倍半硅氧烷。
在本实施例中，所述步骤S6中的多孔材料为联苯二甲酸和九水合硝酸铬通过水热法合成。具体为：1mmol的联苯二甲酸和1mmol九水合硝酸铬置于反应釜中，加入3.5mL水和0.03mL氢氟酸，然后180℃保持24h，反应完成后，降温至室温，离心取下层沉淀。
实施例2
本实施例与实施例1相比，区别在于实施例2选用了微生物为大肠杆菌；
实施例3
本实施例与实施例1相比，区别在于实施例3未加入细胞通透剂，直接离心。
实施例4
本实施例与实施例1相比，区别在于未经过多孔材料的吸附，直接利用柱层析的方法进行产物的分离。
实施例5
本实施例与实施例1相比，区别在于步骤S4中的培养方法采用直接的pH为8，温度为30℃，培养4天。
结论：
（1）采用pH视差法，测定实施例1和实施例2、实施例3得到的花色苷的产率，对比结果发现，实施例2和实施例3的产量明显低于实施例1红的花色苷的产量。
（2）通过对比实施例1和实施例4，对两者得到的产物进行色价的对比，结果发现，实施1的色价要明显高于实施例4，这也说明了通过多孔材料的吸附后，产品的纯度得到提升，同时，多孔材料吸附，实现了孔道内吸附剂和待分离物质的的位点结合，避免了花色苷出现不稳定的降解，因此色价会降低。
（3）通过对比实施例1和实施例5,结果发现，实施例5的产物的色价也明显低于实施例1，这是因为缺少低pH条件下的二次培养，使得花色苷一直处于相对较高的pH条件下即中性甚至是碱性条件下,花色苷的稳定性较差，但是在酸性稳定性较好。
Claims (7)
1.一种利用微生物转化花色苷的方法,包括以下步骤：
S1、采用冰冻的蓝莓，加入提取剂，进行超声粉碎，超声波的频率为100-120W；固液分离；
S2、加入细胞培养基；
S3、进行灭菌处理；
S4、接种微生物，采用两步培养的方法进行细胞培养，加入抗氧化剂；
S5、将细胞通透剂加入到S4的产物中，进行超声处理，进行离心，取上清液；
S6、将多孔材料加入到上清液中，以多孔材料进行吸附，然后进行分离之后用乙醇作为解析溶剂进行解析，分离出多孔材料，收集解吸液，去除解吸液后获得花色苷。
2.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S4中的培养条件为：第一步培养条件为Ph为7，温度为30℃，培养3天，第二步培养条件为Ph为5，温度为40℃，培养1天。
3.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S4中的微生物为嗜热栖热菌。
4.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S4中的抗氧化剂为儿茶素。
5.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S5中的细胞通透剂为多面体低聚倍半硅氧烷。
6.根据权利要求1所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：所述步骤S6中的多孔材料为联苯二甲酸和九水合硝酸铬通过水热法合成。
7.根据权利要求6所述的利用微生物转化花色苷的方法，其特征在于：1mmol的联苯二甲酸和1mmol九水合硝酸铬置于反应釜中，加入3.5mL水和0.03mL氢氟酸，然后180℃保持24h，反应完成后，降温至室温，离心取下层沉淀。
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