CN106613931A - 日本栗2n花粉诱导方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属果树育种技术领域，公开了一种日本栗2n花粉诱导方法及其应用，包括如下步骤：1)选择诱导材料；2)配制诱导药剂；3)诱导药剂浸渍花序；4)花序散粉前套袋；5)花粉收集。本发明具有以下优点：第一通过选择日本栗‘XY‑1’的雄花枝上的花序为处理材料；第二选用特定成分、特定浓度和特定配比的2n花粉诱导药剂；第三选择诱导药剂处理花序特定时期为每年4月25日前后；第四采用脱脂棉包裹花序并使其在药剂浸渍状态下保持72h。以上述4个综合措施来共同达到日本栗花粉中2n花粉比率提高的目的，采用该发明方法处理日本栗花序可诱导产生大比率2n花粉，为日本栗倍性育种提供方法参考。
Description
技术领域
本发明属于果树育种技术领域，具体涉及日本栗2n花粉诱导方法及其应用。
背景技术
品种是一个产业得以健康发展的重要保证，也是永恒的基础需求。目前，国内外培育新品种的方式有很多，主要包括：实生选种、芽变选种、杂交育种、辐射育种、转基因育种、多倍体育种等，其中多倍体育种一直是应用普遍、育种效果突出的新品种培育方式之一。多倍体是指具有三套或者三套以上完整染色体组的所有个体。染色体组加倍使植物体可用的遗传物质增加，重复的基因可能会发生功能分化，从而使多倍体物种在自然选择中具有更大环境适应优势，如更强的抗旱能力、抗病虫害能力、无融合生殖等，使植物可以适应更广泛的自然环境(Rieseberg等，2003)。
目前，多倍体育种的途径主要包括：从自然界选择天然多倍体植株；利用不同倍性水平植株杂交；利用天然或人工诱导2n花粉(2n雄配子)授粉；利用天然或者人工诱导2n雌配子杂交以及体细胞染色体加倍等。业已证实，利用2n配子杂交是获得植物多倍体的一种高效方式。2n配子是指在减数分裂过程中某些因素导致形成具有体细胞染色体数的花粉或卵细胞，其在植物界普遍发生，目前至少26个科的60个属中发现能产生2n配子的植物种(张正海，2008；Nassar，2001)。特别是2n花粉(具有体细胞染色体数的花粉)，由于其与正常倍性花粉在形态及大小方面存在差异，易于识别和鉴定，广泛应用于植物多倍体育种(杨倩等，2015)。国内外学者多年育种实践证实，利用化学药剂诱导出2n花粉与二倍体雌株杂交，是迅速获得三倍体的有效途径之一，而提高2n花粉产生频率是利用2n花粉进行多倍体育种成败的关键(向素琼等，2005；杨倩等，2015)。
在植物雌雄配子多倍化诱导过程中，由于各物种间遗传物质、器官构成、发育时期和方式等因素千差万别，其达到好的多倍化诱导效果所需的药剂、剂量、时间、材料和方法等因素也各不相同(吴潇等，2016)。栗属植物的遗传背景复杂，保守性强，其自然花粉中2n花粉的比率不足1‰，由于其比率过低，无法直接利用其自然花粉中2n花粉进行多倍体育种实践；在目前的相关研究中，尚未发现有关成功诱导出栗属植物大频率2n花粉的报道。因此，选择以日本栗(Castanre crenata)为材料，筛选其适宜的诱导药剂、剂量、时期、部位等因素，创建一套植株2n花粉诱导技术，获得大频率2n花粉，为今后提供一种切实可行的2n花粉诱导方法，从而为栗属植物多倍体育种提供方法参考。
发明内容
为了克服日本栗自然花粉中2n花粉比率过低(无法直接应用于育种实践)，弥补大频率日本栗2n花粉人工诱导方法空白，本发明旨在提供一种日本栗2n花粉诱导方法，该方法可以获得大频率2n花粉。
实现本发明目的的技术方案为：
一种日本栗2n花粉诱导方法，包括如下步骤：
1)选择诱导材料
选择花序长、花朵多、花粉量充足的日本栗‘XY-1’(Castanea crenata)的雄花枝上的花序为诱导处理材料。
2)配制诱导药剂
于采用诱导药剂处理花序前2天配制好诱导药剂，又到药剂包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亚砜；配置方法：称取5g秋水仙素加蒸馏水溶解，之后加入1ml二甲基亚砜，最后用蒸馏水定容至1000ml]，置于4℃冰箱中备用。
3)诱导药剂浸渍花序
选择日本栗健康无病、生长健壮的雄花枝，每条雄花枝上保留5个花序为处理对象，多余疏除。诱导药剂处理花序时期为每年4月25日前后，以日本栗花序基部直径不超过3mm，长度不超过7cm，花朵未凸起为标准。将选用的雄花枝上的每条花序单独用脱脂棉包好，棉层厚度1mm，保留花序着生部位叶片；之后用塑料条将雄花枝上所有包裹好脱脂棉的花序连同其着生部位叶片自下而上封好，留有适当透气缝隙；塑料条厚度0.06mm，宽度3cm；用医用一次性注射器将配置好的诱导药剂注射在包裹好花序的脱脂棉上，直至脱脂棉吸收诱导药剂至饱和状态，如此使日本栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下保持72h；之后拆除塑料条，去除花序上的脱脂棉，将药剂处理后的花序重新暴露在空气中。
4)花序散粉前套袋
在日本栗花朵开放前，大约每年6月5日，将诱导药剂处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，封口，以防止该花序上混入其它花粉。
5)花粉收集
待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期，此时花粉已成熟，将硫酸纸袋和花序一同采下，带回实验室，置于阴凉干燥处24h，之后收集袋中自然散落的花粉，即获得大频率日本栗2n花粉。
本发明所述的一种日本栗2n花粉诱导方法是在日本栗多倍体育种中的应用。
本发明的有益效果在于：
日本栗花序采用此方法处理后，可以获得大比率2n花粉，试验证实：处理的日本栗花序所产生的花粉中2n花粉比率高达12.4％。自然界中的日本栗花粉中2n花粉的比率不足1‰，试验证实：对照日本栗花序花粉中2n花粉的比率为0.03‰，无法直接利用其进行多倍体育种实践。本发明日本栗2n花粉诱导方法：第一通过选择花粉量充足的日本栗‘XY-1’的雄花枝上的花序为处理材料；第二选用以秋水仙素为诱导剂、二甲基亚砜为助渗剂的特定成分、特定浓度和特定配比的2n花粉诱导药剂，诱导药剂包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亚砜；第三选择诱导药剂处理花序特定时期为每年5月17日前后；第四采用脱脂棉包裹花序并使其在药剂浸渍状态下保持72h。以上述4个综合措施来共同达到诱导日本栗花粉中2n花粉比率提高的目的，获得大比率日本栗2n花粉。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例及对比例中所用药剂、脱脂棉、塑料条、医用一次性注射器、硫酸纸袋等材料均可市购。
对比例1
对比例1所用试验材料位于河北省昌黎果树研究所板栗育种基地。按下述方法进行日本栗2n花粉诱导试验。
试验随机区组设计，单株小区，3次重复，以未处理‘XY-1’花序为对照。该试验以诱导药剂(4个水平)、诱导药剂处理花序时期(5个水平)和药剂浸渍花序时长(3个水平)为因素，进行完全试验设计，共60个处理(见表1)。按照下述步骤进行日本栗2n花粉诱导操作：
1)选择诱导材料
选择花序长、花朵多、花粉量充足的日本栗‘XY-1’(Castanea crenata)的雄花枝上的花序为处理材料。
2)配制诱导药剂
于采用诱导药剂处理花序前2天配制好各处理所需诱导药剂(见表1)，置于4℃冰箱中备用。
3)诱导药剂浸渍花序
选择日本栗‘XY-1’健康无病，生长健壮的雄花枝，每条雄花枝上保留5个花序为处理对象，多余疏除。各处理的诱导药剂处理花序时期按照表1所列执行。将选用的雄花枝上的每条花序单独用脱脂棉包好，棉层厚度1mm，保留花序着生部位叶片；之后用塑料条(厚度0.06mm，宽度3cm)将雄花枝上所有包裹好脱脂棉的花序连同其着生部位叶片自下而上缠好，留有适当透气缝隙；用医用一次性注射器将配置好的诱导药剂注射在包裹好花序的脱脂棉上，直至脱脂棉吸收诱导药剂至饱和状态，如此使日本栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下保持24—72h(各处理所用时长见表1)；之后拆除塑料条，去除花序上的脱脂棉，将药剂处理后的花序重新暴露在空气中。
4)花序散粉前套袋
在日本栗花朵开放前(6月5日)，将诱导药剂处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，封口，以防止该花序上混入其它花粉。
5)花粉收集
待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期，此时花粉已成熟，将硫酸纸袋和花序一同采下，带回实验室，置于阴凉干燥处24h，之后收集袋中自然散落的花粉。
6)2n花粉检测
随机选取收集的部分花粉，经卡诺固定液V(乙醇)：V(乙酸)＝3：1固定24—48h。将固定好的花粉制成临时涂片，45％醋酸洋红染液染色20min，置于显微镜上观察。根据花粉的直径判断是否为2n花粉，并计算比例。每个处理单次随机检测500个花粉，重复3次。SPSS20.0进行数据统计分析。
所有花粉检测均在Olympus BX-51光学显微镜下观察，Olympus DP70照相系统数码摄相。
表1试验设计各处理的相关因素
7)实施效果
由表2可见，不同处理诱导出的日本栗2n花粉比率不尽相同，处理ch-1～60诱导出的日本栗2n花粉比率均高于自然日本栗花粉(CK)，所有处理中诱导产生2n花粉比率最高的为ch-12，其诱导产生的日本栗2n花粉比率为12.4％，显著高于对照(日本栗自然花粉中2n花粉比率为0.067％)，亦显著高于其它处理产生的2n花粉。
由此可见，以诱导产生的2n花粉比率为评价指标，ch-12处理中各因素组合为最佳，诱导产生的2n花粉比率是所有处理中最高的(可获得高达12.4％的日本栗2n花粉)。换言之，在以获得大频率2n花粉为目的的前提下，选用诱导药剂，诱导药剂包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亚砜，于4月25日处理花序，并保持药剂浸渍花序72h的处理，可以取得理想的试验结果。
表2日本栗2n花粉诱导效果
| 处理代号 | 2n花粉比率(％) | 处理代号 | 2n花粉比率(％) |
| ch-1 | 0.33uv | ch-32 | 1.13mnopq |
| ch-2 | 0.4tuv | ch-33 | 2.86ghi |
| ch-3 | 1.26mno | ch-34 | 0.66qrstu |
| ch-4 | 0.6rstuv | ch-35 | 1.93kl |
| ch-5 | 1.53lm | ch-36 | 5cd |
| ch-6 | 4.8de | ch-37 | 0.33uv |
| ch-7 | 0.33uv | ch-38 | 0.46tuv |
| ch-8 | 1nopqrs | ch-39 | 1.33mno |
| ch-9 | 2.86ghi | ch-40 | 0.33uv |
| ch-10 | 0.73pqrstu | ch-41 | 1.13mnopq |
| ch-11 | 2.66hij | ch-42 | 3gh |
| ch-12 | 12.4a | ch-43 | 0.26uv |
| ch-13 | 0.26uv | ch-44 | 0.66qrstu |
| ch-14 | 0.86opqrst | ch-45 | 3.26fg |
| ch-15 | 3.53f | ch-46 | 0.73pqrstu |
| ch-16 | 0.6rstuv | ch-47 | 1.33mno |
| ch-17 | 2.2jk | ch-48 | 4.53e |
| ch-18 | 5.4c | ch-49 | 0.26uv |
| ch-19 | 0.73pqrstu | ch-50 | 0.4tuv |
| ch-20 | 2.26jk | ch-51 | 1.4mn |
| ch-21 | 4.6de | ch-52 | 0.33uv |
| ch-22 | 1.06mnopqr | ch-53 | 0.53stuv |
| ch-23 | 2.86ghi | ch-54 | 2.2jk |
| ch-24 | 7.6b | ch-55 | 0.26uv |
| ch-25 | 0.13v | ch-56 | 0.66qrstu |
| ch-26 | 0.73pqrstu | ch-57 | 2.46jk |
| ch-27 | 1.93kl | ch-58 | 0.86opqrst |
| ch-28 | 0.33uv | ch-59 | 1.2mnop |
| ch-29 | 1nopqrs | ch-60 | 2.8ghi |
| ch-30 | 2.26jk | ck | 0.067w |
| ch-31 | 0.46tuv |
注:表中数据后不同字母表示差异显著(α＝0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实例，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对本方法的判别模型作出一定的补充和优化。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)选择诱导材料
选择日本栗品种的花序为诱导处理材料；
2)配制诱导药剂
于采用诱导药剂处理花序前2天配制好诱导药剂，置于4℃冰箱中备用；
3)诱导药剂浸渍花序
选择日本栗品种花枝上的花序为处理对象，诱导药剂处理花序时期为每年4月末；将选用的雄花枝上的每条花序单独用脱脂棉包好，保留花序着生部位叶片；之后用塑料条将雄花枝上所有包裹好脱脂棉的花序连同其着生部位叶片自下而上封好，留有适当透气缝隙；用医用一次性注射器将配置好的诱导药剂注射在包裹好花序的脱脂棉上，直至脱脂棉吸收诱导药剂至饱和状态，如此使日本栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下；之后拆除塑料条，去除花序上的脱脂棉，将药剂处理后的花序重新暴露在空气中；
4)花序散粉前套袋
在日本栗花朵开放前，将诱导药剂处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，封口，以防止该花序上混入其它花粉；
5)花粉收集
待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期，此时花粉已成熟，将硫酸纸袋和花序一同采下，带回室内室，置于阴凉干燥处24h，之后收集袋中自然散落的花粉，即获得大频率日本栗2n花粉。
2.根据权利要求1所述的日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，步骤1)所述日本栗品种为花序长、花朵多、花粉量充足的日本栗品种‘XY-1’，Castanea crenata。
3.根据权利要求1所述的日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，步骤1)所述花序为雄花枝上的花序。
4.根据权利要求1所述的日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，步骤2)所述诱导药剂包括W/V为0.5％的秋水仙素、V/V为0.1％的二甲基亚砜。
5.根据权利要求1所述的日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，步骤3)所述处理对象为日本栗品种‘XY-1’健康无病、生长健壮的雄花枝，其上保留的5个花序为处理对象。
6.根据权利要求1到4任一项所述的日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，步骤3)所述诱导药剂处理花序时期为每年4月末，以日本栗花序基部直径不超过3mm，长度不超过7cm，花朵之间未分离为标准。
7.根据权利要求1到4任一项所述的的日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，步骤3)所述用脱脂棉包好，棉层厚度1mm。
8.根据权利要求1到4任一项所述的日本栗2n花粉诱导方法，其特征在于，步骤3)所述使日本栗雄花枝上的花序在药剂浸渍状态下，保持72h。
9.根据权利要求1所述的日本栗2n花粉诱导方法的应用，其特征在于：该方法用于日本栗多倍体育种。
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