CN115176701A - 一种山桐子2n花粉的诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山桐子2n花粉的诱导方法，在山桐子雄花序花粉母细胞减数分裂发育至细线末期、粗线期或终变期，以化学诱变药剂对山桐子雄花序进行诱变处理，然后将诱变处理后的花序全部套入硫酸纸袋中，待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期时，收集花粉，即获得山桐子2n花粉；所述化学诱变药剂的组成为：0.1％‑0.4％(v/v)戊炔草胺和0.5％(v/v)二甲基亚砜混合水溶液。本发明不仅在克服毒害和使用成本的方面具有较大优势，还能获得较多数量的2n花粉，满足山桐子多倍体育种生产需求。

Description

一种山桐子2n花粉的诱导方法

技术领域

本发明属于多倍体育种领域，具体涉及一种山桐子2n花粉的诱导方法。

背景技术

山桐子(Idesia polycarpa Maxim.)又名油葡萄、水冬瓜、红果树等，是大风子科落叶乔木。山桐子具有环境适应性强、适生范围广、观赏价值高、材质好、果实产量高、含油高、油品好，盛果期长等多重优点，具有“树上油库”美誉，是一种极具开发前景的木本油料植物。目前，山桐子种植多是以野生或半野生母树采种繁育，种系杂乱，大小年严重，导致产量不稳定、综合效益差等突出问题。因此，加强山桐子种质资源创新，培育优质高产新品种已成为山桐子产业开发和利用中亟待解决的关键问题。种质资源是育种的物质基础，创制关键性的种质资源是培育具有突破性品种的关键，因此研究种质资源的创新方法对更好利用山桐子资源，培育具有突破性的山桐子新品种具有十分重要的意义。

植物种质资源创新和新品种选育的主要方式包括实生选育、芽变选育、杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、基因工程育种等。多倍体育种是山桐子种质资源创新和新品种选育的重要手段。多倍体是指体细胞中具有三个或者三个以上染色体组的个体，染色体组加倍常常带来形态和生理上的变化，如多倍体植株器官增大、代谢物含量增多、抗逆性增加。创制多倍体资源是开展山桐子多倍体育种的核心。多倍体资源的创制大致可以分为物理方法和化学方法。众多育种实践证实，利用化学方法诱导出2n花粉与二倍体雌株杂交，是获得三倍体最为直接有效的方式，而提高2n花粉产生频率是利用2n花粉进行多倍体育种成败的关键。目前，通过2n花粉诱导在杨树、橡胶、桦木、桑树、牡丹、银杏、木薯、山茶、苹果、枣、柑桔、百合等植物上均获得了多倍体，且大多表现出优于二倍体的特性。但对不同植物而言，达到好的多倍化诱导效果所需的药剂种类、处理剂量、有效处理时期、处理持续时间等关键环节不尽相同，诱导效果也参差不齐。

综上所述，通过诱导2n花粉方式培育山桐子多倍体前景广阔，具有重要的价值。在目前的相关研究中，在山桐子领域尚未有关2n花粉诱导的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一种山桐子2n花粉诱导方法，提高2n花粉的产量，为深入开展山桐子倍性育种研究提供依据。

本发明的技术方案为：一种山桐子2n花粉的诱导方法，在山桐子雄花序花粉母细胞减数分裂发育至细线末期、粗线期或终变期，以化学诱变药剂对山桐子雄花序进行诱变处理，然后将诱变处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期时，收集花粉，即获得山桐子2n花粉；所述化学诱变药剂的体积百分比组成为：0.1％-0.4％戊炔草胺、0.5％二甲基亚砜，余量为水。

优选地，所述化学诱变药剂的体积百分比组成为：0.2％戊炔草胺、0.5％二甲基亚砜，余量为水。

进一步地，诱变处理的时间为24-48h。

优选地，诱变处理的时间为48h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

现有技术多以秋水仙素为诱导剂，存在毒害作用大，实际获得2n花粉过低，价格昂贵等诸多不利因素，本发明采用戊炔草胺为化学诱变剂，通过筛选适宜山桐子2n花粉诱导的诱导药剂种类、诱导浓度、诱导时期、诱导时长等因素，创建出山桐子2n花粉的高效诱导技术，不仅在克服毒害和使用成本的方面具有较大优势，还能获得较多数量的2n花粉，满足山桐子多倍体育种生产需求。

附图说明

图1山桐子花粉母细胞减数分裂发育至细粗线期及终变期时外观照片；

图2瓶浸法对山桐子雄花序进行加倍处理照片；

图3诱导出山桐子2n花粉的照片。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例

本实施例使用山桐子品种为海桐1号(四川省林木良种认定品种，成都市农林科学院和四川中海茂农业开发有限公司联合选育)雄株，种植于成都市农林科学院羊马试验基地山桐子种质资源圃，植株8年生，生长良好，可正常开花。按下述方法进行瓶浸法诱导山桐子2n花粉试验。

试验随机区组设计，单株小区，3次重复，以未处理花序为对照。该试验以化学诱导药剂浓度(戊炔草胺或秋水仙素，4个水平)和浸渍花序时长(2个水平)为因素，进行完全试验设计，共14个处理(见表1)。按照下述步骤进行山桐子2n花粉诱导操作:

表1山桐子2n花粉诱导试验设计表

(1)选择诱导材料：选择健康无病，生长健壮的山桐子雄株花序为诱导处理材料。

(2)诱导时间：在山桐子雄花序开放前，当花粉母细胞减数分裂发育至细线末期、粗线期及终变期时，外观表现为山桐子雄花序花苞膨大但花瓣未展开(4月5～10日)。

(3)诱导药剂选择和配置：选择戊炔草胺、秋水仙素分别为化学诱变药剂，以二甲基亚砜为助渗剂。戊炔草胺处理浓度分别为0.1％、0.2％、0.4％(v/v)，二甲基亚砜浓度为0.5％，该浓度表示分别将0.1mL、0.2mL和0.4mL戊炔草胺标准溶液(1000ug/mL)加入到适量水中，再加入0.5mL二甲基亚砜(AR，≥99.9％)，定容至100mL并充分混匀。秋水仙素浓度分别为0.1％、0.2％、0.4％(w/v)，二甲基亚砜浓度为0.5％，该浓度表示分别将0.1g、0.2g和0.4g秋水仙素(AR，＞99％溶解在适量水中，再加入0.5mL二甲基亚砜(AR，≥99.9％)，定容至100mL并充分混匀。诱变药剂随配随用。以蒸馏水为对照处理，以二甲基亚砜为助渗剂。该浓度表示在适量水中加入0.5mL二甲基亚砜(AR，≥99.9％)，定容至100mL并充分混匀。

(4)诱导药剂浸渍花序：以瓶浸法对山桐子雄花序进行加倍处理，每个处理重复10次(10个花序)以上，以蒸馏水处理为对照。所述瓶浸法诱导，将选用的山桐子雄花序小心装入50ml离心管内，用脱脂棉封口后，将离心管用绳子栓吊在山桐子侧枝下面，避免注射诱导药剂后重量增加使花枝折断。用医用一次性注射器将配置好的诱导药剂注射入离心管内，药液的用量以浸没花芽为宜。每天补充药液2-3次，使山桐子雄花序浸渍状态下保持24h和48h(各处理所用时长见表1)。处理完成后及时除去捆扎绳子和离心管。

(5)花序散粉前套袋：在山桐子花朵开放前(4月20～25日)，将诱导药剂处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，封口，以防止该花序上混入其它花粉。

(6)花粉收集：待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期，此时花粉己成熟，将纸袋和花序一同采下，置于阴凉干燥处，收集袋中自然散落的花粉。

(7)花粉产量统计

将硫酸纸袋中自然散落的花粉用分析天平(精确度0.0001g)称重，差量法称量各处理山桐子花粉产量。

(8)2n花粉检测

观察测量花粉粒直径，以花粉粒直径显著增大作为诱导成功的鉴定指标，并对2n花粉诱导频率进行估测。具体方法是将每个处理所得花粉混合均匀，制成5个临时涂片，在Olympus BX-51光学显微镜下进行观察和显微照相，每片观察5个视野，统计花粉中2n花粉的百分率。

(9)实施效果

由表2可知，采用瓶浸法，以戊炔草胺或秋水仙素为诱导药剂，在24h和48h均能诱导山桐子产生2n花粉，以水为对照处理并未检测到山桐子产生2n花粉。进一步分析，单独从山桐子2n花粉诱导率来看，在T10处理(0.2％(w/v)秋水仙素、0.5％(v/v)二甲基亚砜，瓶浸处理48小时)诱导产生的山桐子2n花粉百分率最高(20.8％)，显著高于其他处理(p＜0.05)，但该处理花粉产量较低(只有0.08mg/序)，2n花粉产量只有0.0166mg/序，很难直接用于山桐子多倍体诱导实践。单独从花粉产量来看，未施加化学诱导剂的对照处理花粉产量最高，平均每个花序有1.48mg的花粉，但没有观察到2n花粉；在施加了化学诱导剂处理中，秋水仙素对山桐子毒害作用显著高于戊炔草胺，其作用主要表现在花粉产量上。采用戊炔草胺为诱导剂，诱导山桐子2n花粉诱导率明显低于秋水仙素(p＜0.05)，但花粉产量显著高于秋水仙素(p＜0.05)。特别是T4处理(0.2％戊炔草胺、0.5％二甲基亚砜，瓶浸处理48小时)诱导产生的山桐子2n花粉百分率可达9.89％，花粉产量0.51mg/序，2n花粉产量为0.0505mg/序。

表2山桐子2n花粉诱导效果

注：表中不同小写字母表示不同处理间差异显著(p＜0.05)。

综上，以诱导产生山桐子2n花粉产量为综合评定指标，T4处理中各因素组合为最佳，诱导产生的山桐子2n花粉产量为每个花序0.0505mg。即在以获得大量2n花粉为目的的前提下，选用戊炔草胺为诱导药剂，诱导浓度为0.2％(v/v)，以0.5％(v/v)二甲基亚砜为渗透剂，于4月5～10日处理山桐子雄花序，并保持药剂浸渍花序48小时的处理，可取得理想的试验结果。

Claims (4)

1.一种山桐子2n花粉的诱导方法，其特征在于，在山桐子雄花序花粉母细胞减数分裂发育至细线末期、粗线期或终变期，以化学诱变药剂对山桐子雄花序进行诱变处理，然后将诱变处理过的花序全部套入硫酸纸袋中，待硫酸纸袋中花序处于雄花盛花期时，收集花粉，即获得山桐子2n花粉；所述化学诱变药剂的体积百分比组成为：0.1％-0.4％戊炔草胺、0.5％二甲基亚砜，余量为水。

2.根据权利要求1所述的一种山桐子2n花粉的诱导方法，其特征在于，所述化学诱变药剂的体积百分比组成为：0.2％戊炔草胺、0.5％二甲基亚砜，余量为水。

3.根据权利要求1所述的一种山桐子2n花粉的诱导方法，其特征在于，诱变处理的时间为24-48h。

4.根据权利要求1所述的一种山桐子2n花粉的诱导方法，其特征在于，诱变处理的时间为48h。

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