CN106574290A - 血中稀少细胞捕获方法 - Google Patents
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Abstract
通过本发明能够准备含有适于后续工作的血中稀少细胞捕获的样品。血中稀少细胞捕获方法为从血液中提取血中稀少细胞的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,在利用过滤器进行血液过滤后具有从所述血液将白细胞除去的工序。
Description
技术领域
本发明涉及使用了可高效地捕获血中稀少细胞、特别是血中循环癌细胞(Circulating Tumor Cell、以下称为CTC)的过滤器的血中稀少细胞捕获方法。
背景技术
癌细胞富集的研究、临床意义极为重大,只要能够将血液中的癌细胞富集,则可以应用在癌症的诊断中。例如,癌症预后及治疗的最重要的因素是初诊时及处置时有无癌细胞的转移。癌细胞的初始扩散达到外周血中时,检测CTC是判断癌症的病情进展的有用手段。但是,由于在血液中绝对优势地大量存在着红细胞或白细胞等血液成分,因此极少量的CTC的检测是困难的。
近年来提出了通过使用利用了聚对二甲苯的树脂过滤器来有效地检测少量的CTC的方法(专利文献1)。
另外,还提出了通过使用了金属代替树脂的过滤器来提高过滤器的强度、利用白细胞与癌细胞变形能力的差异进行分离的方法(专利文献2)。
另外,近年来还提出了通过选择性地除去白细胞来将残留细胞作为血中稀少细胞进行提取的方法(非专利文献1~6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/135603号
专利文献2:日本特开2013-42689号
非专利文献
非专利文献1:Fehm T,Solomayer EF,Meng S,Tucker T,Lane N,Wang J,et al.“Methods for isolating circulating epithelial cells and criteria for theirclassification as carcinoma cells”Cytotherapy 2005;7:171-85.
非专利文献2: R,Obermayr E,Bises G,Pfeiler G,Gneist M,WrbaF,et al.“Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells inmetastatic breast cancer patients”Acta Oncol 2011;50:700-10.
非专利文献3:Sieuwerts AM,Kraan J,Bolt J,van der Spoel P,Elstrodt F,Schutte M,et al.“Anti-epithelial cell adhesion molecule antibodies and thedetection of circulating normal-like breast tumor cells”J Natl Cancer Inst2009;101:61-6.
非专利文献4:Mostert B,Kraan J,Bolt-de Vries J,van der Spoel P,Sieuwerts AM,Schutte M,et al”Detection of circulating tumor cells in breastcancer may improve through enrichment with anti-CD146”Breast Cancer Res Treat2011;127:33-41.
非专利文献5:Schindlbeck C,Stellwagen J,Jeschke U,Karsten U,Rack B,Janni W,et al”Immunomagnetic enrichment of disseminated tumor cells in bonemarrow and blood of breast cancer patients by the Thomsen-Friedenreich-Antigen”Clin Exp Metastasis 2008;25:233-40.
非专利文献6:Deng G,Herrler M,Burgess D,Manna E,Krag D,Burke JF”Enrichment with anti-cytokeratin alone or combined with anti-EpCAM antibodiessignificantly increases the sensitivity for circulating tumor cell detectionin metastatic breast cancer patients”Breast Cancer Res 2008;10:R69.
发明内容
发明所要解决的课题
过滤法能够将血液中的白细胞、红细胞及血小板高效地除去,但白细胞由于与癌细胞的大小相近,因此无法全部除去。
过滤法是根据白细胞大小与癌细胞大小的差异、变形能力的差异进行分离的方法。该方法中,通过在过滤器的材质、孔形状、孔径、开口率、流速方面下工夫,能够对白细胞与癌细胞进行不错的分离。
但是,当血液量增加时,白细胞残渣有增多的倾向。健康人通常拥有3500~9500个/μL的白细胞。
美国食品药品管理局(FDA)承认的唯一的血中癌细胞检查系统是Cellsearch,其仅能够选择性地捕获具有EpCAM的癌细胞。但是,该方法由于仅能够捕获具有EpCAM的癌细胞,因此临床意义受到质疑。此时所使用的血液量为7.5mL。
发明者们进行深入研究的结果是,当流过7.5mL血液时,白细胞残留2,000个左右。
目前,关于富集率,认为1:25000左右是其界限。
近年来,Cellsearch的临床意义受到质疑。即,仅计数癌细胞的数量时是否仅能够对癌患者的预后进行预测。
近年来所要求的是对所采集的细胞进行基因分析等的后续工作(downstream)。此时,相对于1个癌细胞可容许的白细胞的数量为10个~100个,越小越好。
流过7.5mL血液时可容许的白细胞优选少于500个、更优选少于100个、进一步优选少于50个、更进一步少于10个。
也就是说,即2000个时对于考虑后续工作而言是不充分的。
另一方面,还提出了通过将白细胞选择除去,将残留细胞作为血中稀少细胞进行提取的方法,但该方法也存在界限。
该方法中,发明者们进行深入研究的结果是,流过7.5ml血液时白细胞残留2,000个左右。另外,当期望提高白细胞的除去率时,需要投入大量的磁性珠,花费成本。
CTC的除去方法除了上述方法以外还提出了很多方案,但单独的方法都存在界限。
本发明是考虑上述情况而完成的,其目的在于提供通过在利用磁性珠将白细胞减少后、利用过滤器进一步将白细胞减少,能够准备含有适于后续工作的血中稀少细胞捕获的样品的血中稀少细胞捕获方法。
用于解决课题的方法
本发明一个方式的血中稀少细胞捕获方法是从血液中提取血中稀少细胞的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,在利用过滤器进行血液过滤后具有将白细胞除去的工序。
这里,可为下述方式:所述将白细胞除去的工序为利用磁性珠将白细胞除去的工序。
另外,可为下述方式:所述血液过滤后获得的含有所述血中稀少细胞的液体中的白细胞数为1万个以下。
还可为下述方式:在所述将白细胞除去的工序中或其后,具有将细胞悬浮液用含有哺乳动物的血清、血浆或来自它们的蛋白的水溶液稀释的工序。
还可为下述方式:所述哺乳动物的血清或血浆来自牛、马或人。
还可为下述方式:所述哺乳动物的血清或血浆来自胎牛。
还可为下述方式:所述哺乳动物的血清或血浆的水溶液浓度为1%~50%的范围。
还可为下述方式:所述血清或血浆的水溶液以磷酸缓冲液为主成分。
还可为下述方式:所述血清或血浆的水溶液含有抗凝剂。
还可为下述方式:所述抗凝剂为EDTA、肝素、柠檬酸钠及氟化钠中的任一种。
还可为下述方式:在所述血液过滤前包含将过滤器浸渍到含有哺乳动物的血清或血浆的水溶液中的工序。
还可为下述方式:在所述血液过滤后且在所述将白细胞除去的工序之前包含用含有哺乳动物的血清或血浆的水溶液对血液细胞进行洗涤的工序。
还可为下述方式:所述哺乳动物的血清或血浆来自牛、马或人。
还可为下述方式:所述哺乳动物的血清为胎牛血清或胎牛血浆。
还可为下述方式:所述过滤器表面为金、铂、钯或它们的合金。
还可为下述方式:所述过滤器以镍为主成分且其表面镀覆有金、铂、钯或它们的合金。
还可为下述方式:所述过滤器以铜为主成分且其表面镀覆有金、铂、钯或它们的合金。
还可为下述方式:所述过滤器以钯为主成分且其表面镀覆有金或铂、或它们的合金。
还可为下述方式:所述过滤器的最外层为金镀层。
还可为下述方式:所述过滤器的最外层为0.05μm~1μm的贵金属镀层。
还可为下述方式:所述血中稀少细胞为癌细胞。
还可为下述方式:所述过滤器的贯通孔的开口形状为圆、楕圆、圆角长方形、长方形、正方形中的任意形状。其中,圆角长方形是由2条等长度的长边与2个半圆形构成的形状。使开口形状为长方形或圆角长方形时,贯通孔不易堵塞,可进一步提高作为捕获对象的成分的富集率。
还可为下述方式:形成所述过滤器的贯通孔的形状包含长方形或圆角长方形中的一个以上的形状,其短边的长度为5μm~15μm。
还可为下述方式:所述过滤器的膜厚为3μm~50μm。
发明效果
通过本发明,提供一种能够准备适于后续工作的含有血中稀少细胞捕获的样品的血中稀少细胞捕获方法。
附图说明
图1为用于说明细胞捕获盒(cartridge)的概略构成的图。
图2为用于说明过滤器的制造方法的图。
图3为表示使用铜板(进行铜镀覆时为Ni板)制造过滤器的方法的概略截面图。
图4为用于说明过滤器的长孔径、短孔径及开口率的定义的图。
具体实施方式
以下,参照所附附图对用于实施本发明的方式详细地进行说明。其中,附图的说明中,同一要素使用同一符号并省略重复的说明。
本实施方式的血中稀少细胞捕获方法中,利用过滤器从血液中过滤血中稀少细胞。用于进行血液过滤的装置构成没有特别限定,作为一个例子,对使用细胞捕获盒的情况进行说明。细胞捕获盒100如图1所示,具备:具有与细胞分散液流入的流入管125连接的流入口130和与细胞分散液流出的流出管135连接的流出口140的筐体120、和配置在筐体120内且具有将细胞分散液中所含的血中稀少细胞捕获的捕获区域的过滤器105。
筐体120为用于保持过滤器105的部件,由上部部件110及下部部件115构成。筐体120的形状可以为长方体或圆筒等,没有特别限制。
流入管125的上游与例如血液或洗涤液等处理液等连接。另外,流出管135的下游通过与泵P连接,在泵P的驱动下,血液等被从流入管125供给到筐体120的内部。其后,被从流出管135排出至外部。
过滤器105上形成有贯通孔106。当将血液导入细胞捕获盒100内时,血液中的红细胞等从贯通孔106通过,血中稀少细胞不能从贯通孔106通过而滞留在过滤器105表面。由此,能够将血中稀少细胞回收。
需要说明的是,细胞捕获盒100的形状并不限于上述形状。通过利用过滤器进行血液过滤,只要能够对血中稀少细胞进行捕获,则其装置构成没有特殊限定。
接着,参照图2及图3对过滤器制作方法进行例示,同时对过滤器进行说明。
图2为表示使用在MCL上贴合有可剥离铜箔(进行铜镀覆时为Ni箔)的基板制造金属制薄膜过滤器的方法的概略截面图。
图2(A)表示在MCL1上层压有可剥离铜箔2(进行铜镀覆时为Ni箔)的基板。首先,准备该基板。
作为用于制作过滤器的基板所使用的材料,优选铜(镀层为铜时为镍)。铜能够通过使用药液的化学溶解容易地除去,在与光致抗蚀剂的密合力方面也比其他材料优异。
接着,如图2(B)所示,在基板的可剥离铜箔2上形成光致抗蚀剂3。该光致抗蚀剂的厚度优选为之后的导体厚度的1.0倍~2.0倍。当该厚度薄时,之后抗蚀剂剥离变得困难,当厚时,回路形成性变得困难。具体而言,光致抗蚀剂3优选15~50μm的厚度。作为形成光致抗蚀剂3的感光性树脂组合物,优选负型感光性树脂组合物。负型感光性树脂组合物优选至少包含粘合剂树脂、具有不饱和键的光聚合性化合物、光聚合引发剂。
接着,如图2(C)所示,在光致抗蚀剂3上重叠光掩模4后进行光致抗蚀剂曝光。由此,在未重叠有光掩模4的区域形成曝光部3a。
接着,如图2(D)所示,用碱溶液等进行未曝光部3b的光致抗蚀剂显影除去。由此,在与过滤器的贯通孔对应的位置保留曝光部3a。
接着,如图2(E)所示,通过对未被光致抗蚀剂覆盖的部分进行电镀,形成镀层5。该镀覆的部分成为过滤器的材质。
接着,如图2(F)所示,从MCL1将通过电镀实施并形成了镀层5的可剥离铜箔2剥离。
接着,如图2(G)所示,通过利用药液的化学溶解将可剥离铜箔2除去,取出由曝光部3a及镀层5形成的自支撑膜。
接着,如图2(H)所示,利用自支撑膜内残留的光致抗蚀剂将曝光部3a除去,在镀层5上形成贯通孔6。
接着,图2(I)所示,进行化学镀金,在过滤器表面形成金镀层7。由此,能够制造细胞捕获盒100中使用的过滤器105。
图3为表示使用铜板(进行铜镀覆时为Ni板)制造金属制薄膜过滤器的方法的概略截面图。
图3所示的方法中,除了使用铜板(或Ni板)2’代替图2所示的方法中的MCL1和可剥离铜箔2这点以外,与图2所示的制造方法相同。
即,图3(A)示出了准备作为基板所使用的铜板2’的工序。
另外,图3(B)示出了在铜板2’上层压光致抗蚀剂3的工序。另外,图3(C)示出了重叠光掩模4的光致抗蚀剂曝光。另外,图3(D)示出了未曝光部3b的光致抗蚀剂的显影除去。另外,图3(E)示出了通过在光致抗蚀剂未被曝光部3a覆盖的部分上的电镀形成镀层的工序。另外,图3(F)示出了利用使用药液的化学溶解(化学蚀刻)将铜板2’除去,提取由曝光部3a及镀层5形成的自支撑膜的工序。另外,图3(G)示出了利用自支撑膜内残留的光致抗蚀剂将曝光部3a除去,在镀层5形成贯通孔6的工序。另外,图3(H)示出了进行化学镀金、在过滤器表面形成金镀层7的工序。
如此,使用图2所示的方法及图3所示的方法中的任一方法均能够制造细胞捕获盒100中使用的过滤器105。
过滤器105的材质优选为金属。金属由于加工性优异,因此能够提高过滤器的加工精度。由此,能够进一步提高作为捕获对象的成分的捕获率。另外,金属由于与塑料等其他材料相比较为刚直,因此即使从外部施加力,其尺寸及形状也得以维持。因此,在使比贯通孔稍大的成分变形通过时,能够进行更高精度的分离、富集。
另外,作为金属的主成分,优选镍、银、钯、铜、铱中的任一种、或者它们的合金。以上金属可进行电镀。其中,“主成分”是指该成分与过滤器105的总重量的重量比例为50%以上。
钯及铱的氧化还原电位高、难溶性且特性良好,但存在昂贵的缺点。镍的氧化还原电位低于氢,因此易于溶解,但廉价。银及钯为贵金属,与铱相比较为廉价。
作为用于制作过滤器的基板(铜板2’:参照图3)使用的材料,优选铜(过滤器105的材质为铜时优选镍)。铜通过利用药液的化学溶解可容易地除去,在与光致抗蚀剂的密合力方面也比其他材料优异。另外,层压在MCL1上的金属箔2(参照图2)也优选铜(过滤器105的材质为铜时优选镍)。
另外,图2(E)及图3(E)所示的镀层5的形成通过电镀进行。例如,作为电解镀镍,可列举出瓦特镀覆浴(硫酸镍、氯化镍、硼酸为主成分)、氨基磺酸镀覆浴(氨基磺酸镍、硼酸为主成分)、冲击镀覆浴(氯化镍、氯化氢为主成分)等。
作为电解镀银,可列举出以氰化银钾或酒石酸钾为主成分的镀覆浴。
作为电解镀钯,可列举出由水溶性钯盐和萘磺酸化合物形成的镀覆浴。
作为电解镀铱,可列举出含有含卤化物的可溶性铱盐及醇类的镀覆浴。
作为电解镀铜,可列举出以硫酸铜和硫酸、氯化物离子为主成分的镀覆浴。
使用这些镀覆浴进行电镀。电镀时的电流密度可以为0.3~4A/dm2的范围、更优选为0.5~3A/dm2的范围。通过使电流密度为4A/dm2以下,能够抑制毛面的发生,通过使电流密度为0.3A/dm2以上,金属的晶粒充分生长,作为阻隔层的效果提高,因此可良好地获得本实施方式的效果。
进行镀覆时的抗蚀剂、即曝光部3a的位置成为贯通孔的位置。作为贯通孔的开口形状,可例示出圆、楕圆、正方形、长方形、圆角长方形、多边形等。从能够高效地捕获作为对象的成分的观点出发,优选圆、长方形或圆角长方形。另外,从防止过滤器的堵塞的观点出发,特别优选圆角长方形。
贯通孔6的孔径根据作为捕获对象的成分的尺寸进行设定。本说明书中,开口形状为楕圆、长方形、多边形等除圆以外的形状中的孔径是指能够从各贯通孔通过的球的直径的最大值。例如开口形状为长方形时,如图4所示,虽然可以定义为短边侧的短孔径和长边侧的长孔径,但贯通孔6的孔径为短孔径。另外,开口形状为多边形时,为其多边形的内接圆的直径。开口形状为长方形或圆角长方形时,作为捕获对象的成分即使在被贯通孔6捕获的状态下,在开口部、在开口形状的长边方向上形成间隙。由于通过该间隙液体可通过,因此能够防止过滤器的堵塞。过滤器的短孔径的长度优选为5μm~15μm、更优选为7μm~9μm。
过滤器105的贯通孔的平均开口率优选为3~50%、更优选为3~20%、特别优选为3~10%。这里,开口率是指,贯通孔相对于作为过滤器发挥功能的区域的面积所占的面积的比例(参照图4)。即,作为过滤器发挥功能的区域的面积是指,过滤器中所包含的多个贯通孔中,将贯通孔的最外部连接所得的区域(图4中由虚线围住的区域A1)。当开口率过高时,施加给白细胞的压力降低、白细胞残留增加。开口率低时,流过的血液量降低。
过滤器105的厚度优选为3μm~50μm、更优选为5μm~30μm、特别优选为8μm~20μm。过滤器105的膜厚小于3μm时,过滤器的强度降低,有时操作性会变难。相反,当超过50μm时,加工时间变长,由此生产率降低,有可能不仅有超过必要的材料消耗而导致成本上的不利,或微细加工本身变难而使白细胞变得难以通过。
上述回路形成后,通过将树脂层剥离并对铜箔进行蚀刻(图2)、或将铜板除去(图3),如图2(H)或图3(G)所示,利用镀层5完成过滤器。
接着,利用强碱将过滤器中残留的抗蚀剂(曝光部3a)除去。作为强碱,优选0.1~10wt%的NaOH或KOH水溶液。为了促进剥离,可以添加单乙醇胺(1~20vol%)等。剥离困难时,可以用在过锰酸钠或过锰酸钾等中添加碱(0.1~10wt%的NaOH或KOH)而成的溶液将抗蚀剂除去。
对除去了抗蚀剂的过滤器进行贵金属镀覆。
作为贵金属镀覆,优选金、钯、铂、钌、铟等。
贵金属镀覆中,金如前文所述被认为在所有金属中氧化还原电位最高、没有细胞毒性。即使长期保存也几乎没有变色等。
金镀覆还可以通过化学镀覆来进行,也可以通过电解来进行。通过电解进行时,厚度的不均变大,易于影响过滤器的孔径精度,因此优选化学镀覆。但是,电解镀金的被覆率可以提高。
金镀覆即使仅通过置换镀覆进行也具有效果,但将置换镀覆与还原镀覆组合时,效果更大。
金镀覆前的金属过滤器的表面有时被氧化。因此,需要进行氧化皮膜的除去,这里,可以用加有与金属离子形成络合物的化合物的水溶液进行洗涤。
具体而言,可以使用加有氰类、EDTA类或柠檬酸类的水溶液。
其中,柠檬酸类作为金镀覆的前处理最为适宜。具体而言,可以为柠檬酸的酸酐、柠檬酸的水合物、柠檬酸盐或柠檬酸盐的水合物,具体地可以使用柠檬酸酐、柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、柠檬酸钾等。其浓度优选为0.01mol/L~3mol/L、更优选为0.03mol/L~2mol/L、特别优选为0.05mol/L~1mol/L的范围。通过为0.01mol/L以上,金属过滤器与化学镀金层的密合性提高。另外,超过3mol/L时,不仅效果不会提高,而且在经济上也不优选。
在含有柠檬酸的溶液中的浸渍可以在70℃~95℃下进行1~20分钟。
含有柠檬酸的溶液在可获得发明效果的范围内还可加入镀覆液等中所含的还原剂、pH调节剂等缓冲剂,优选还原剂、pH调节剂等为少量、最优选仅加入柠檬酸的水溶液。含有柠檬酸的溶液的pH优选为5~10、更优选为6~9。
作为pH调节剂,只要是酸或碱则没有特别限定,作为酸,可以使用盐酸、硫酸、硝酸等,作为碱,可列举出氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等碱金属或碱土类金属的氢氧化物溶液。如上所述,可在不妨碍柠檬酸的效果的范围内使用。另外,当使含有柠檬酸的溶液以100mL/L这样的高浓度含有硝酸时,与用仅含有柠檬酸的溶液处理时相比,改善粘接性的效果降低。
作为还原剂,只要是具有还原性的物质则没有特别限定,可列举出次亚磷酸、甲醛、二甲基胺硼烷、氢化硼酸钠等。
接着,进行置换镀金。置换镀金有氰化物镀覆浴和非氰化物镀覆浴,考虑到环境负荷或残留时的细胞毒性,优选非氰化物镀覆浴。作为非氰化物镀覆浴中所含的金盐,可例示出氯化金酸盐、亚硫酸金盐、硫代硫酸金盐、巯基丁二酸金盐。金盐可仅使用一种,也可以将二种以上组合使用。
此外,氰化物系的镀覆浴由于溶解金属的效果过强,因此易于因金属溶解而产生针孔。如上所述充分地进行前处理时,优选非氰化物系的镀覆浴。
作为金的供给源,特别优选亚硫酸金。作为亚硫酸金,可以为亚硫酸金钠、亚硫酸金钾、亚硫酸金铵等。
金浓度优选为0.1g/L~5g/L的范围。小于0.1g/L时,金不易析出,超过5g/L时,溶液变得易于分解。
置换镀金浴中可加入作为金的络合剂的铵盐或乙二胺四乙酸盐。作为铵盐,可列举出氯化铵、硫酸铵,作为乙二胺四乙酸盐,使用乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸钠、乙二胺四乙酸钾、乙二胺四乙酸铵。铵盐的浓度优选在7×10-3mol/L~0.4mol/L的范围内使用,铵盐的浓度在该范围外时,溶液有变得不稳定的倾向。乙二胺四乙酸盐的浓度优选在2×10- 3mol/L~0.2mol/L的范围内使用,铵盐的浓度在该范围外时,溶液有变得不稳定的倾向。
为了稳定地保持溶液,可以加入0.1g/L~50g/L的亚硫酸盐。作为亚硫酸盐,可列举出亚硫酸钠或亚硫酸钾、亚硫酸铵等。
作为pH调节剂,在降低pH时,优选使用盐酸或硫酸。另外,在提高pH时,优选使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨水。pH优选调节至6~7。在该范围外时,对溶液的稳定性或镀层的外观有不良影响。
置换镀覆优选在液温为30度~80度内使用,在该范围外时,对溶液的稳定性或镀层的外观有不良影响。
虽如上可进行置换镀覆,但置换镀覆难以完全地将金属覆盖。因此,需要接着进行加入了还原剂的还原型镀金。置换镀覆的厚度优选为0.02μm~0.1μm的范围。
作为还原型镀金的金盐,优选亚硫酸金盐及及硫代硫酸盐,其含量以金计优选为1g/L~10g/L的范围。金的含量小于1g/L时,金的析出反应降低,超过10g/L时,镀覆液的稳定性降低,并且由于镀覆液的带出金消耗量增多,因此不优选。含量更优选为2g/L~5g/L。
作为还原剂,可列举出次亚磷酸、甲醛、二甲基胺硼烷、氢化硼酸钠等,更优选苯基化合物系还原剂。例如苯酚、邻甲酚、对甲酚、邻乙酚、对乙酚、叔丁酚、邻氨基苯酚、对氨基苯酚、对苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚、甲基对苯二酚、苯胺、邻苯二胺、对苯二胺、邻甲苯胺、邻乙苯胺、对乙苯胺等,可以使用它们中的1种或2种以上。
还原剂的含量优选为0.5g/L~50g/L。还原剂的含量小于0.5g/L时,有难以获得实用上的析出速度的倾向,超过50g/L时,有镀覆液的稳定性降低的倾向。还原剂的含量更优选为2g/L~10g/L、特别优选为2g/L~5g/L。
化学镀金液可含有重金属盐。从促进析出速度的观点出发,重金属盐优选为选自由铊盐、铅盐、砷盐、锑盐、碲盐及铋盐组成的组中的至少一种。
作为铊盐,可列举出硫酸铊盐、氯化铊盐、氧化铊盐、硝酸铊盐等无机化合物盐、丙二酸二铊盐等有机络合物盐;作为铅盐,可列举出硫酸铅盐、硝酸铅盐等无机化合物盐、乙酸盐等有机乙酸盐。
另外,作为砷盐,可列举出亚砷盐、砒酸盐三氧化砷等无机化合物盐或有机络合物盐;作为锑盐,可列举出酒石酸锑盐等有机络合物盐、氯化锑盐类、硫酸氧锑盐、三氧化锑等无机化合物盐类。
作为碲盐,可列举出亚碲酸盐、碲酸盐等无机化合物盐或有机络合物盐;作为铋盐,可列举出硫酸铋(III)、氯化铋(III)、硝酸铋(III)等无机化合物盐、草酸铋(III)等有机络合物盐。
上述重金属盐可以使用1种或1种以上,其添加量的合计以镀覆液总容量为基准计优选为1ppm~100ppm、更优选为1ppm~10ppm。小于1ppm时,有时析出速度提高效果会不充分;超过100ppm时,有镀覆液稳定性变差的倾向。
化学镀金液可以含有硫系化合物。通过在含有苯基化合物系还原剂及重金属盐的化学镀金液中进一步含有硫化物,即使在液温为60~80℃左右的低温下也能够获得充分的析出速度,不仅被膜外观良好,而且镀覆液的稳定性特别优异。
作为硫系化合物,可列举出硫化物盐、硫氰酸盐、硫脲化合物、硫醇化合物、硫化物、二硫化物、硫酮化合物、噻唑化合物、噻吩化合物等。
作为硫化物盐,可列举出例如硫化钾、硫化钠、多硫化钠、多硫化钾等;作为硫氰酸盐,可列举出硫氰酸钠、硫氰酸钾、二硫氰酸钾等;另外,作为硫脲化合物,可列举出硫脲、甲基硫脲、二甲基硫脲等。
作为硫醇化合物,可例示出1,1-二甲基乙硫醇、1-甲基-辛硫醇、十二硫醇、1,2-乙二硫醇、苯硫醇、邻硫甲酚、对硫甲酚、邻二巯基苯、间二巯基苯、对二巯基苯、硫基甘醇、硫基二甘醇、硫基乙酸、二硫基乙酸、巯基丁二酸、巯基丙酸、2-巯基苯并咪唑、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基-5-甲基苯并咪唑等。
作为硫化物,可例示出二乙基硫化物、二异丙基硫化物、乙基异丙基硫化物、二苯基硫化物、甲基苯基硫化物、绕丹宁、硫二甘醇酸、硫代二丙酸等;作为二硫化物,可例示出二甲基二硫化物、二乙基二硫化物、二丙基二硫化物等。
此外,作为硫酮化合物,可例示出氨基硫脲等;作为噻唑化合物,可例示出噻唑、苯并噻唑、2-巯基苯并噻唑、6-乙氧基-2-巯基苯并噻唑、2-氨基噻唑、2,1,3-苯并噻二唑、1,2,3-苯并噻二唑、(2-苯并噻唑基硫代)乙酸、3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸等;作为噻吩化合物,可例示出噻吩、苯并噻吩等。
硫系化合物可以单独使用,也可以使用2种以上。硫系化合物的含量优选为1ppm~500ppm、更优选为1ppm~30ppm、特别优选为1ppm~10ppm。硫系化合物的含量小于1ppm时,析出速度降低,发生均镀不良、皮膜外观变差。超过500ppm时,浓度管理产生困难、镀覆液变得不稳定。
优选在化学镀金液中加入上述金盐、还原剂、重金属盐及硫系化合物、并含有络合剂、pH缓冲剂及金属离子掩蔽剂中的至少1种,更优选含有这些等的全部。
本发明的化学镀金液中优选含有络合剂。具体而言,可列举出亚硫酸盐、硫代硫酸盐、巯基丁二酸盐等非氰化物系络合剂。络合剂的含量优选以镀覆液的总容量为基准计为1g/L~200g/L。络合剂的含量小于1g/L时,金络合能力降低、稳定性降低。超过200g/L时,镀覆稳定性提高,但溶液中发生再结晶,在经济上不优选。络合剂的含量更优选为20g/L~50g/L。
化学镀金液中优选含有pH缓冲剂。通过pH缓冲剂,有使析出速度保持恒定值、使镀覆液稳定化的效果。缓冲剂可以是将多种混合而成的。作为pH缓冲剂,可列举出磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐等,其中,特别优选硼酸、硫酸盐。
pH缓冲剂的含量优选以镀覆液的总容量为基准计为1g/L~100g/L。pH缓冲剂的含量小于1g/L时,没有pH的缓冲效果;超过100g/L时,有发生再结晶化的可能。更优选的含量为20g/L~50g/L。
镀金液中优选含有掩蔽剂。作为掩蔽剂,可以使用苯并三唑系化合物,作为苯并三唑系化合物,可例示出例如苯并三唑钠、苯并三唑钾、四氢苯并三唑、甲基苯并三唑、硝基苯并三唑等。
金属离子掩蔽剂的含量以镀覆液的总容量为基准计优选为0.5g/L~100g/L。当金属离子掩蔽剂的含量小于0.5g/L时,有杂质的隠蔽效果小、无法确保充分的溶液稳定性的倾向。另一方面,当超过100g/L时,有时镀覆液中会发生再结晶化。从成本及效果考虑,最优选为2g/L~10g/L的范围。
镀金液的pH优选为5~10的范围。镀覆液的pH小于5时,有作为镀覆液的络合剂的亚硫酸盐或硫代硫酸盐分解、产生毒性的亚硫酸气体的可能。当pH超过10时,有镀覆液的稳定性降低的倾向。为了提高还原剂的析出效率、得到快的析出速度,优选化学镀金液的pH为8~10的范围。
作为化学镀覆的方法,将置换镀金结束后的过滤器浸渍以进行金镀覆。
镀覆的液温可以为50℃~95℃。小于50℃时,析出效率变差、95℃以上时溶液易于变得不稳定。
如此形成的最外层的金镀层7优选由99重量%以上纯度的金构成。金镀层7的金的纯度小于99重量%时,接触部的细胞毒性增高。从提高可靠性的观点出发,更优选金层的纯度为99.5重量%以上。
另外,金镀层7的厚度优选为0.005μm~3μm、更优选为0.05μm~1μm、进一步优选为0.1μm~0.5μm。通过使金镀层7的厚度为0.005μm以上,能够某种程度地抑制金属的溶出。另一方面,由于即使超过3μm,也不能进一步地增大效果,从经济上的观点出发,也优选为3μm以下。为贵金属镀覆时,优选厚度为0.05μm~1μm。
如上形成的金表面没有细胞毒性,在大气中或含有血液的几乎所有水溶液中是稳定的。但是,金表面较为疏水性,生物相容性低,因此可以实施为提高生物相容性的处理。以下示出表面处理的一个例子。
血液中的成分即白细胞、红细胞、血小板对异物显示排斥反应。因此,可以对金属表面实施前处理。此时,优选在即将血液过滤前将金属表面浸渍到含有生物相容性聚合物的溶剂中。
作为含有生物相容性聚合物的溶剂,可列举出哺乳动物的血清或血浆。血浆为用加有抗凝剂的采血管采血并放置或离心分离时由于血细胞成分的沉淀而出现的上清液。该血浆含有凝血因子。另一方面,在用未加有抗凝剂的采血管采血并放置时,由于未加有抗凝剂,因此血细胞成分在凝血因子的作用下发生凝血。此时的上清液为血清,血清中缺少凝血因子。
哺乳动物中,考虑到特性或价格,优选从牛、马、人中进行选择,特别优选胎牛血清。
血清中含有蛋白。蛋白中所含的白蛋白或球蛋白通过吸附于过滤器表面,从而防止了血细胞成分吸附于过滤器表面。血清中存在大量蛋白,血清白蛋白占约50%~65%。
白蛋白中氨基酸多个连接因此具有多个氨基。氨基与贵金属(金、铂、钯)发生牢固的配位结合。
特别是由于金几乎不存在于氧化皮膜,因此即使不进行特別的前处理,也与白蛋白形成牢固的结合。
用如此稀释血清或血浆而得到的水溶液进行过滤器105的前处理。血清或血浆的浓度优选为1%~50%的范围、更优选为5%~30%的范围、进一步优选为10%~20%的范围。
血清或血浆可以用水系的溶剂进行稀释,优选加有磷酸等缓冲液。血清或血浆的水溶液优选以磷酸缓冲液为主成分。
进一步优选血清或血浆溶液中加有血液的抗凝剂。这样的抗凝剂可列举出EDTA、肝素、柠檬酸钠及氟化钠等,其中优选EDTA或肝素。
处理时间优选为1分钟以上且60分钟以下、更优选为1分钟以上且10分钟以下。短于1分钟时,生物相容高分子不易与贵金属表面牢固地配位结合。而长于60分钟时,从作业时间的观点出发,不优选。
使血液从如此处理了生物相容性聚合物的过滤器中流过(血液过滤)。将过滤器105安装在细胞捕获盒100这样的装置中,使血液通过。血液可以从过滤器的下方在负压下处理、也可以从过滤器的上方在加压下处理、也可以如离心分离这样采用离心力进行处理。在任一方法中,控制血液从过滤器的孔中通过的线速度均是重要的。
另外,作为样品所需的血液的量为1~10ml。
采集血液时的采血管优选加有抗凝剂。这样的抗凝剂中,可列举出EDTA-2K、EDTA-2Na、柠檬酸钠、氟化钠或肝素等。
另外,有全部使用用采血管采集的血液作为样品的方法、和通过离心分离仅提取白膜(buffy coat)的方法。全部使用用采血管采集的血液的方法简便,但预先除去红细胞等成分的方法具有使后续工序变得容易的优点。
使用仅提取白膜的方法时,可以用含有生物相容性聚合物的溶剂进行稀释。由此,能够防止血液中的癌细胞等吸附于多余的位置。
作为含有生物相容性聚合物的溶剂,可列举出哺乳动物的血清或血浆。血浆为用加有抗凝剂的采血管采血并放置或离心分离时由于血细胞成分的沉淀而出现的上清液。该血浆含有凝血因子。另一方面,在用未加有抗凝剂的采血管采血并放置时,由于未加有抗凝剂,因此血细胞成分在凝血因子的作用下发生凝血。此时的上清液为血清,血清中缺少凝血因子。
哺乳动物中,考虑到特性或价格,优选从牛、马、人中进行选择,特别优选胎牛血清。
血清中含有蛋白。蛋白中所含的白蛋白或球蛋白通过吸附于过滤器表面,从而防止了血细胞成分吸附于过滤器表面。血清中存在大量蛋白,血清白蛋白占约50%~65%。
用如此稀释血清或血浆而得到的水溶液进行过滤器105的前处理。血清或血浆的浓度优选为1%~50%的范围、更优选为5%~30%的范围、进一步优选为10%~20%的范围。
血清或血浆可以用水系的溶剂进行稀释,优选加有磷酸等缓冲液。
进一步优选血清或血浆溶液中加有血液的抗凝剂。这样的抗凝剂可列举出EDTA、肝素、柠檬酸钠及氟化钠等,其中优选EDTA或肝素。
如此获得白细胞和CTC被稀释于含有生物相容性聚合物的溶剂中的细胞悬浮液,将白细胞除去。
白细胞的除去可以使用以往公知的方法即利用白细胞的磁性珠的除去法。作为这样的珠粒,可列举出Dynabeads M-450-CD45(pan-leucocyte)。
将使CD45抗体与上述磁性珠反应而得到的珠粒浸渍到上述细胞悬浮液中。此时,可以加入白细胞的4倍~10倍左右的磁性珠。磁性珠的量少时,白细胞的除去效率降低,磁性珠量多时,成本增高。
在使磁性珠与白细胞反应规定的时间后,将磁性珠除去。
通过上述工序,能够使白细胞数从最初的5000万个(5mL时)的水平最低降低到50万个的水平。
对通过以上工序获得的细胞的悬浮液进行血液过滤,由此能够降低至后续工作成为可能的水平。
血液从过滤器105的孔通过的线速度(血液的体积/孔的总面积)优选为0.5~100cm/分钟的范围、更优选为5~20cm/分钟的范围。
可以将血液过滤后的过滤器105再用血清或血浆溶剂洗涤。血清或血浆溶剂可以使用与所述浸渍用的完全相同的溶剂。洗涤液的线速度也优选为0.5~100cm/分钟的范围、更优选为5~20cm/分钟的范围。
通过最初的浸渍,生物相容高分子吸附于过滤器105的表面,因此过滤时能够抑制血细胞成分的吸附,通过血液处理,变为血细胞易于吸附的表面。
另外,通过洗涤时再次流过生物相容高分子,能够提高洗涤效果。
洗涤液的量可以适当调整,但以所述线速度计优选洗涤1~20分钟、更优选洗涤5~15分钟。
如此能够捕获经富集的CTC等稀少细胞。通过使生物相容性聚合物化学牢固地被覆在过滤器上,能够排除红细胞、白细胞、血小板等成分。另外,可以包含在血液过滤前将过滤器浸渍于含有哺乳动物的血清或血浆的水溶液、或者在利用过滤器进行血液过滤后用含有哺乳动物的血清或血浆的水溶液对血液的血液细胞进行洗涤的工序中的至少一个,特别是通过在血液过滤前进行处理,能够有效地捕获血液中的稀少细胞。
使用血液过滤的过滤法中,有因白细胞的初始投入量不同而最终残留的白细胞的残留量不同的倾向。发明者们的研究中,白细胞的量因过滤器过滤而降低至1/25000左右。
但是,血液7.5ml中有时存在5千万个左右的白细胞。因此,白细胞会残留2000个左右(1000~10000个)。
白细胞即使残留2000个,也能够进行癌细胞的计数。但是,在之后的基因分析等后续工作中,癌细胞少时,背景增强而不易获得良好的结果。
过滤法中,还存在如何减少1000~10000个残留的白细胞的课题。
因此,将过滤器上残留的白细胞和癌细胞回收。作为回收方法,考虑将过滤器浸渍在烧杯中等方法,但是简便的是进行逆洗涤。即,从过滤器的相反侧使液体流过而将细胞回收。此时的回收液中优选使用含有生物相容性聚合物的溶剂。
作为含有生物相容性聚合物的溶剂,可列举出哺乳动物的血清或血浆。血浆为用加有抗凝剂的采血管采血并放置或离心分离时由于血细胞成分的沉淀而出现的上清液。该血浆含有凝血因子。另一方面,在用未加有抗凝剂的采血管采血并放置时,由于未加有抗凝剂,因此血细胞成分在凝血因子的作用下发生凝血。此时的上清液为血清,血清中缺少凝血因子。
哺乳动物中,考虑到特性或价格,优选从牛、马、人中进行选择,特别优选胎牛血清。
血清中含有蛋白。蛋白中所含的白蛋白或球蛋白通过吸附于过滤器表面,从而防止了血细胞成分吸附于过滤器表面。血清中存在大量蛋白,血清白蛋白占约50%~65%。
白蛋白中氨基酸多个连接因此具有多个氨基。氨基与贵金属(金、铂、钯)发生牢固的配位结合。
特别是由于金几乎不存在于氧化皮膜,因此即使不进行特別的前处理,也与白蛋白形成牢固的结合。
血清或血浆的浓度优选为1%~50%的范围、更优选为5%~30%的范围、进一步优选为10%~20%的范围。
血清或血浆可以用水系的溶剂进行稀释,优选加有磷酸等缓冲液。
进一步优选血清或血浆溶液中加有血液的抗凝剂。这样的抗凝剂可列举出EDTA、肝素、柠檬酸钠、氟化钠等,其中优选EDTA或肝素。
如此获得白细胞和CTC被稀释于含有生物相容性聚合物的溶剂中的细胞悬浮液,将白细胞除去。
白细胞的除去可以使用以往公知的方法即利用白细胞的磁性珠的除去法。作为这样的珠粒,可列举出Dynabeads M-450-CD45(pan-leucocyte)。
将使CD45抗体与上述磁性珠反应而得到的珠粒浸渍到上述细胞悬浮液中。此时,可以加入白细胞的4倍~10倍左右的磁性珠。磁性珠的量少时,白细胞的除去效率降低,磁性珠量多时,成本增高。
在使磁性珠与白细胞反应规定的时间后,将磁性珠除去。
通过上述工序,能够使白细胞数从最初的1000~10000个(7.5mL时)的水平降低至10~100个的水平。
如此得到的细胞的悬浮液能够使后续工作成为可能的水平。
实施例
(过滤器1)
将感光性树脂组合物(PHOTEC RD-1225:厚度为25μm、日立化成株式会社制)层压在250mm见方的基板(MCL-E679F:MCL的表面上贴合有可剥离铜箔的基板、日立化成工业株式会社制)的一个面上。在层压条件:辊温度为90℃、压力为0.3MPa、传送速度为2.0m/分钟下进行。
接着,将按照使光的透过部的形状为圆角长方形、尺寸为7.8(短孔径)×100(长孔径)μm、开口率达到6.7%的方式设计的玻璃掩模静置在基板的光致抗蚀剂层压面上。本实施例中,使用朝向同一方向的圆角长方形在长轴及短轴方向上以一定的间距整齐排列的玻璃掩模。
接着,在600mmHg以下的真空下,从载置有玻璃掩模的基板上部通过紫外线照射装置照射曝光量为30mJ/cm2的紫外线。
接着,用1.0%碳酸钠水溶液进行显影,在基板上形成长方形的光致抗蚀剂垂直竖立的抗蚀剂层。对该带有抗蚀剂的基板的铜露出部分在pH调整为4.5的镍镀覆液中在温度55℃下进行约20分钟、约20μm的镀覆。镍镀覆液的组成如表1所示的。
表1
镀覆液组成 | 浓度(g/L) |
氨基磺酸镍 | 450 |
氯化镍 | 5 |
硼酸 | 30 |
接着,将得到的镍镀层与基板的可剥离铜箔一起剥离,在温度40℃下通过进行约120分钟使用搅拌处理下的药液的化学溶解(MECBRITE SF-5420B、MEC株式会社)将该可剥离铜箔除去,由此取出成为金属过滤器的自支撑膜(20mm×20mm)。
最后,在温度60℃下通过约40分钟的利用超声处理的抗蚀剂剥离(P3Poleve、Henkel)将残留在自支撑膜内的光致抗蚀剂除去,制作具有微细贯通孔的金属过滤器。
由此,制作没有折皱、折痕、伤痕、卷曲等损伤的、具有充分精度的贯通孔的金属过滤器。
接着,将金属过滤器浸渍于酸性脱脂液Z-200(World Metals制:商品名)中,进行金属过滤器上的有机物的除去(40℃、3分钟)。
水洗后,利用从非氰化物系的化学镀Au即HGS-100(日立化成制:商品名)中提取了作为金供给源的亚硫酸金的溶液,在80℃、10分钟的条件下进行置换镀金前处理。
接着,80℃下在非氰化物系的置换型化学镀Au即HGS-100(日立化成制:商品名)中浸渍20分钟,进行置换镀金。置换镀金的厚度为0.05μm。
水洗后,65℃下在非氰化物系还原型化学镀Au即HGS-5400(日立化成制:商品名)中浸渍10分钟,进行金镀覆,水洗后进行干燥。金镀覆的总厚度为0.2μm。
(非小细癌细胞株的制备)
将非小细癌细胞株即NCI-H358细胞用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2条件下静置培养。利用胰蛋白酶处理从培养皿将细胞剥离、回收,用磷酸缓冲液(Phosphate buffered saline、PBS)洗涤后,通过用10μM Cell Tracker Red CMTPX(Life Technologies Japan株式会社)在37℃下静置30分钟,对NCI-H358细胞进行染色。其后,用PBS洗涤,通过用胰蛋白酶处理在37℃下静置3分钟,使细胞块解离。其后,用培养基使胰蛋白酶处理停止,在用PBS洗涤后,悬浮到含有2mM EDTA及0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS(下文称为2mM EDTA-0.5%BSA-PBS)中,得到制备用的悬浮液。其中,PBS使用磷酸缓冲生理盐水、和光纯药工业制、产品编号166-23555。BSA使用SIGMA-ALDRICH公司制(产品名:Albumin from bovine serum-Lyophilized powder,Bio Reagent for cell culture)的产品。EDTA使用2Na(乙二胺-N,N,N’,,N’-4乙酸二钠盐二水合物)(和光纯药工业制、产品编号345-01865)。
(利用磁性珠的血液样品中的CTC的富集)
(比较例1)
作为7.5mL的血液样品,使用在采集到含有EDTA-2Na的真空采血管的健康者血液中每7.5mL血液含有1000个所述癌细胞的样品。样品中的白细胞的数量为470万个/ml、即3525万个/7.5ml。
使用盒中安装有上述制作的过滤器的CTC回收装置:CT6000(日立化成制:商品名)进行实验。CTC回收装置具备用于导入血液样品或试剂的流路,流路的入口与对注射器进行加工而制作的贮液器连接。通过将血液样品、试剂依次投入到该贮液器中,能够容易地连续进行CTC的捕获、染色、洗涤等操作。
首先,在贮液器中导入2mM EDTA-10.0%FBS(胎牛血清)-PBS(Gibco制PBS、pH为7.4)1ml(以下称为洗涤液),充满至过滤器上,放置10分钟。接着,使用蠕动泵以200μL/分钟的流速开始送液。其后,投入样品1。约5分钟后,向贮液器中导入9mL的洗涤液,进行细胞的洗涤。
接着,向盒中加入在PBS中溶解有4%PFA的溶液,浸渍细胞15分钟。洗涤后,在盒中加入在洗涤液中溶解有0.2%TritonX的溶液,浸渍细胞15分钟。
进而,10分钟后,将泵流速变更为20μL/分钟,向贮液器中导入600μL的细胞染色液(Hoechst 33342:30μl、Wash buffer:300ml),对过滤器上的癌细胞或白细胞进行荧光染色。对过滤器上捕获的细胞进行30分钟染色,然后向贮液器中导入1mL的2mM EDTA-0.5%BSA-PBS,进行细胞的洗涤。
随后,使用装备有计算机控制式电子载物台及冷却数码相机(DP70、奥林巴斯株式会社)的荧光显微镜(BX61、奥林巴斯株式会社)观察过滤器,对过滤器上的癌细胞及白细胞的数量进行计数。
为了观察来自Hoechst 33342及Cell Tracker Red CMTPX的荧光,分别使用WU及WIG过滤器(奥林巴斯株式会社)获得图像。图像获得及分析软件使用Lumina Vision(三谷商事株式会社)。将结果示于表2。细胞回收率(%)=过滤器上回收的癌细胞数/混合于血液样品中的癌细胞数×100%。白细胞的数量通过用被Hoechst 33342染色的细胞数减去癌细胞数来计算。通过以上的方法进行比较例1的实验。
(比较例2)
除了使最初的血液量不为7.5ml而为15ml以外,通过与比较例1同样的方法进行实验。
(比较例3)
除了使最初的血液量不为7.5ml而为30ml以外,通过与比较例1同样的方法进行实验。
(实施例1)
作为7.5mL的血液样品,使用在采集到含有EDTA-2Na的真空采血管的健康者血液中每7.5mL血液含有1000个所述癌细胞的样品。样品中的白细胞的数量为470万个/ml、即3525万个/7.5ml。
使用盒中安装有上述制作的过滤器的CTC回收装置:CT6000(日立化成制:商品名)进行血液过滤。CTC回收装置具备用于导入血液样品或试剂的流路,流路的入口与对注射器进行加工而制作的贮液器连接。通过将血液样品、试剂依次投入到该贮液器中,能够容易地连续进行CTC的捕获、染色、洗涤等操作。
首先,在贮液器中导入2mM EDTA-10.0%FBS(胎牛血清)-PBS(Gibco制PBS、pH为7.4)1ml(以下称为洗涤液),充满至过滤器上,放置10分钟。随后,使用蠕动泵以200μL/分钟的流速开始送液。其后,投入血液样品。约5分钟后,向贮液器中导入9mL的洗涤液,进行细胞的洗涤。
接着,使洗涤液从过滤器的相反侧流过(逆洗涤),将过滤器上的细胞回收,得到10mL的加有细胞的悬浮液。
投入含有4.0×105个磁性珠上吸附有CD45抗体的Dynabeads CD45的分散液1ml(0.1%BSA、0.02%叠氮钠,PBS、pH为7.4),在反应规定时间后,用磁铁将磁性珠取出,得到含有残留癌细胞的悬浮液1。
使用盒中安装有上述制作的过滤器的CTC回收装置:CT6000(日立化成制:商品名)进行CTC的回收作业。CTC回收装置具备用于导入血液样品或试剂的流路,流路的入口与对注射器进行加工而制作的贮液器连接。通过将血液样品、试剂依次投入到该贮液器中,能够容易地连续进行CTC的捕获、染色、洗涤等操作。
首先,在贮液器中导入2mM EDTA-10.0%FBS(胎牛血清)-PBS(Gibco制PBS、pH为7.4)1ml(以下称为洗涤液),充满至过滤器上,放置10分钟。随后,使用蠕动泵以200μL/分钟的流速开始送液。其后,投入悬浮液1。约5分钟后,向贮液器中导入9mL的洗涤液,进行细胞的洗涤。
接着,向盒中加入在PBS中溶解有4%PFA的溶液,浸渍细胞15分钟。
洗涤后,在盒中加入在洗涤液中溶解有0.2%TritonX的溶液,浸渍细胞15分钟。
进而,10分钟后,将泵流速变更为20μL/分钟,向贮液器中导入600μL的细胞染色液(Hoechst 33342:30μl、Wash buffer:300ml),对过滤器上的癌细胞或白细胞进行荧光染色。对过滤器上捕获的细胞进行30分钟染色,然后向贮液器中导入1mL的2mM EDTA-0.5%BSA-PBS,进行细胞的洗涤。
随后,使用装备有计算机控制式电子载物台及冷却数码相机(DP70、奥林巴斯株式会社)的荧光显微镜(BX61、奥林巴斯株式会社)观察过滤器,对过滤器上的癌细胞及白细胞的数量进行计数。
为了观察来自Hoechst 33342及Cell Tracker Red CMTPX的荧光,分别使用WU及WIG过滤器(奥林巴斯株式会社)获得图像。图像获得及分析软件使用Lumina Vision(三谷商事株式会社)。将结果示于表2。细胞回收率(%)=过滤器上回收的癌细胞数/混合于血液样品中的癌细胞数×100%。白细胞的数量通过用被Hoechst 33342染色的细胞数减去癌细胞数来计算。
(实施例2)
除了使最初的血液量不为7.5ml而为15ml以外,通过与实施例1同样的方法进行实施例2的实验。
(实施例3)
除了使最初的血液量不为7.5ml而为30ml以外,通过与实施例1同样的方法进行实施例3的实验。
将各实施例及比较例的结果示于表2。
表2
实施例 | 残留白细胞数 | 癌细胞回收率 |
比较例1 | 1862个 | 94.9% |
比较例2 | 4763个 | 89.8% |
比较例3 | 9865个 | 88.1% |
实施例1 | 18个 | 89.2% |
实施例2 | 48个 | 86.4% |
实施例3 | 99个 | 79.9% |
比较例1~3为不使用磁性珠进行实验的情况,白细胞的残渣多而不适于后续工作。实施例1~3为将比较例的细胞中的白细胞用磁性珠减少后导入过滤器的情况。在任意情况下白细胞都减少,能够适用于后续工作。不过,当进行磁性珠前的白细胞的数量多时,残留白细胞也与此相伴有增加的倾向。癌细胞的回收率进一步降低。优选使过滤器过滤后的白细胞数为1万个以下。
如上所示,通过本发明中所示的过滤器与利用抗原抗体反应进行的白细胞除去组合,能够与以往的过滤器相比,特性提高,后续工作成为可能。
符号说明
1 MCL
2 可剥离铜箔
2’ 铜板
3 光致抗蚀剂
3a 光致抗蚀剂曝光部分(曝光部)
3b 光致抗蚀剂显影部分(未曝光部)
4 光掩模
5 镀层
6 贯通孔
7 金镀层
Claims (24)
1.一种血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,其是从血液中提取血中稀少细胞的血中稀少细胞捕获方法,其具有在利用过滤器进行血液过滤后将白细胞除去的工序。
2.根据权利要求1所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述将白细胞除去的工序为利用磁性珠将白细胞除去的工序。
3.根据权利要求1或2所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述血液过滤之后获得的含有所述血中稀少细胞的液体中的白细胞数为1万个以下。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,在所述将白细胞除去的工序中或其后,具有对细胞悬浮液使用含有哺乳动物的血清、血浆或来自它们的蛋白的水溶液的工序。
5.根据权利要求4所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述哺乳动物的血清或血浆来自牛、马或人。
6.根据权利要求4所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述哺乳动物的血清或血浆来自胎牛。
7.根据权利要求4~6中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述哺乳动物的血清或血浆的水溶液浓度为1%~50%的范围。
8.根据权利要求4~7中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述血清或血浆的水溶液以磷酸缓冲液为主成分。
9.根据权利要求4~8中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述血清或血浆的水溶液含有抗凝剂。
10.根据权利要求9所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述抗凝剂为EDTA、肝素、柠檬酸钠及氟化钠中的任一种。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,在所述血液过滤之前,包含将过滤器浸渍到含有哺乳动物的血清或血浆的水溶液中的工序。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,在所述血液过滤之后且在将所述白细胞除去的工序之前,包含用含有哺乳动物的血清或血浆的水溶液对血液细胞进行洗涤的工序。
13.根据权利要求11或12所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述哺乳动物的血清或血浆来自牛、马或人。
14.根据权利要求11或12所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述哺乳动物的血清为胎牛血清或胎牛血浆。
15.根据权利要求1~14中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器表面为金、铂、钯或它们的合金。
16.根据权利要求15所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器以镍为主成分且其表面镀覆有金、铂、钯或它们的合金。
17.根据权利要求15所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器以铜为主成分且其表面镀覆有金、铂、钯或它们的合金。
18.根据权利要求15所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器以钯为主成分且其表面镀覆有金、铂或它们的合金。
19.根据权利要求15~18中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器的最外层为金镀层。
20.根据权利要求15~18中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器的最外层为0.05μm~1μm的贵金属镀层。
21.根据权利要求1~20中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述血中稀少细胞为癌细胞。
22.根据权利要求1~21中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器的贯通孔的开口形状为圆、楕圆、圆角长方形、长方形、正方形中的任意形状。
23.根据权利要求1~22中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器的贯通孔的开口形状包含长方形及圆角长方形中的一种以上的形状且其短边的长度为5μm~15μm。
24.根据权利要求1~23中任一项所述的血中稀少细胞捕获方法,其特征在于,所述过滤器的膜厚为3μm~50μm。
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