CN106565799B - 超临界二氧化碳萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素 - Google Patents

超临界二氧化碳萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超临界CO2萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素。本发明按照下述步骤进行，1：芝麻饼粕发酵，种子悬液浓度为0.86×108cfu/mL摇匀，于28℃恒温条件下发酵4天；2：贮罐进行加热，当达到49℃时，向仪器中打压CO2将气体液化，开启压缩机，关闭限压阀，进行CO2循环，对系统进行加压，调节压力至14.75MPa时，开启阀门，平衡体系内压力，关闭CO2气瓶，开始循环萃取；3：对上述木酚素粗提取液进行纯化。本发明得到的最佳萃取工艺条件为：萃取压力14.75MPa，萃取温度49℃，CO2流量38.74L/h，此时得到木酚素的最大提取率为11.14％，纯化后的木酚素含量达到0.7802％。

Description

超临界二氧化碳萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素
技术领域
本发明涉及超临界萃取技术领域，更具体地说，是涉及超临界CO2萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素。
背景技术
我国是芝麻生产大国，资源丰富，80％以上的芝麻用来榨取芝麻油，仅芝麻饼粕的年产量就在50万t以上。但目前芝麻饼粕主要作为饲料或肥料使用，极大地浪费了这部分资源，如何充分利用生产企业的下脚料进行深层次的加工综合利用，获取有利用价值的高附加值产品，从而获得较高的经济效益，对于资源得到更充分利用具有很深远的意义。
芝麻饼粕中的主要活性成分—木酚素类化合物具有强抗氧化活性，，具有消除体内自由基、降低血清中胆固醇、保护肝功能，促进醇代谢等多种生理活性功能。利用废弃的芝麻饼粕，从中提取芝麻木酚素类物质具有广阔的应用前景。
超临界萃取技术主要通过控制温度和压力来实现对目标物质的有效萃取，调节温度和压力改变了流体的密度和极性，从而增加萃取效率，之后在通过升温、降压分离流体和目标物质。
超临界萃取是一种高效、绿色的提取技术，从90年代初在国内外得到了迅速的发展。目前，超临界CO2萃取应用广泛，如在医药工业中，可用于中草药有效成份的提取，热敏性生物制品药物的精制，及脂质类混合物的分离；在食品工业中，啤酒花的提取，色素的提取等；在香料工业中，天然及合成香料的精制；化学工业中混合物的分离等。
国外对于芝麻的研究比较早，研究内容比较全面，但是大多数仅限于芝麻食品的研发。比如，通过仪器和感官评价相结合，对传统芝麻食品特性进行分析并改良其品质；为开发新型芝麻食品，除了采用新工艺，还详细研究了芝麻中的有效功能性成分，应用在食品开发中，寻求更有营养的健康食品；：从芝麻饼粕中提取芝麻素等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足，提供一种超临界CO2萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素。
本发明一种超临界CO2萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素，按照下述步骤进行：
A.芝麻饼粕发酵：将芝麻饼粕经过烘焙干燥处理后，取烘干的脱脂芝麻饼粕加入同等质量的蒸馏水中，于121℃灭菌20min，冷却后，接种同蒸馏水体积的制备好的种子悬液，种子悬液浓度为0.86×108cfu/mL摇匀，于28℃恒温条件下发酵4天；
B.按照CO2气瓶→贮罐→高压泵→萃取釜→分离釜Ⅰ→分离釜Ⅱ→循环的流程进行萃取：将发酵后的芝麻饼粕投入萃取釜，分别对萃取釜、分离釜I、分离釜II、贮罐进行加热，当达到49℃时，向仪器中打压CO2将气体液化，开启压缩机，关闭限压阀，进行CO2循环，对系统进行加压，调节压力至14.75MPa时，开启阀门，平衡体系内压力，关闭CO2气瓶，开始循环萃取，萃取过程保证恒温恒压，到达150min后，从出料口出料，得到含油脂和蛋白质的木酚素粗提取液；
C.对上述木酚素粗提取液进行纯化：a.用石油醚将硅胶溶解，倒入层析柱中，使硅胶自然沉降；
b.配置洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚体积比：1：9；
c.将上述准备的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂缓慢流出，然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内，用恒流泵保持液体流速恒定；
d.取1ml木酚素粗提取液上样，然后加入洗脱剂，通过恒流泵将洗脱剂在恒定速率下对提取液进行提取纯化。
所述步骤A中种子悬液的制备：将斜面培养的酱油曲霉霉菌抱子在培养温度28℃，培养一周，然后实用接种环将菌种接入发酵培养基，28℃摇床培养5天，转速220rpm，加入100mL无菌生理盐水，用接种针刮下，调节菌液浓度为0.86×108cfu/mL。
所述步骤C的步骤d中为了使在后来加入洗脱剂的过程中不破坏硅胶层的表面，在接近硅胶表层处加一块脱脂棉。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明得到的最佳萃取工艺条件为：萃取压力14.75MPa，萃取温度49℃，CO2流量38.74L/h，此时得到木酚素的最大提取率为11.14％，纯化后的木酚素含量达到0.7802％。在发酵最优条件下，即28℃下，在料液比为1：1的时候将干燥后的芝麻饼粕发酵4d，最佳萃取工艺参数最佳时，提纯后的木酚素提取率达到0.9603％。
附图说明
图1-1是发酵时间对木酚素提取率的影响图；
图1-2是湿度对木酚素提取率的影响图；
图1-3是发酵温度对木酚素提取率的影响图；
图2-1是萃取压力对木酚素提取率的影响；
图2-2是萃取温度对木酚素提取率的影响；
图2-3是CO2流量对木酚素提取率的影响；
图2-4a是萃取压力与萃取温度的交互作用图；
图2-4b是萃取压力与CO2流量的交互作用图；
图2-4c是萃取温度与CO2流量之间的交互作用图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
本发明超临界CO2萃取发酵芝麻饼粕中的木酚素，按照下述步骤进行：
A.芝麻饼粕发酵：将芝麻饼粕经过烘焙干燥处理后，取烘干的脱脂芝麻饼粕加入同等质量的蒸馏水中，于121℃灭菌20min，冷却后，接种同蒸馏水体积的制备好的种子悬液，种子悬液浓度为0.86×108cfu/mL摇匀，于28℃恒温条件下发酵4天；
B.按照CO2气瓶→贮罐→高压泵→萃取釜→分离釜Ⅰ→分离釜Ⅱ→循环的流程进行萃取：将发酵后的芝麻饼粕投入萃取釜，开启预制冷和预加热系统，当储液罐中的压力达到一定值时，开启压缩机，关闭限压阀，进行CO2循环，对系统进行加压，调节压力至14.75MPa时，开启阀门，平衡体系内压力，关闭CO2气瓶，开始循环萃取，萃取过程保证恒温恒压，到达150min后，从出料口出料，得到含油脂和蛋白质的木酚素粗提取液；
C.对上述木酚素粗提取液进行纯化：a.用石油醚将硅胶溶解，倒入层析柱中，使硅胶自然沉降；
b.配置洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚体积比：1：9；
c.将上述准备的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂缓慢流出，然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内，用恒流泵保持液体流速恒定；
d.取1ml木酚素粗提取液上样，然后加入洗脱剂，通过恒流泵将洗脱剂在恒定速率下对提取液进行提取纯化。
所述步骤A中种子悬液的制备：将斜面培养的酱油曲霉霉菌抱子在培养温度28℃，培养一周，然后实用接种环将菌种接入发酵培养基，28℃摇床培养5天，转速220rpm，加入100mL无菌生理盐水，用接种针刮下，调节菌液浓度为0.86×108cfu/mL。
所述步骤d中为了使在后来加入洗脱剂的过程中不破坏硅胶层的表面，在接近硅胶表层处加一块脱脂棉。
详细实验过程如下：
一、发酵条件的研究
1.培养方法
将斜面培养的酱油曲霉霉菌抱子在适宜的生长环境下进行培养，培养温度28℃，培养一周左右，然后一环将菌种接入发酵培养基，28℃摇床培养5天，转速220rpm，加入100mL无菌生理盐水，用接种针刮下，调节菌液浓度为0.86×108cfu/mL。
2.发酵处理和发酵工艺条件的探究
取100g烘干的脱脂芝麻饼粕加入100mL蒸馏水，于121℃灭菌20min，冷却后，接种100mL制备好的种子悬液，摇匀，于28℃恒温条件下发酵5天。以接种前后的质量变化为指标，分别测定不同发酵时间，水分浓度，温度值对萃取结果的影响。
3.发酵后的超临界萃取实验
选取超临界萃取的最适工艺条件，对发酵前和发酵后的芝麻饼粕进行超临界萃取实验，并对所得混合粗提取液进行提纯，测定发酵后芝麻饼粕中木酚素的含量。
4.实验结果
4.1培养时间对发酵结果的影响
由图1-1可见，随着时间的增加，培养基整体重量随之增加后至缓慢变化，然后呈降低趋势。这是由于随着发酵时间的增加，芝麻饼粕中的活性物质被提取完全，所以呈不变的趋势，但是随着时间延长，菌种的死亡腐败，活性物质的氧化，便发生了负增长。发酵第四天时，培养基的重量最高。
4.2湿度对发酵结果的影响
湿度是含水量的表现，由图1-2可见，图像呈先增加后降低趋势，当发酵培养基中含水量为100％时，也就是料液比为1：1时，发酵效果最好。这是因为，水分偏低时，酱油曲霉的生长繁殖收到限制，严重抑制微生物的生长；反之，当培养基中含水量过多时，则芝麻饼就会打结，粘结在一起，导致芝麻饼粕内部温度增高，产生局部“高温”现象，不适宜微生物的生长，因此培养基中含水量低于100％或高于100％，都将会影响到发酵的结果。
4.3温度对发酵结果的影响
温度对蛋白酶活性的影响极大。由图1-3可知，当培养温度为28℃时，发酵后芝麻饼粕的重量远远高出其他温度。这是因为低温适宜曲霉菌的生长，促进其积累蛋白酶的进程，产生的蛋白酶未被破坏，由于蛋白酶在酱油曲霉的孢子着生期产生最旺盛，对芝麻饼粕的发酵就越充分。随着温度增高，破坏了酱油曲霉的酶活性，对发酵会产生不可恢复的影响。
表7发酵前后木酚素含量的比较
由表7，对比发酵前后，利用超临界技术提取出来的木酚素含量有明显差距，印证了发酵有助于芝麻饼粕中木酚素的提取。综上所述，酱油曲霉发酵芝麻饼粕的适宜条件为：温度28℃，料液比1:1，发酵时间4d，纯化后的木酚素提取率可达到0.9603％。
二、木酚素的超临界CO2萃取
1.1实验材料
干燥的芝麻饼粕：芝麻饼粕来自天津市静海县一家普通油作坊，实验前经过烘焙干燥处理后，再进行粉碎，粉碎到40目。液态二氧化碳；蒸馏水
1.2实验仪器
LH-12型12L固液两用超临界萃取制备系统 青岛利和萃取科技有限公司
紫外分光光度计 岛津UV-2501PC型
物料粉碎机；电子天平
实验内容：
用无水乙醇为溶剂，准确称取分析纯标样2mg，溶解于1.0mL的无水乙醇中，配置成标准溶液储备液。将芝麻素和芝麻酚的标准品分别进行梯度浓度稀释，配成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mg/mL系列标准溶液。由文献已知，芝麻素的最大吸收波长为287nm，芝麻酚在波长为290nm时吸收峰最大。分别在287nm和290nm测对应两种标准品的吸光度，并绘制标准曲线。
表1芝麻素标准溶液吸光度值
芝麻素的线性回归方程：y＝26.940x+0.0716，相关系数R2＝0.9972。
表2芝麻酚标准溶液吸光度值
芝麻酚的线性回归方程：y＝27.020x+0.0022，相关系数R2＝0.9995
1.3木酚素的超临界CO2萃取
操作流程：CO2气瓶→贮罐→高压泵→萃取釜→分离釜Ⅰ→分离釜Ⅱ→循环。
操作内容：将芝麻饼粕粉碎后，每次取500g粉碎后的芝麻饼粕投入萃取釜，设置温度范围，将萃取温度、萃取压力和CO2流量作为考察对象，分别对萃取釜、分离釜I、分离釜II、贮罐进行加热或冷却，当达到所选定温度时，向仪器中打压CO2将气体液化，开启压缩机，关闭限压阀，进行CO2循环，对系统进行加压，调节压力至稳定值后，开启阀门，平衡体系内压力，关闭CO2气瓶，开始循环萃取，萃取过程保证恒温恒压，到达所选定的时间(150min)后，从出料口出料，得到含油脂和蛋白质的木酚素粗提取物，计算收率。
实验设计：粉料过筛目数为40目，每次投料量为500g，萃取时间2.5h，分离温度为45℃，分离压力为12MPa。依据实验条件设计单因素变量实验。
1.4粗提取物中木酚素含量的测定
由芝麻素和芝麻酚的标准曲线粗测定粗提取物中木酚素的含量，并对所测得的结果进行分析。
2.实验结果
2.1萃取釜压力对木酚素提取率的影响
由图2-1，可以看出在低压低温状态下，木酚素收率随压力的变化而处于平衡，在温差范围内，当压力达到14MPa时，木酚素收率升高，当压力达到17MPa时，收率突增，由此可得，在温度为40℃时，改变萃取压力，压力范围在5—20MPa之间木酚素收率会随着压力升高而增加。这是因为随着压力的增加，超临界CO2流体的密度增加，使木酚素粗提取物在CO2溶剂中的溶解度增加。
2.2萃取温度对木酚素提取率的影响
由图2-2，可以看出当萃取釜压力一定时，木酚素收率随着温度的增加呈先增后减趋势。当温度达到30℃时，芝麻素和芝麻酚的收率达到最大，随后在温度到达60℃时，木酚素收率骤减。原因是当萃取温度过高时，CO2液化程度低，循环过程中不能深入与芝麻饼粕表面接触，无法萃取完全，同时温度太高会导致木酚素类物质不稳定。所以，若想得到较高收率的木酚素时，温度不应该太高，维持在30℃即可。
2.3 CO2流量对木酚素提取率的影响
泵的工作频率从另一方面反映了CO2的流量，所以，研究泵工作频率和萃取效果的关系，也就是研究CO2流量与萃取效果之间的关系。由图2-3，可以看出萃取温度近似时，相同萃取时间内，木酚素产率随着CO2流量的增加呈现先增后减趋势。这是因为，随着CO2流量的增加，增大了萃取过程的传质推动力，从而增大了传质系数，使传质速率加快，由此提高了SCFE的萃取能力。但是当CO2流量太大时，会造成萃取器内CO2流速加快，CO2停留时间缩短，与被萃取物的接触时间减少，不利于萃取率的提高。所以，通过控制泵的工作频率，来合理选择CO2流量在SCFE中是很重要的。
2.4响应面优化实验
2.4.1建立回归方程
在单因素实验的基础上，继续将萃取压力、萃取温度和CO2流量作为实验变量，应Box-Behnken中心设计原理，设计三因素三水平实验，采用响应面法进行优化提取。实验设计及结果见表3和表4。
表3 Box-Behnken设计试验因素水平
表4试验方案及试验结果
表2为试验方案与结果，利用软件Design-Expert 8.0.6分析试验结果，得到回归方程如下：
Y＝-45.7875+3.25875A+1.3904B+0.37885C+0.024AB+1.83333×10-3AC+4.2×10-3BC-0.13053A2-0.03089B2-5.5910-3C2。
2.4.2回归方程的检验
表5二次多项回归模型方程方差分析结果
注：A为萃取压力/MPa；B为萃取温度/℃；C为CO2流量/L/h；**：P<0.01，检验水平上极为显著；*：P<0.05检验水平上显著。
从模型方差见由表5可知，可以看出模型回归有显著性差异，回归方程的决系数R2＝0.9704>AdjR2＝0.9323，回归方程拟合良好，模型的响应面变化不是一般的线性关系，较为复杂，曲面效应显著。说明该模型与实际萃取情况拟合良好，具有较高的可信度。
2.4.3各因素的交互作用
根据回归方程分别绘制萃取压力与萃取温度的交互作用、萃取压力与CO2流量的交互作用及萃取温度与CO2流量之间的交互作用对芝麻油提取率影响的响应面图。
由图2-4a是萃取压力与萃取温度的交互作用图，图2-4b萃取压力与CO2流量的交互作用图；图2-4c是萃取温度与CO2流量之间的交互作用图；可知萃取压力与萃取温度的交互作用对提取率的影响显著，而萃取压力和CO2流量的交互作用、萃取温度和CO2流量相互作用对提取率的影响不显著。
通过软件Design-Expert 8.0.6预测出亚临界CO2提取黑芝麻饼粕中芝麻油的优化条件为：萃取压力14.75MPa，萃取温度49℃，CO2流量38.74L/h。
2.5结论
萃取压力是影响提取率的主要因素。当萃取温度达到49℃时，提取率达到最大。随着萃取压力和温度的提升，木酚素的提取率在进一步提高，当萃取压力达到13.92MPa,温度达到48.37℃，提取率达到最大值10.57％。萃取压力和CO2流量之间的交互作用对提取率影响不显著，萃取压力是影响木酚素提取率的主要因素，当萃取压力达到14.75MPa时，木酚素的提取率达到最大。同样，萃取温度和CO2流量之间的交互作用对饼粕中芝麻木酚素的优化条件为：萃取压力14.75MPa，萃取温度49℃，CO2流量对提取率影响不显著。通过软件Design-Expert8.0.6预测出亚临界CO2提取芝麻饼粕38.74L/h。此时木酚素的最大提取率为11.14％。
3木酚素的纯化
3.1实验材料
乙酸乙酯(分析纯)；石油醚(分析纯)；硅胶200目。
3.2实验器材
硅胶柱2cm×20cm；恒流泵。
3.3实验内容
3.3.1层析柱的装置
先在层析柱底部放置一小块脱脂棉，然后放入少量的流动相。打开旋钮进行排气，并在之后的实验中保持阀门处于打开状态。用石油醚将硅胶溶解，倒入层析柱中，使硅胶自然沉降。
3.3.2洗脱剂的确定
硅胶层析法是通过不同物质在硅胶层上的吸附性能不同而实现物质的分离，与洗脱剂的选取和物质的极性有关。本项目中所涉及的木酚素类物质极性较小，故采用乙酸乙酯：石油醚系统作为洗脱剂(1：9)。
3.3.3湿法装柱
装柱前，为了防止吸附剂外漏，需要在硅胶柱底部放置一层脱脂棉。将最初准备使用的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂缓慢流出。然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内(或将硅胶与适量洗脱剂调成混悬液慢慢加入柱内)，硅胶依靠重力和洗脱剂的带动，在柱内自由沉降，此间要不断把流出的洗脱剂加回柱内保持一定的液面，直至把硅胶加完并在柱内沉降不再变动为止。然后在硅胶上面加一小片滤纸或少许脱脂棉。硅胶沉降完成后，加入更多的流动相。根据加样量控制洗脱剂液面至一定高度。用恒流泵保持液体流速恒定。
3.3.4芝麻木酚素的纯化
选取超临界萃取条件下较好的三组实验所得的混合溶液，取1ml粗提取液上样，然后加入洗脱剂，为了使在后来加入洗脱剂的过程中不破坏硅胶层的表面，所以需要在接近硅胶表层处加一块脱脂棉。通过恒流泵将洗脱剂在恒定速率下对提取液进行提取纯化。每组提纯分别做三次，求取平均吸光度值。
3.3.5提纯后木酚素的测定
通过紫外光分光光度计测定提纯后的芝麻素和芝麻酚的吸光度值，并结合标准回归曲线，分别得到芝麻素和芝麻酚的提取率。
3.4实验结果
表6纯化后芝麻木酚素的提取率
有表6可得，对三组代表性萃取实验所得粗产物进行纯化，综合平均值，得到木酚素的提取率0.7802％。

Claims (2)

1.一种超临界二氧化碳萃取发酵芝麻饼粕中木酚素的方法，其特征是，按照下述步骤进行：
A.芝麻饼粕发酵：将芝麻饼粕经过烘焙干燥处理后，取烘干的脱脂芝麻饼粕加入同等质量的蒸馏水中，于121℃灭菌20min，冷却后，接种同蒸馏水体积的制备好的种子悬液，种子悬液浓度为0.86×108cfu/mL摇匀，于28℃恒温条件下发酵4天，所述种子悬液的制备方法为：将斜面培养的酱油曲霉霉菌孢子在培养温度28℃，培养一周，然后使用接种环将菌种接入发酵培养基，28℃摇床培养5天，转速220rpm，加入100ml无菌生理盐水，用接种针刮下，调节菌液浓度为0.86×108cfu/ml；
B.按照CO2气瓶→贮罐→高压泵→萃取釜→分离釜Ⅰ→分离釜Ⅱ→循环的流程进行萃取：将发酵后的芝麻饼粕投入萃取釜，分别对萃取釜、分离釜I、分离釜II、贮罐进行加热，当达到49℃时，向仪器中打压CO2将气体液化，开启压缩机，关闭限压阀，进行CO2循环，对系统进行加压，调节压力至14.75MPa时，开启阀门，平衡体系内压力，关闭CO2气瓶，开始循环萃取，萃取过程保证恒温恒压，到达150min后，从出料口出料，得到含油脂和蛋白质的木酚素粗提取液；
C.对上述木酚素粗提取液进行纯化：a.用石油醚将硅胶溶解，倒入层析柱中，使硅胶自然沉降；
b.配置洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚体积比：1：9；
c.将上述准备的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂缓慢流出，然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内，用恒流泵保持液体流速恒定；
d.取1ml木酚素粗提取液上样，然后加入洗脱剂，通过恒流泵将洗脱剂在恒定速率下对提取液进行提取纯化。
2.根据权利要求1所述的超临界二氧化碳萃取发酵芝麻饼粕中木酚素的方法，其特征是，所述步骤C的步骤d中为了使在后来加入洗脱剂的过程中不破坏硅胶层的表面，在接近硅胶表层处加一块脱脂棉。
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