CN110029019A - 超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，包括以下步骤：将微藻发酵液制备成微藻冻干粉；将微藻冻干粉和直径为2～5mm玻璃微珠混匀后作为物料装入萃取釜内；夹带剂乙醇和CO2形成的超临界CO2夹带乙醇流体对萃取釜内的物料进行提取，提取时间为2.5～3h；含乙醇的微藻油脂从分离釜底部出口处被排出并收集。本发明的方法采用超临界二氧化碳夹带乙醇流体，具有无毒、选择性强、绿色环保、极性可调、可回收利用等优点，与传统的有机溶剂提取法相比，具有安全无毒的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的工艺。
背景技术
裂殖壶藻(Schizochytrium sp.)是一种常见的微藻，其生长周期远低于动物，因此通过发酵调控非常易于规模化培养，发酵后的藻细胞中总油脂含量可高于70％，其中ω-3长链多不饱和脂肪酸特别是二十二碳六烯酸(DHA)含量约为总油脂的30-50％，是一种理想的可替代深海鱼油的DHA生产原料。随着我国节能减排政策的推行及深化，相关环境友好的油脂绿色提取技术已成为研发热点。其中，超临界二氧化碳(scCO2)萃取工艺因其高压、低温、隔氧的操作环境，非常适用于提取易氧化、热敏性的低极性脂类物质，与传统的有机溶剂提取工艺相比，不存在毒性成分残留问题，已在微生物油脂生产加工领域显现出一定的优势及应用前景。
然而，裂殖壶藻细胞中，90％以上的油脂是以甘油三酯的形式存在，其分子电荷排布均匀，属于中极性脂，并含有少量的磷脂、糖脂等极性油脂。显然，传统纯超临界CO2流体更适合提取非极性的物料，对中性脂的提取而言，并不是理想的选择。
中国专利CN106635405公布了一种从微藻粉中超临界萃取DHA油脂的方法，利用膨化机对微藻粉进行膨化处理，使微藻粉破壁，再通过超临界二氧化碳萃取油脂；该发明油脂回收率高，但膨化温度高达40～100℃，对热敏性、易氧化的长链多不饱和脂肪酸，存在负面影响。
中国专利CN102181320A公开了一种生物发酵DHA藻油的提取方法，以乙醇为助溶剂，将乙醇喷洒在微藻粉上，再通过超临界二氧化碳萃取油脂，提高了油脂回收率。然而，在提取过程中，作为助溶剂的乙醇会随着提取进行逐渐流失，助溶剂对超临界流体的溶解能力及传质性能的影响随之减弱，并不能充分利用助溶剂在在油脂回收过程中的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种组成稳定、工艺简洁、提取率高的利用超临界二氧化碳夹带乙醇流体从微藻粉中提取油脂的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，包括以下步骤：
1)、原料的预处理：将微藻发酵液离心，所收集的微藻细胞冷冻干燥后研磨，得到微藻冻干粉；
2)、物料装填：将微藻冻干粉和直径为2～5mm玻璃微珠以1:(0.95～1.05)的质量比混匀后，作为物料被装入萃取釜内；
3)、超临界二氧化碳流体的制备和夹带剂乙醇的使用：
CO2通过柱塞泵加压后进入萃取釜内，设定萃取釜内压力25～45Mpa、温度为40～60℃，从而保证提取过程中CO2处于超临界状态；
在高效液相泵的作用下，作为夹带剂的乙醇与柱塞泵泵出的CO2经混合器的混合后被预热线圈加热至萃取釜的设定温度后进入萃取釜内，乙醇摩尔分率为0.04～0.09mol/mol，形成了超临界CO2夹带乙醇流体；
备注：CO2需要用冷媒冷却是因为压缩气体需要释放大量热量，必须用冷媒带走热量；
4)、微藻油脂的提取：
超临界CO2夹带乙醇流体对萃取釜内的物料进行提取，提取时间为2.5～3h；所得的提取液连同超临界CO2夹带乙醇流体经萃取釜出口的膨胀阀后进入分离釜内进行气液分离，在位于分离釜底部出口处的蠕动泵作用下，含乙醇(少量乙醇)的微藻油脂从分离釜底部出口处被排出并收集，CO2气体在分离釜顶部(分离顶部)被排出；
注：从分离釜顶部排出的CO2通过气体转子流量计后可以得知CO2用量，从而进一步得知作为夹带剂的乙醇的用量；被提取后的物料仍然位于萃取釜内。
作为本发明的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法的改进：
联动调节柱塞泵和萃取釜出口处的膨胀阀将CO2流速恒定为4.9-5.1L/min。
注：萃取釜和分离釜的容积均约为500mL。
作为本发明的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法的进一步改进：
步骤3)中，萃取釜内压力37～39Mpa、温度50～52℃、乙醇摩尔分率0.04～0.05mol/mol。
作为本发明的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法的进一步改进：步骤1)中，
所述离心为于(4±0.5)℃，(8000±800)r/min下对微藻发酵液进行离心20±5分钟；
微藻细胞于-53℃，0.1mbar的条件下冷冻干燥至恒重，研磨至过80目筛(用80目标准筛筛分)，得到微藻冻干粉。
作为本发明的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法的进一步改进：所述步骤4)中，设置分离釜于(40±1)℃的温度、(4±0.2)Mpa的压力进行减压分离。
在本发明中，
1、微藻发酵液是指将裂殖壶藻(Schizochytrium sp.)经常规的分批补料发酵培养法所得；
每升微藻发酵液中含有100-120g裂殖壶藻细胞(以干重计)。
2、步骤1)所得的微藻冻干粉外观呈粉状，淡黄色，油脂含量在24.9％(w/w)。
3、在微藻冻干粉中加入玻璃微珠的目的是为了提高物料(微藻冻干粉)的孔隙率，从而提高油脂的回收率。
4、在提取过程中，温度和压力条件保持不变，CO2通过柱塞泵加压，其流速不变，乙醇流量由高效液相泵(双活塞往复泵)精确控制，从而确保提取过程中，超临界流体的组成稳定、物理化学性质无明显差异。
5、本发明乙醇加量的确定方法为：首先根据查阅得到的热力学数据，绘制50℃(即323K)下二氧化碳-乙醇气液相平衡图，如图1所示，确定超临界二氧化碳夹带乙醇的操作压力应大于临界压力(Pc，9.05MPa)，且对应的二氧化碳摩尔分率应大于其临界摩尔分率(xc，0.93mol/mol)，由此可确定夹带剂乙醇的摩尔分率应控制在0～0.07mol/mol的范围内。以此类推，进一步查阅了313～333K(40～60℃)下气液平衡数据，最终在各项优化工艺参数下，确定超临界CO2夹带乙醇流体中乙醇摩尔分率为0.04～0.09mol/mol。
6、在本发明中，根据提曲过程曲线的动力学分析，设定超临界二氧化碳夹带乙醇的最佳提取时间为3h。
每隔30min取样，称重计算油脂回收率，进行提取过程的动力学分析。选取了温度(40-60℃)、压力(25-45Mpa)、乙醇摩尔分率(0-0.09mol/mol)的边界值作为操作条件，分别绘制了提取过程曲线，如图2所示。尽管不同操作条件下，微藻油脂的提取速率各不相同，但提取3h后均能进入扩散控制期，即可达到操作条件下最大油脂回收率。由此确定超临界二氧化碳夹带乙醇提取微藻油脂的操作时间为3h。
油脂回收率计算公式：
一般而言，有机溶剂提取可视为微藻油脂的完全提取方法(如对比例1所述)，为便于比较工艺，本发明定义了上述油脂回收率，即各工艺提取得到的油脂质量占有机溶剂提取得到的总油脂质量的百分比。
本发明的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的工艺，是采用超临界二氧化碳夹带乙醇流体从微藻干粉中提取油脂；具体为以微藻干粉为原料，利用柱塞泵及高效液相泵分别给二氧化碳、乙醇加压，形成摩尔比一定的超临界二氧化碳夹带乙醇流体，提取富含多不饱和脂肪酸油脂的方法。
本发明中，二氧化碳可回收利用，提取工艺绿色环保，提取后的微藻废渣(位于萃取釜内)可用于微藻蛋白、多糖等物质的提取。
本发明中，乙醇由高效液相泵(双活塞往复泵)精准控制夹带剂乙醇的流速，同时，二氧化碳流速固定为4.9-5.1L/min，提取过程中，流体组成稳定。此外，由于夹带剂乙醇的加入，超临界流体的密度增大，极性增强，油脂在流体中的溶解度增大，与未使用夹带剂的纯超临界二氧化碳萃取相比，油脂回收率从71.9％提高到了88.2％。
本发明中，由于乙醇的使用量仅为0.04～0.09mol/mol，不易在微藻油脂中产生残留，无需后续除去溶剂，具有操作简洁的的优势。
在本发明设定的最佳工艺条件下，微藻油脂的回收率约为88.2％，显著高于纯超临界CO2萃取的回收率(71.9％)。
本发明所得的微藻油经乙酰氯甲醇溶液直接甲酯化后，得到脂肪酸甲酯，经气相色谱分析，主要成分为软脂酸、硬脂酸、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等，其中在本发明设定的最佳工艺条件下所得的微藻油，DHA含量高达39.9％，总不饱和脂肪酸含量可超过50％。
本发明的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，具有如下技术优势：
1)、夹带剂乙醇的使用扩大了超临界流体的极性范围，根据二氧化碳-乙醇气液平衡曲线，确定了夹带剂乙醇加入量的范围；
2)、超临界二氧化碳夹带乙醇更适用于提取中极性脂，对微藻油脂的溶解能力及传质性能显著提高，提取更加充分，产品回收率高；
3)、操作过程低温、隔氧，对具有热敏性、易氧化的多不饱和脂肪酸具有保护作用。
综上所述，本发明的方法采用超临界二氧化碳夹带乙醇流体，具有无毒、选择性强、绿色环保、极性可调、可回收利用等优点，与传统的有机溶剂提取法相比，具有安全无毒的优势。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为1CO2-乙醇气液相平衡图(323K)。
图2为超临界CO2夹带乙醇萃取裂殖壶藻油脂的提取过程曲线。
图3为超临界二氧化碳夹带乙醇萃取装置的示意图；
1.CO2钢瓶 2.低温水槽 3.柱塞泵 4.试剂瓶 5.高效液相泵 6.单向阀 7.混合器8.预热线圈 9.萃取釜 10.压力表 11.温度计 12.膨胀阀 13.分离釜 14.压力表 15.转子流量计 16.阀门 17.蠕动泵 18.样品收集瓶。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例在如图3所示的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取装置中进行。其中，CO2通过柱塞泵3加压，乙醇通过高效液相泵5(双活塞往复泵)精确控制流速。
装置实例1、一种超临界二氧化碳夹带乙醇萃取装置，如图3所述，由CO2进料模块A、乙醇进料模块B、提取模块C、分离模块D、CO2流量测量模块E、样品收集模块F组成；
CO2进料模块A包括CO2钢瓶1、低温水槽2、柱塞泵3，乙醇进料模块B包括试剂瓶4、高效液相泵5、单向阀6，提取模块C包括混合器7、预热线圈8、萃取釜9、压力表10、温度计11、膨胀阀12，分离模块D包括分离釜13、压力表14，CO2流量测量模块E包括转子流量计15(转子流量计15自带阀门)，样品收集模块F包括阀门16、蠕动泵17、样品收集瓶18。
CO2钢瓶1、低温水槽2、柱塞泵3依次相连；试剂瓶4、高效液相泵5、单向阀6依次相连；
萃取釜9上分别设有压力表10、温度计11，柱塞泵3的出口、单向阀6的出口分别与混合器7的进口相连，混合器7的出口通过预热线圈8后与萃取釜9的进口相连；萃取釜9的出口通过膨胀阀12后与分离釜13的进口相连；分离釜13上设有压力表14，分离釜13的顶部出口与转子流量计15相连，分离釜13的底部出口依次通过阀门16、蠕动泵17后与收集瓶18相连。
CO2进料模块A的主要作用是制备萃取所需的特定条件的超临界CO2流体，同时控制超临界CO2流体的流速；乙醇进料模块B的主要作用是精确控制夹带剂乙醇流速；提取模块C中，混合器7将来自CO2进料模块A的超临界CO2流体和来自乙醇进料模块B的乙醇充分混合，再经预热线圈8进行温度补偿后，最终进入萃取釜9形成了设定条件的超临界CO2夹带乙醇流体，从而对萃取釜9内的微藻粉物料进行萃取，萃取后含少量乙醇的微藻油脂(即，含有提取物微藻油脂的流体)由萃取釜9的底部出口排出，通过膨胀阀12进行泄压后进入到分离模块D的分离釜13内，在分离釜13内实现气液分离，从分离釜13的顶部出口被排出的接近常压状态的CO2，通过压力表14的示数和转子流量计15的示数，计算CO2的质量流量，从而计算得知作为夹带剂的乙醇的用量；分离釜13内的液体从分离釜13的底部出口排出后，经过阀门16，再蠕动泵17的作用下，被泵入至收集瓶18内。
阀门16为分离釜13底部的放料阀，通过调节转子流量计15上的阀门可相应调节分离釜13内的压力。
本发明中，萃取釜9和分离釜13的容积均为500mL。
实施例1、一种超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的工艺，依次进行以下步骤：
1)、原料的预处理：
在4℃，8000r/min下对微藻发酵液进行离心20分钟，收集得到微藻细胞，然后在-53℃，0.1mbar的条件下，冷冻干燥至恒重，经研磨，过80目筛，制备得到微藻冻干粉。
2)、提取：
称取20.0g微藻冻干粉，与等质量(20g)玻璃微珠(玻璃微珠的粒径约为2-3mm)混匀，置于超临界萃取系统的萃取釜9中，设置萃取釜9内的温度为50-52℃、压力为37-39MPa，利用柱塞泵3给CO2加压，控制流速为5L/min(CO2在25℃，0.1MPa下的流速)，联动调节柱塞泵3和萃取釜9出口处的膨胀阀12实现CO2流速的控制；同时通过高效液相泵5控制夹带剂乙醇的流速(约0.48mL/min)，实现流体中乙醇摩尔分率为0.04mol/mol，从而形成了超临界CO2夹带乙醇流体，即形成组成稳定的超临界流体，用于提取微藻油脂。提取时间为3h；
其中，
3)分离：
在分离釜13中，设置分离釜13温度为40℃，压力为4MPa，每隔30min，称量分离釜底部的样品收集瓶18的重量，计算该时刻提取得到微藻油脂的重量，绘制提取曲线(用于了解油脂是否被完全提取)。3小时后，共获得微藻油脂4.39g，回收率为88.2％。
将上述微藻油脂经10％(w/w)的乙酰氯甲醇溶液甲酯化后，进行气相色谱分析，其成分及含量(体积含量)如下：肉豆蔻酸6.0％、软脂酸38.8％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.6％、油酸2.7％、二十二碳五烯酸(DPA)7.9％、二十二碳六烯酸(DHA)39.9％。
与此同时，CO2气体在分离釜13顶部排出，用气体转子流量计(15)可以估算CO2用量。
实施例2、一种超临界二氧化碳萃取微藻油脂的工艺，
相对于实施例1的步骤2)作如下改动：通过高效液相泵5控制夹带剂乙醇的流速(约为0.62mL/min)，从而使流体中乙醇摩尔分率为0.05mol/mol，其余等同于实施例1。提取时间不变，仍为3小时。
共得到微藻油脂4.24g；回收率为85.1％。
将上述微藻油脂经10％(w/w)的乙酰氯甲醇溶液甲酯化后，进行气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸6.1％、软脂酸40.3％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.5％、油酸2.7％、二十二碳五烯酸(DPA)7.4％、二十二碳六烯酸(DHA)38.2％。
实施例3、一种超临界二氧化碳萃取微藻油脂的工艺，
相对于实施例1的步骤2)作如下改动：“压力为37～39MPa”改成“压力为34～36MPa”，其余等同于实施例1。提取时间不变，仍为3小时。
共得到微藻油脂4.20g；回收率为84.3％。
将上述微藻油脂经10％(w/w)的乙酰氯甲醇溶液甲酯化后，进行气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸6.2％、软脂酸40.7％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.9％、油酸2.7％、二十二碳五烯酸(DPA)7.1％、二十二碳六烯酸(DHA)38.6％。
对比例1、一种超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的工艺，依次进行以下步骤：
1)、原料的预处理：同实施例1。
2)、提取：称取20.0g微藻冻干粉，装入滤纸筒，以正己烷(300ml)为溶剂，采用索氏提取法，在80℃下抽提24h。
3)分离：在50℃下，旋转蒸发除去正己烷，获得微藻油脂4.98g。
将上述该方法提取到的油脂，经10％(w/w)的乙酰氯甲醇溶液甲酯化后，进行气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸5.8％、软脂酸39.4％、硬脂酸1.3％、油酸2.8％、二十二碳五烯酸(DPA)9.1％、二十二碳六烯酸(DHA)37.7％。
因此，本发明的实施例1～实施例3相对于上述对比例1而言，技术优点为油脂回收率与有机溶剂提取法基本相当，但是本发明的有机溶剂使用量少、无需后续蒸发溶剂、产品DHA含量高。
对比例2、将实施例1步骤2)作如下改动：不使用任何夹带剂，即流体中乙醇摩尔分率为0，其余等同于实施例1。提取时间不变，仍为3小时。
共得到微藻油脂3.58g；回收率为71.9％。
将上述微藻油脂经10％(w/w)的乙酰氯甲醇溶液甲酯化后，进行气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸6.4％、软脂酸40.7％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.9％、油酸2.7％、二十二碳五烯酸(DPA)7.1％、二十二碳六烯酸(DHA)36.6％。
对比例3、一种超临界二氧化碳萃取微藻油脂的工艺，
相对于实施例1的步骤2)作如下改动：改变夹带剂乙醇的流速(约为1.16mL/min)，从而使流体中乙醇摩尔分率改为0.09mol/mol，其余等同于实施例1。提取时间不变，仍为3小时。
共得到微藻油脂3.46g；回收率为69.5％。
将上述微藻油脂经10％(w/w)的乙酰氯甲醇溶液甲酯化后，进行气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸6.3％、软脂酸41.4％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.9％、油酸2.7％、二十二碳五烯酸(DPA)7.5％、二十二碳六烯酸(DHA)36.8％。
对比例4、设置萃取釜9内温度为40-42℃，压力为25-27Mpa；其余等同于实施例1。提取时间不变，仍为3小时。
共得到微藻油脂1.44g；回收率为28.8％。
经气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸6.9％、软脂酸41.7％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.9％、油酸2.8％、二十二碳五烯酸(DPA)7.4％、二十二碳六烯酸(DHA)34.9％。
对比例5、设置萃取釜9内温度为58-60℃，压力为43-45MPa，其余等同于实施例1。提取时间不变，仍为3小时。
共得到微藻油脂3.01g；回收率为60.4％。
经气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸6.7％、软脂酸42.6％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.8％、油酸2.7％、二十二碳五烯酸(DPA)7.4％、二十二碳六烯酸(DHA)34.8％。
对比例6、取消实施例1步骤2)中玻璃微珠的使用，其余等同于实施例1。提取时间不变，仍为3小时。
共得到微藻油脂2.97g；回收率为59.6％。
经气相色谱分析，其成分及含量如下：肉豆蔻酸6.8％、软脂酸41.5％、硬脂酸1.3％、十六碳一烯酸2.9％、油酸2.8％、二十二碳五烯酸(DPA)7.2％、二十二碳六烯酸(DHA)35.1％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、原料的预处理：将微藻发酵液离心，所收集的微藻细胞冷冻干燥后研磨，得到微藻冻干粉；
2)、物料装填：将微藻冻干粉和直径为2～5mm玻璃微珠以1:(0.95～1.05)的质量比混匀后，作为物料被装入萃取釜内；
3)、超临界二氧化碳流体的制备和夹带剂乙醇的使用：
CO2通过柱塞泵加压后进入萃取釜内，设定萃取釜内压力25～45Mpa、温度为40～60℃；
在液相泵的作用下，作为夹带剂的乙醇与柱塞泵泵出的CO2经混合器的混合后被预热线圈加热至萃取釜的设定温度后进入萃取釜，乙醇摩尔分率为0.04～0.09mol/mol，形成了超临界CO2夹带乙醇流体；
4)、微藻油脂的提取：
超临界CO2夹带乙醇流体对萃取釜内的物料进行提取，提取时间为2.5～3h；所得的提取液连同超临界CO2夹带乙醇流体经萃取釜出口的膨胀阀后进入分离釜内进行气液分离，在位于分离釜底部出口处的蠕动泵作用下，含乙醇的微藻油脂从分离釜底部出口处被排出并收集，CO2气体在分离釜顶部被排出。
2.根据权利要求1所述的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，其特征是：
联动调节柱塞泵和萃取釜出口处的膨胀阀将CO2流速控制为4.9-5.1L/min。
3.根据权利要求1或2所述的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，其特征是：
所述步骤3)中，萃取釜内压力37～39Mpa、温度50～52℃、乙醇摩尔分率0.04～0.05mol/mol。
4.根据权利要求1～3任一所述的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，其特征是步骤1)中，
所述离心为于(4±0.5)℃，(8000±800)r/min下对微藻发酵液进行离心20±5分钟；
微藻细胞于-53℃，0.1mbar的条件下冷冻干燥至恒重，研磨至过80目筛，得到微藻冻干粉。
5.根据权利要求1～3任一所述的超临界二氧化碳夹带乙醇萃取微藻油脂的方法，其特征是：所述步骤4)中，设置分离釜于(40±1)℃的温度、(4±0.2)Mpa的压力进行减压分离。
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