CN109790560B - 生产及分离脂质的方法 - Google Patents

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Abstract

提供生产例如槐糖脂的脂质的方法。还提供用于所述生产的设备。

Description

生产及分离脂质的方法
技术领域
本发明涉及脂质的生产，特别是(但不限于)涉及槐糖脂的生产；本发明还涉及用于所述生产的设备。
背景技术
已知脂质的微生物生产，并且特别是如槐糖脂的糖脂的微生物生产。槐糖脂由与疏水性脂肪酸结合的亲水性槐糖二糖组成，该疏水性脂肪酸具有16-18个碳原子的典型链长。脂肪酸可以通过酯键与第二个葡萄糖单体连接，产生内酯槐糖脂，或仅与一个葡萄糖单体结合，由于未结合的脂肪酸而产生酸性槐糖脂。脂肪酸链以及槐糖分子的乙酰化的这些和其它差异，产生一系列不同的结构和性质。
虽然几种酵母菌株能够合成槐糖脂，但是大多数工业使用集中于假丝酵母菌(Candida bombicola)ATCC 22214。使用植物油和葡萄糖为底物，在假丝酵母菌液体深层发酵(submerged C.bombicola fermentations)中，可以实现在约2g·L-1·h-1的生产率下生产浓度大于300g·L-1的槐糖脂。
已知在发酵器中使用间歇进料发酵的脂质生产，例如槐糖脂的生产。槐糖脂生产发酵始于细胞生长阶段，其通常持续到培养基中的氮耗尽为止，此时，如果同时存在亲水性和疏水性碳源，则脂质生产速率显著增加。槐糖脂生产阶段约持续200h，此时由于氧气传质限制，不能保持发酵器中的溶解氧水平。这是由于产生的槐糖脂的高粘性导致的，这意味着必须停止发酵并回收槐糖脂。
利用已知的生产方法，由于产生气/液界面间的传质阻力并增加了培养基粘度，发酵器中存在的分离的槐糖脂相显著降低氧传质系数kLa，这导致氧气限制、搅拌功率需要量增加以及发酵器中的不均匀性。
因此，本发明旨在解决与现有技术相关的至少一个缺点，该缺点无论是否在本文中讨论或以其他方式讨论。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供一种生产脂质的方法，其中，该方法包括：
(a)在发酵器中进行发酵以生产含有脂质产物的培养液；
(b)将含有脂质产物的培养液从所述发酵器转移到分离器；
(c)使含有脂质产物的脂质相在所述分离器中与所述培养液的其他成分分离；
(d)使已分离出脂质产物的培养液从所述分离器返回至所述发酵器；以及
(e)从所述分离器转移脂质产物。
适当地，所述方法包括生产脂质，所述脂质选自由烃、萜、脂肪、油、脂肪酸、糖脂和其他化合物所组成的组中，所述脂质含有生物体产生的分子，所述分子不溶于水或为两亲性的，并且通常可溶于非极性溶剂。
适当地，所述方法包括生产脂质，所述脂质选自由烃、萜、脂肪、油、脂肪酸和糖脂所组成的组中。
适当地，所述方法包括生产脂质，所述脂质选自由萜、脂肪、油、脂肪酸和糖脂所组成的组中。
适当地，所述方法包括生产萜的方法。适当地，所述脂质产物包含萜。脂质产物可以由萜组成。
适当地，步骤(d)包括使已分离出脂质相的培养液从所述分离器返回至所述发酵器，所述脂质相含有萜。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有萜的脂质相。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有萜的脂质产物相。
适当地，所述方法包括生产糖脂的方法。适当地，所述脂质产物包含糖脂。所述脂质产物可以由糖脂组成。
适当地，步骤(d)包括使已分离出脂质相的培养液从所述分离器返回所述发酵器，所述脂质相含有糖脂。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有糖脂的脂质相。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有糖脂的脂质产物相。
适当地，提供一种生产脂质的方法，其中，所述方法包括：
(a)在发酵器中进行发酵以产生含有糖脂的培养液；
(b)将含有糖脂的培养液从所述发酵器转移到分离器中；
(c)使含有糖脂的脂质相在所述分离器中与所述培养液的其他成分分离；
(d)使已分离出糖脂的培养液从所述分离器返回至所述发酵器中；以及
(e)从所述分离器转移糖脂。
适当地，所述方法包括生产脂质的方法，所述脂质选自槐糖脂、鼠李糖脂和甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritol lipids)。适当地，所述脂质产物含有选自槐糖脂、鼠李糖脂和甘露糖赤藓糖醇脂的一种或多种脂质。所述脂质产物可以由选自槐糖脂、鼠李糖脂和甘露糖赤藓糖醇脂的一种或多种脂质组成。
适当地，步骤(d)包括使已分离出脂质相的培养液从所述分离器返回所述发酵器，所述脂质相含有槐糖脂、鼠李糖脂和/或甘露糖赤藓糖醇脂。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有槐糖脂、鼠李糖脂和/或甘露糖赤藓糖醇脂的脂质相。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有槐糖脂、鼠李糖脂和/或甘露糖赤藓糖醇脂的脂质产物相。
适当地，所述方法包括产生槐糖脂的方法。适当地，所述脂质产物包含槐糖脂。所述脂质产物可以由槐糖脂组成。
适当地，步骤(d)包括使已分离出脂质相的培养液从所述分离器返回所述发酵器，所述脂质相含有槐糖脂。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有槐糖脂的脂质相。适当地，步骤(e)包括从所述分离器转移含有槐糖脂的脂质产物相。
适当地，提供一种生产脂质的方法，其中，所述方法包括：
(a)在发酵器中进行发酵以生产含有槐糖脂的培养液；
(b)将含有槐糖脂的培养液从所述发酵器转移到分离器中；
(c)使含有槐糖脂的脂质相在所述分离器中与所述培养液的其他成分分离；
(d)使已分离出槐糖脂的培养液返回至所述发酵器中；以及
(e)从所述分离器中转移槐糖脂。
适当地，步骤(c)、(d)和(e)与步骤(b)同时进行。适当地，步骤(b)与步骤(a)同时进行。适当地，步骤(b)、(c)、(d)和(e)与步骤(a)同时进行。
步骤(c)、(d)和(e)可以作为连续步骤进行。步骤(b)、(c)、(d)和(e)可以作为连续步骤进行。步骤(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可以作为连续步骤进行。
步骤(c)、(d)和(e)可以间歇地操作，但在操作步骤(c)、(d)和(e)的期间内可适当地作为连续步骤进行。步骤(b)、(c)、(d)和(e)可间歇性地进行操作，但在操作步骤(b)、(c)、(d)和(e)的期间内可适当地作为连续步骤进行。
适当地，所述方法包括进行多程分离(multiple pass separation)，并且合适地包括以连续循环进行步骤(b)、(c)和(d)。
适当地，所述方法包括：在所述发酵器中进行发酵的同时，通过使培养液进行一个时间段的从所述发酵器经所述分离器并返回所述发酵器的连续循环以进行分离。适当地，所述时间段至少为30min。适当地，所述方法包括，在发酵的持续期间内，通过使培养液进行多个时间段的从所述发酵器经所述分离器并返回所述发酵器的连续循环以进行分离，其中多个时间段之间有停顿。或者，所述方法可以包括通过使培养液不停顿地进行从所述发酵器经所述分离器并返回所述发酵器的连续循环以进行分离。
适当地，所述方法包括使用假丝酵母菌ATCC 22214生产槐糖脂。
适当地，所述方法包括在发酵的持续期间内使培养液在所述发酵器和分离器之间循环。适当地，所述方法包括在发酵的持续期间内以一定的时间间隔使培养液在所述发酵器和分离器之间循环。适当地，所述方法包括使培养液在所述发酵器和分离器之间连续循环。
适当地，所述方法包括使所述培养液在所述发酵器和分离器之间循环至少1h的时间段。适当地，所述方法包括使所述培养液在所述发酵器和分离器之间循环至少10h的时间段，例如至少20h的时间段。适当地，所述方法包括使所述培养液在所述发酵器和分离器之间循环至少50h的时间段，例如至少100h的时间段。适当地，所述方法包括使培养液在所述发酵器和分离器之间循环至少150h的时间段，例如至少200h的时间段。
适当地，所述方法包括：在发酵的持续期间内，从所述发酵器中转移含有脂质产物的培养液，将脂质产物与所述培养液的其他成分分离，并使已分离出脂质产物的培养液返回至所述发酵器中。适当地，所述方法包括：连续地从所述发酵器中转移含有脂质产物的培养液，将脂质产物与所述培养液的其他成分分离，并使已分离出脂质产物的培养液返回至所述发酵器中。适当地，所述方法包括使底物脂质(substrate lipids)返回所述发酵器。所述方法可以包括：在所述分离器中的分离可能不完全，并且从已返回所述发酵器的所述培养液中分离出可能是部分而非全部的脂质产物时，使脂质产物返回至所述发酵器。
适当地，所述方法包括：在发酵器中进行发酵并从所述发酵器中转移含有脂质产物的培养液，将脂质产物与所述培养液的其他成分分离，并且在至少1h的时间段内，使已分离出脂质产物的培养液返回所述发酵器。所述转移、分离和返回可以连续进行，也可以间歇地进行。适当地，如果间歇地进行，则所述转移、分离和返回在发酵过程中的多个场合(occasions)进行，并且适当地在所述操作的多个场合在所述发酵器和分离器之间进行连续再循环地操作。
适当地，所述方法包括：从所述发酵器中转移含有脂质产物的培养液，将脂质产物与所述培养液的其他成分分离，并且在至少10h(例如至少20h)的时间段内连续或在多个场合下使已分离出脂质产物的培养液返回到所述发酵器中。适当地，所述方法包括：从所述发酵器中转移含有脂质产物的培养液，将脂质产物与所述培养液的其他成分分离，并且在至少50h(例如至少100h)的时间段内连续或在多个场合下使已分离出脂质产物的培养液返回到所述发酵器中。适当地，所述方法包括：从所述发酵器中转移含有脂质产物的培养液，将脂质产物与所述培养液的其他成分分离，并且在至少150h(例如至少200h)的时间段内连续或在多个场合下使已分离出脂质产物的培养液返回到所述发酵器。
适当地，所述方法包括：在至少10h的发酵期间，在多个场合(例如至少三个场合)下进行再循环分离过程，并且其中所述分离过程包括：从所述发酵器转移含有脂质产物的培养液，将脂质产物与所述培养液的其他成分分离，并使已分离出脂质产物的培养液返回至所述发酵器。
适当地，所述方法包括从发酵器中转移培养液并使培养液返回至所述发酵器，以使得：以所述发酵器和分离器中培养液的总重量计，所述发酵器中含有至少50重量％的所述培养液。适当地，所述方法包括从发酵器中转移培养液并使培养液返回至所述发酵器，以使得：以所述发酵器和分离器中培养液的总重量计，所述发酵器中含有至少60重量％的培养液，例如含有至少70重量％的培养液。适当地，所述方法包括从发酵器中转移培养液并使培养液返回至所述发酵器，以使得：以所述发酵器和分离器中培养液的总重量计，所述发酵器中含有至少80重量％的培养液，例如含有至少90重量％的培养液。适当地，所述方法包括从发酵器中转移培养液并使培养液返回至所述发酵器，以使得：以所述发酵器和分离器中培养液的总重量计，所述发酵器中含有至少95重量％的培养液，例如含有至少98重量％的培养液。
适当地，所述方法包括在发酵开始后将底物加入所述发酵器中。适当地，所述方法包括在发酵的持续期间内将底物加入所述发酵器中。适当地，所述方法包括连续加入底物。适当地，所述底物包括脂质。适当地，所述底物包括与该方法生产的脂质产物不同的脂质。适当地，所述方法包括在发酵开始后将油和/或糖加入所述发酵器中。适当地，所述方法包括在发酵过程中将油和/或糖加入所述发酵器中。适当地，所述方法包括将油和/或糖连续加入所述发酵器中。
适当地，所述方法包括将植物油加入所述发酵器中，适当地所述方法包括将菜籽油加入所述发酵器中。适当地，所述方法包括将葡萄糖加入所述发酵器中。
所述方法可以包括通过将油和/或糖加入所述培养液中，从而使所述发酵器中培养液的量随着时间的推移增加。
适当地，所述方法包括在所述发酵器达到其容量的60％以上时结束发酵，例如在达到其容量的70％以上时结束发酵。所述方法包括在所述发酵器达到其容量的80％以上时结束发酵，例如在达到其容量的90％以上时结束发酵。所述方法包括在所述发酵器达到其容量的95％以上时结束发酵。
适当地，由于培养液被从所述发酵器转移到所述分离器，并且培养液在分离出脂质后返回所述发酵器，通过所述分离过程，在所述发酵器中提供了额外的容量。因此可以在发酵开始时利用更大比例的发酵器容量。
适当地，所述方法包括在发酵器容量的50％以上开始发酵，例如在发酵器容量的60％以上开始发酵。适当地，所述方法包括在发酵器容量的70％以上开始发酵。
适当地，所述方法包括将含有浓度为Xg·L-1的脂质产物的培养液从所述发酵器中转移到所述分离器中，并使含有浓度为Yg·L-1的脂质产物的培养液从所述分离器返回所述发酵器，其中Y小于X。
适当地，所述方法包括将含有脂质产物的培养液转移到所述分离器，所述培养液中脂质产物的浓度为50-250g·L-1，例如为50-100g·L-1。
适当地，所述方法包括将含有脂质产物的培养液转移至所述分离器，所述培养液中脂质产物的浓度为至少5g·L-1，例如为至少10g·L-1。适当地，所述方法包括将含有脂质产物的培养液转移至所述分离器，所述培养液中脂质产物的浓度为至少15g·L-1，例如为至少20g·L-1。适当地，所述方法包括将含有脂质产物的培养液转移至所述分离器，所述培养液中脂质产物的浓度为至少50g·L-1，例如为至少80g·L-1。
适当地，所述方法包括将含有槐糖脂的培养液转移至所述分离器，所述培养液中槐糖脂的浓度为至少5g·L-1，例如为至少10g·L-1。适当地，所述方法包括将含有槐糖脂的培养液转移至所述分离器，所述培养液中槐糖脂的浓度为至少15g·L-1，例如为至少20g·L-1。适当地，所述方法包括将含有槐糖脂的培养液转移至所述分离器，所述培养液中槐糖脂的浓度为至少50g·L-1，例如为至少80g·L-1。
适当地，所述方法包括使含有脂质产物的培养液返回所述发酵器，所述培养液中脂质产物的浓度小于80g·L-1。所述方法可以包括将使含有脂质产物的培养液送回所述发酵器，所述培养液中脂质产物的浓度小于50g·L-1，例如小于20g·L-1。
适当地，所述方法包括将含有槐糖脂的培养液送回发酵器，所述培养液中槐糖脂的浓度小于80g·L-1。该方法可以包括将含有槐糖脂的培养液送回到发酵器中，所述培养液中槐糖脂的浓度小于50g·L-1，例如小于20g·L-1。
适当地，所述方法包括使培养液在所述分离器中的
停留时间为至少10s。适当地，所述方法包括使培养液在所述分离器中的停留时间为至少30s，例如为至少60s。适当地，所述方法包括使培养液在所述分离器中的停留时间为180s以下，例如为120s以下。所述方法可以包括以使脂质产物从所述培养液中分离所需的最短时间从所述发酵器中移除培养液。
适当地，所述方法包括将所述发酵器中的培养液中的脂质产物的浓度保持在100g·L-1以下，例如在80g·L-1以下。
适当地，所述方法包括将所述发酵器中的培养液中的槐糖脂浓度保持在100g·L-1以下，例如在80g·L-1以下。
适当地，所述方法包括搅动(agitating)所述发酵器中的培养液。适当地，所述方法包括给发酵器中的培养液通气。适当地，所述方法包括搅拌(stirring)发酵器中的培养液。
适当地，所述方法包括保持所述发酵器中的培养液中的脂质产物的浓度在80g·L-1以下，以保持培养液的粘度足够低，从而减少培养液所需的搅拌。
适当地，所述方法包括在不停止发酵的情况下将脂质产物与培养液的其他成分分离。适当地，所述方法包括将脂质产物从所述培养液中分离的同时继续发酵，并使培养液从所述分离器返回所述发酵器，使得所述培养液可以在其中的脂质产物分离出去后继续发酵。
适当地，在步骤(b)开始之前就进行一段时间步骤(a)。适当地，进行步骤(b)的同时继续进行步骤(a)。
所述方法可以包括在分离器中的培养液开始分离成含有脂质产物的脂质相和大部培养液相之前进行步骤(a)和(b)。所述方法可以包括在含有脂质产物的脂质相与所述分离器中的大部培养液相分离之后继续步骤(a)和(b)。
适当地，所述方法包括防止所述发酵器中的培养液相分离或使这种相分离最小化。适当地，所述方法包括防止发酵器的培养液中脂质相的形成或使这种形成最小化。适当地，所述方法包括控制所述发酵器的培养液中脂质产物的浓度，并搅动所述发酵器中的培养液，以防止发酵器中脂质相的形成或使这种形成最小化。
适当地，如果在发酵器的培养液中形成脂质相，则所述相(发酵器脂质相)含有脂质产物和其他成分。
适当地，所述方法包括搅动发酵器中的培养液。适当地，所述方法包括搅动所述发酵器中的培养液以将脂质与所述培养液的其他成分混合。所述方法可以包括搅动培养液以将脂质相与所述培养液的其他成分混合。所述方法可以包括在发酵器中将发酵器脂质相与大部培养液相混合以形成混合的培养液。
适当地，在步骤(a)的脂质生产开始后开始步骤(b)。适当地，在所述发酵器中的培养液开始形成脂质相和大部培养液相之前开始步骤(b)。
适当地，如果在所述发酵器中的所述培养液中形成脂质相，则所述发酵器脂质相与发酵器中的大部培养液相混合以形成混合培养液，以及步骤(b)包括转移所述混合培养液。
适当地，步骤(b)包括将脂质产物与培养液的其他成分一起从所述发酵器转移。
适当地，一旦开始步骤(b)则开始步骤(c)。适当地，进行步骤(c)的同时继续步骤(b)。适当地，进行步骤(c)的同时继续步骤(a)。适当地，在进行步骤(b)的同时进行步骤(d)。
适当地，步骤(c)包括使从发酵器转移的培养液相分离。步骤(c)可以包括使培养液相分离。适当地，步骤(c)包括重力分离步骤。步骤(c)合适地包括使所述培养液沉降成较轻相和较重相。
适当地，以再循环过程进行所述分离。适当地，以动态而非静态过程进行所述分离，因此可以避免细胞在缺氧条件下存活很长时间。
适当地，所述方法包括：在所述分离器的所述培养液由于沉降而形成脂质相之前进行步骤(c)，与此同时继续混合所述发酵器中的所述培养液以防止所述发酵器中相分离。适当地，所述方法包括：在所述分离器中的所述培养液中形成脂质相后继续步骤(c)。适当地，所述方法包括在所述发酵器中的所述培养液中形成脂质相之前进行步骤(c)。
适当地，步骤(c)包括使所述分离器中的培养液分离以提供包含脂质产物的脂质相和包含所述培养液的其他成分的大部培养液。
适当地，所述分离器中的所述培养液的脂质相含有脂质产物和其他成分。适当地，所述脂质相含有浓度为至少20重量％的脂质产物，例如含有浓度为至少30重量％的脂质产物。适当地，所述脂质相含有浓度为至少40重量％的脂质产物，例如含有浓度为至少50重量％的脂质产物。适当地，所述脂质相包含脂质和水。
适当地，在所述分离器中与所述培养液的其他成分分离的所述脂质相是含有脂质产物的脂质产物相。适当地，所述脂质产物相含有脂质产物和小于10重量％的其他脂质。
适当地，所述方法包括将所述分离器中的培养液分离成含有脂质产物的脂质产物相和大部培养液相。适当地，所述大部培养液相含有底物脂质。适当地，所述脂质产物相含有脂质产物和小于10重量％的底物脂质。适当地，所述脂质产物相是糖脂相。适当地，所述脂质产物相是槐糖脂相。
适当地，所述脂质产物相包含脂质产物和水，浓度为至少80重量％。适当地，所述脂质产物相包含水和脂质产物，浓度为至少90重量％，例如为95重量％。
适当地，所述分离器中的所述大部培养液含有底物和/或细胞。所述大部培养液可以含有脂质产物。适当地，所述大部培养液含有浓度不超过20重量％的脂质产物，例如含有浓度不超过15重量％的脂质产物。适当地，所述大部培养液含有浓度不超过10重量％的脂质产物，例如含有浓度不超过5重量％的脂质产物。
根据发酵器中的条件和/或培养液的成分不同，所述脂质相可以比所述大部培养液更轻或更重。适当地，所述方法包括使用适应性的分离器，以使得不论所述分离器脂质相的密度比所述大部培养液高或比所述大部培养液低，所述分离器脂质相都可以从所述分离器转移。适当地，所述方法包括使用分离器，所述分离器设置为使得：不论所述脂质相的密度比所述培养液高或比所述培养液低，已分离出脂质相的培养液(大部培养液)都可以返回到所述发酵器。
适当地，所述方法包括一旦步骤(b)开始就使培养液从所述分离器返回所述发酵器。因此，所述方法可以包括：在步骤(c)进行足够的时间以使脂质相分离之前，使尚未分离出脂质相的培养液返回所述发酵器。
适当地，步骤(d)与步骤(c)基本同时开始。适当地，步骤(d)与步骤(b)基本同时开始。适当地，当进行步骤(d)的同时，继续步骤(c)。适当地，当进行步骤(d)的同时，继续步骤(b)。适当地，当进行步骤(d)的同时，继续步骤(a)。
适当地，在步骤(c)中的脂质相首次与培养液的其他成分分离后一段时间之后开始步骤(e)。适当地，进行步骤(e)的同时继续步骤(c)。适当地，进行步骤(e)的同时继续步骤(b)。适当地，进行步骤(e)的同时继续步骤(a)。
步骤(d)可以在步骤(e)之前开始。适当地，进行步骤(e)的同时继续步骤(d)。
适当地，所述方法包括保持生产条件以提供脂质相，该脂质相可在分离器中通过重力分离与所述培养液分离。适当地，所述方法包括使用具有沉降柱的分离器进行分离。
适当地，所述方法包括将所述发酵器中培养液的pH保持在pH为2和pH为5之间，例如保持在pH为2.5和pH为4.5之间。适当地，所述方法包括将所述发酵器中培养液的pH保持在pH为3.0和pH为4.0之间，例如保持在pH为3.5。
适当地，所述方法包括将所述发酵器中培养液的溶解氧水平保持在20％以上，例如保持在25％以上。适当地，所述方法包括将发酵器中培养液的溶解氧水平保持在20％至40％之间，例如保持在25％至35％之间。适当地，所述方法包括将发酵器中培养液的溶解氧水平保持在30％。
适当地，所述方法包括加入糖，适当地包括加入葡萄糖。适当地，所述方法包括以至少0.5g·L-1·h-1的速率加入糖，适当地包括以至少0.5g·L-1·h-1的速率加入葡萄糖。所述方法可包括以1.0g·L-1·h-1至2.0g·L-1·h-1(例如1.5g·L-1·h-1)的速率加入糖，适当地包括以1.0g·L-1·h-1至2.0g·L-1·h-1(例如1.5g·L-1·h-1)的速率加入葡萄糖。
所述方法可以包括加入植物油，适当地可以包括加入菜籽油。可选择地，或者另外，所述方法可以包括加入植物油酯或油酸。适当地，所述方法包括以至少0.5g·L-1·h-1的速率加入植物油，适当地包括以至少0.5g·L-1·h-1的速率加入菜籽油。所述方法可以包括以1.2g·L-1·h-1至2.2g·L-1·h-1(例如1.7g·L-1·h-1)的速率加入植物油，适当地包括以1.2g·L-1·h-1至2.2g·L-1·h-1(例如1.7g·L-1·h-1)的速率加入菜籽油。
适当地，所述方法包括分离槐糖脂相，所述槐糖脂相含有至少300g·L-1的槐糖脂，例如含有至少400g·L-1的槐糖脂。适当地，所述方法包括分离槐糖脂相，所述槐糖脂相含有至少500g·L-1的槐糖脂，例如含有550g·L-1的槐糖脂。
适当地，所述方法包括分离含有细胞的槐糖脂相，所述槐糖脂相的细胞浓度为所述培养液中细胞浓度的10％以下。适当地，所述方法包括分离出含有1g·L-1以下细胞的槐糖脂相。适当地，所述方法包括分离出含有0.1g·L-1以下的细胞的槐糖脂相。适当地，所述方法包括分离出基本上不含细胞的槐糖脂相。
适当地，所述方法包括使含有少于80g·L-1的槐糖脂的培养液返回所述发酵器。所述方法可以包括使含有少于50g·L-1的槐糖脂的培养液返回所述发酵器，例如使含有少于30g·L-1的槐糖脂的培养液返回所述发酵器中。
适当地，所述方法包括去除所述分离器中的槐糖脂，使得发酵器中的培养液保持低于100g·L-1的槐糖脂水平，例如保持低于80g·L-1的槐糖脂水平。所述方法可以包括除去所述分离器中的槐糖脂，使得所述发酵器中的培养液保持低于50g·L-1的槐糖脂水平。
适当地，所述方法包括除去粘性槐糖脂相，使得所述发酵器中培养液的粘度保持比未除去槐糖脂相时更低的粘度。适当地，所述方法包括除去粘性槐糖脂相，使得保持需氧水平所需的搅拌器速度比未除去槐糖脂相时更低。
适当地，所述方法包括通过除去槐糖脂相以减小发酵器的体积需求。适当地，所述方法包括将发酵器体积需求减少5％以上，例如减少10％以上。适当地，所述方法包括将发酵器体积需求减少20％以上，例如减少30％以上。所述方法可以包括将发酵器体积需求减少达40％。
所述方法可包括通过除去槐糖脂相来提高发酵的产率。所述方法可以包括通过增大发酵器的可用体积来提高发酵的产率。所述方法可以包括将产率提高5％以上，例如提高10％以上。所述方法可以包括将产率提高20％以上，例如提高30％以上。
所述方法可以包括通过除去槐糖脂相以促进改善发酵器中的培养液混合。
所述方法可以包括通过除去槐糖脂相以促进发酵器中的培养液的溶解氧均匀分布。
所述方法可以包括通过去除槐糖脂相来降低搅动需求并因此降低能量成本。所述方法可以包括将搅动的能量需求减少20％以上，例如减少30％以上，例如减少40％。
所述方法可以包括通过除去槐糖脂相以使进行发酵的时间比不除去槐糖脂相的情况下更长。
适当地，所述方法包括使用分离器。适当地，所述方法包括使用具有沉降柱的分离器。
适当地，所述方法包括使用根据本发明第二方面的分离器。
适当地，所述方法包括使用根据本发明第三方面的设备。
根据本发明的第二方面，提供一种分离器，所述分离器适于将脂质相与包含脂质的培养液的其他成分分离，其中，所述分离器包括：
分离室(I)，在使用中，所述分离室使得所述培养液能够在其中停留一段时间，以使含有脂质产物的脂质相与所述培养液的其他成分分离；
通向所述分离室的培养液入口(II)，用于在使用中将含有脂质产物的培养液转移到所述分离室中；以及
从所述分离室引出的出口(III)，用于：(i)在使用中，从所述分离室转移已分离出脂质产物的培养液；以及(ii)在使用中，从所述分离室转移脂质产物。
适当地，所述分离器包括两个出口(III)。适当地，所述分离器包括三个出口(III)。适当地，所述分离器包括三个出口(III)并且设置为使得至少一个出口(III)能够选择性地如下使用：
(i)用于从所述分离室中转移已分离出脂质产物的培养液；
(ii)用于从所述分离室转移脂质产物；以及
(iii)不使用或用于卸压。
适当地，所述分离器包括第一出口(IIIa)和第二出口(IIIb)。适当地，所述分离器包括第一出口(IIIa)、第二出口(IIIb)和第三出口(IIIc)。适当地，所述分离器包括从所述分离室引出的三个出口，并且设置为：在使用中，在分离过程中选择性地不使用一个出口。
适当地，所述分离器包括设置为选择性地如下使用的出口(IIIa，IIIb，IIIc)：
1、(IIIa)不使用或者用于卸压；
(IIIb)用于从所述分离室转移脂质产物；
(IIIc)用于从分离室中转移已除去脂质产物的培养液；或者
2、(IIIa)用于从所述分离室转移脂质产物；
(IIIb)用于从分离室中转移已除去脂质产物的培养液；
(IIIc)不使用或者用于卸压。
适当地，所述分离器包括设置为选择性地如下使用的出口(IIIa，IIIb，IIIc)：
1、(IIIa)用于卸压；
(IIIb)用于从所述分离室转移脂质产物；
(IIIc)用于从所述分离室中转移已除去脂质产物的培养液；或者
2、(IIIa)用于从所述分离室转移脂质产物；
(IIIb)用于从所述分离室中转移已除去脂质产物的培养液；
(IIIc)不使用。
适当地，所述分离器包括两个出口，所述两个出口能够用作脂质产物出口，并且适于使得：在使用中，所述两个出口中的一个选择性地用于从所述分离室转移脂质产物。
适当地，所述分离器包括两个出口，所述两个出口能够用作培养液出口，并且适于使得：在使用中，所述两个出口中的一个选择性地用于从所述分离室转移培养液。
适当地，所述分离器包括出口，该出口能够用作位于所述分离室的使用中的上端的脂质产品出口。适当地，分离器包括出口，该出口能够用作位于所述分离室的使用中的下端的脂质产物出口。
适当地，提供一种分离器，所述分离器适于将脂质相与含有脂质的培养液的其他成分分离，其中，所述分离器包括：
分离室(I)，在使用中，所述分离室使得所述培养液能够在其中停留一段时间，以使含有脂质产物的脂质相与所述培养液的其他成分分离；
培养液入口(II)，用于在使用中将含有脂质产物的培养液转移到所述分离室中；
第一出口(IIIa)，位于所述分离室的使用中的上端；
第二出口(IIIb)，位于所述分离室的使用中的下端；以及
第三出口(IIIc)，位于所述分离室的使用中的下端。
适当地，根据含有脂质产物的脂质相的密度不同，在使用中，所述第一出口(IIIa)和第二出口(IIIb)可以选择性地用于从所述分离室转移脂质产物。
适当地，根据脂质相的密度不同，在使用中，所述第二出口(IIIb)和第三出口(IIIc)可以选择性地用于从所述分离室中转移已除去脂质产物的培养液。
适当地，所述分离室(I)包括伸长室(elongate chamber)。
适当地，所述分离室包括沉降柱。
适当地，所述分离室适于使得：在使用中，所述室的纵轴线与水平方向呈10度到60度布置，例如与水平方向呈20度到40度布置。适当地，所述分离室适于使得：在使用中，所述室的纵轴线与水平方向呈25度至30度布置，例如与水平方向呈30度布置。
适当地，所述分离室包括圆柱段。适当地，所述分离室包括至少为分离室长度90％的圆柱段。
所述分离室(I)的长度可以是其直径的至少3倍，例如是其直径的至少4倍。所述分离室的长度可以是其直径的至少5倍，例如是其直径的至少6倍。
适当地，所述分离室具有锥台形的使用中的第一上端。适当地，所述分离室的使用中的第二下端具有平面底座。
适当地，所述培养液入口(II)与出口(IIIb，IIIc)位于或朝向所述分离室的相对的端。适当地，所述培养液入口(II)位于或朝向所述分离室的使用中的第一上端，并且所述出口(IIIb，IIIc)位于或朝向所述分离室的使用中的第二下端。
适当地，所述分离器设置为使得：在使用中，培养液在所述分离室中的停留时间至少为30s，所述停留时间为自培养液通过培养液入口(II)进入所述室到通过出口(IIIb，IIIc)离开前的时间。适当地，所述分离器设置为使得：在使用中，培养液在所述分离室中的停留时间为至少60s。适当地，所述分离器设置为使得：在使用中，培养液在所述分离室中的停留时间为至少90s。
适当地，所述分离器设置为使得：在使用中，培养液在所述分离室中的停留时间不大于180s，所述停留时间为自培养液通过培养液入口(II)进入所述室到通过出口(IIIb，IIIc)离开前的时间。适当地，所述分离器设置为使得：在使用中，培养液在所述分离室中的停留时间不大于150s。适当地，所述分离器设置为使得：在使用中，培养液在所述分离室中的停留时间不大于120s。
适当地，所述培养液入口(II)设置为将含有脂质产物的培养液从发酵器转移到所述分离室。所述培养液入口(II)可以包括阀门。所述培养液入口(II)可以包括用于连接所述发酵器的导管。所述培养液入口(II)可以包括用于将培养液从发酵器泵送到所述分离室中的泵。
适当地，所述培养液入口(II)包括通向所述分离室的开口，该开口朝向所述分离室的使用中的上端。适当地，所述培养液入口(II)包括通向分离室的开口，该开口位于所述分离室的使用中的上端。
适当地，所述培养液入口(II)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的使用中的上端的端壁中，适当地，该开口位于所述端壁的中心区域中。适当地，所述培养液入口(II)包括通向分离室的开口，该开口位于所述分离室的纵轴线上。
适当地，所述第一出口(IIIa)设置为使得：在使用中当所述脂质相比所述培养液的其他成分密度更低并且向所述分离室的顶部上浮时，从所述分离室转移含有脂质产物的脂质相。
所述第一出口(IIIa)可以包括阀门。所述第一出口(IIIa)可以包括用于连接收集容器或处理设备的导管。所述第一出口(IIIa)可以包括用于从所述分离室泵送脂质产物的泵。
适当地，所述第一出口(IIIa)包括所述分离室的开口，所述开口朝向所述分离室的使用中的上端。适当地，在使用中，所述第一出口(IIIa)包括所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的使用中的上端，所述开口的高度为所述分离室的上部纵向长度10％处。
适当地，所述第一出口(IIIa)包括通向分离室的开口，该开口位于所述分离室的侧壁，适当地，所述开口位于所述侧壁的区域中，所述开口朝向所述室的使用中的上端。适当地，所述第一出口(IIIa)包括通向分离室的开口，该开口偏离所述分离室纵轴线的中心。适当地，在使用中，所述第一出口(IIIa)包括通向分离室的开口，该开口位于所述分离室的纵轴线的上方。
所述第二出口(IIIb)可以设置为使得：在使用中，当所述脂质相具有比培养液的其他成分更高的密度并且向所述分离室的底部下沉时，从所述分离室转移含有脂质产物的脂质相。
所述第二出口(IIIb)可以设置为使得：在使用中，当含有所述脂质产物的脂质相具有比培养液的其他成分更低的密度并且向所述分离室的顶部上浮时，将已除去脂质产物的培养液从所述分离室转移到发酵器中。
所述第二出口(IIIb)可以包括阀。所述第二出口(IIIb)可以包括用于连接收集容器或处理设备或发酵器的导管。所述第二出口(IIIb)可以包括泵，所述泵用于从分离室泵送脂质产物或泵送已除去脂质产物的培养液。
适当地，所述第二出口(IIIb)包括通向所述分离室的开口，所述开口朝向所述分离室的使用中的下端。适当地，在使用中，所述第二出口(IIIb)包括所述通向分离室的开口，所述开口位于所述分离室的使用中的下端，所述开口的高度为所述分离室的下部纵向长度10％处。
适当地，所述第二出口(IIIb)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的侧壁，适当地，所述开口位于所述侧壁的区域中，所述开口朝向所述分离室的使用中的下端。适当地，所述第二出口(IIIb)包括通向分离室的开口，该开口偏离所述分离室的纵轴线的中心。适当地，所述第二出口(IIIb)包括通向分离室的开口，该开口位于所述分离室的纵轴线下方。
所述第三出口(IIIc)可以设置为使得：在使用中，将已除去脂质的培养液从所述分离室转移到发酵器。
所述第三出口(IIIc)可以设置为使得：在使用中，当含有所述脂质产物的脂质相比培养液的其他成分密度更高，并且向所述分离室的底部下沉时，将含有脂质产物的培养液从所述分离室转移到所述发酵器中。
所述第三出口(IIIc)可以包括阀门。所述第三出口(IIIc)可以包括用于连接到发酵器的导管。所述第三出口(IIIc)可以包括泵，所述泵用于从所述分离器向所述发酵器泵送已除去脂质产物的培养液。
适当地，所述第三出口(IIIc)包括通向所述分离室的开口，所述开口朝向所述分离室的使用中的下部。适当地，所述第三出口(IIIc)包括通向所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的使用中的下端，所述开口的高度为所述分离室的下部纵向长度10％处。
适当地，所述第三出口(IIIc)包括通向分离室的开口，该开口位于所述分离室的侧壁上，适当地该开口位于所述侧壁的区域中，所述开口朝向所述分离室的使用中的下端。适当地，所述第三出口(IIIc)包括通向分离室的开口，该开口偏离所述分离室的纵轴线的中心。适当地，在使用中，所述第三出口(IIIc)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的纵轴线的上方。
适当地，所述培养液入口(II)和第三出口(III)设置为与同一发酵器流体连通。
适当地，所述分离器适于分离培养液脂质，所述培养液脂质选自由烃、萜、脂肪、油、脂肪酸、糖脂和其他化合物所组成的组中，所述培养液脂质含有由生物体产生的分子，所述分子不溶于水或为两亲性的，并且通常可溶于非极性溶剂。
适当地，所述分离器适于分离培养液脂质，所述培养液脂质选自由烃、萜、脂肪、油、脂肪酸和糖脂所组成的组中。
适当地，所述分离器适于分离培养液脂质，所述培养液脂质选自由萜、脂肪、油、脂肪酸和糖脂所组成的组中。
适当地，所述分离器包括用于从培养液中分离萜的分离器。
适当地，所述分离器包括用于从培养液中分离糖脂的分离器。适当地，所述分离器包括用于从培养液中分离槐糖脂的分离器。
适当地，分离器设置为用于根据所述第一方面的方法中。
适当地，所述分离器包括两个出口(III)。适当地，所述分离器包括两个出口(III)并且设置为每个出口(III)可以选择性地如下使用：
(i)用于从所述分离室中转移已分离出脂质产物的培养液；以及
(ii)用于从所述分离室转移脂质产物。
适当地，提供一种分离器，所述分离器适于将脂质相与含有脂质的培养液的其他成分分离，其中，所述分离器包括：
分离室(I)，在使用中，所述分离室使得所述培养液能够在其中停留一段时间，以使含有脂质产物的脂质相与所述培养液的其他成分分离；
培养液入口(II)，位于所述分离室的第一端，用于在使用中将含有脂质产物的培养液转移到所述分离室中；
第一出口(IIIA)，位于所述分离室的第二端；以及
第二出口(IIIB)，位于所述分离室的第二端。
适当地，所述培养液入口(II)与出口(IIIA，IIIB)位于或朝向所述分离室的相对的端。适当地，所述培养液入口(II)位于所述分离室的使用中的第一下端或朝向所述分离室的使用中的第一下端，并且所述出口(IIIA，IIIB)位于所述分离室的使用中的第二上端或朝向所述分离室的使用中的第二上端。
适当地，所述培养液入口(II)包括通向所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的使用中的下端。适当地，所述培养液入口(II)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的使用中的下端的端壁中，适当地该开口位于所述端壁的中心区域中。适当地，所述培养液入口(II)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的纵轴线上。
所述第一出口(IIIA)可以设置为使得：在使用中，当含有所述脂质产物的脂质相具有比所述培养液的其他成分密度更低并向分离室的顶部上浮时，将已除去脂质产物的培养液从所述分离室转移至发酵器。
适当地，所述第一出口(IIIA)包括通向所述分离室的开口，所述开口朝向所述分离室的使用中的上端。适当地，在使用中，所述第一出口(IIIA)通向所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的使用中的上端，所述开口的高度为所述分离室的上部纵向长度10％处。
适当地，所述第一出口(IIIA)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的侧壁上，适当地，该开口位于所述侧壁的区域中，该开口朝向分离室的使用中的上端。适当地，所述第一出口(IIIA)包括通向所述分离室的开口，该开口偏离所述分离室的纵轴线的中心。适当地，在使用中，所述第一出口(IIIA)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的纵轴线的下方。
所述第二出口(IIIB)可以设置为：在使用中，当含有所述脂质产物的脂质相比所述培养液的其他成分密度更低且向所述分离室的顶部上浮时，转移脂质产物以用于收集。
适当地，所述第二出口(IIIB)包括通向所述分离室的开口，所述开口朝向所述分离室的使用中的上端。适当地，所述第二出口(IIIB)包括通向所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的使用中的上端，所述开口的高度为所述分离室的上部纵向长度10％处。
适当地，所述第二出口(IIIB)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的侧壁上，适当地该开口位于所述侧壁的区域中，所述开口朝向所述分离室上端。适当地，所述第二出口(IIIB)包括通向所述分离室的开口，该开口偏离所述分离室的纵轴线的中心。适当地，在使用中，所述第二出口(IIIB)包括通向所述分离室的开口，该开口位于所述分离室的纵轴线的上方。
根据本发明的第三方面，提供一种用于生产脂质的设备，所述设备包括具有发酵室的发酵器和具有分离室的分离器，并且其中所述发酵室和分离室流体连通，以使得：在使用中，含有脂质产物的培养液可以从所述发酵室转移到所述分离室，并且已分离出脂质产物的培养液可以从所述分离室转移到所述发酵室。
适当地，所述分离器包括重力分离器。适当地，所述设备包括作为唯一分离器的重力分离器。
适当地，所述设备包括根据第二方面的分离器。适当地，所述设备包括根据第二方面的分离器，该分离器作为唯一的分离器。
适当地，所述发酵器包括搅拌器(agitator)。适当地，所述发酵器包括搅拌器(stirrer)。
适当地，所述发酵器包括分布器。
适当地，提供一种用于生产脂质的设备，所述设备包括具有发酵室的发酵器和具有分离室的分离器，可以通过发酵作用在所述发酵室的培养液中生产脂质，并且其中所述发酵室包括出口和入口，所述出口与所述分离室的入口流体连通，所述入口与所述分离室的出口流体连通，其中所述设备适于使得：在使用中，所述分离室从所述发酵器接收含有脂质产物的培养液，从所述培养液中分离含有脂质产物的脂质相，并使已分离出脂质产物的培养液返回所述发酵室。
适当地，所述发酵器还包括进料口，以使在发酵过程中将底物加入到所述发酵器的培养液中。适当地，所述发酵器包括糖的进料口，适当地包括葡萄糖的进料口和植物油的进料口，适当地包括菜籽油的进料口。
适当地，所述分离器进一步包括用于从所述分离器转移脂质产物的出口，该出口可以与收集容器流体连通。
适当地，所述设备适于生产脂质，所述脂质选自由烃、萜、脂肪、油、脂肪酸、糖脂和其他化合物所组成的组，所述脂质含有由生物体产生的分子，所述分子不溶于水或为两亲性的，并且通常可溶于非极性溶剂。
适当地，所述设备适于生产脂质，所述脂质选自由烃、萜、脂肪、油、脂肪酸和糖脂所组成的组中。
适当地，所述设备适于生产脂质，所述脂质选自由萜、脂肪、油、脂肪酸和糖脂所组成的组中。
适当地，所述设备包括用于生产萜的设备。
适当地，所述设备包括用于生产糖脂的设备。适当地，所述设备包括用于生产槐糖脂的设备。
适当地，所述设备设置为用于根据第一方面的方法中。
附图说明
现在参照附图举例说明本发明：
图1示出了分离器；
图2示出了包括发酵器和分离器的设备；
图3示出了图2的另一种设置的设备；
图4是示出了用于发酵的底物进料的图；
图5是示出了用于发酵的一种底物进料的图；
图6是示出了搅拌器速度和溶解氧的图；
图7示出了分离器的另一种实施方式；
图8是示出了发酵的浓度和脂质生产的图；以及
图9是示出了图8的发酵的底物进料的图。
具体实施方式
使用发酵器和分离器进行实施例脂质生产，以生产含有槐糖脂(脂质产物)的培养液，并从培养液中分离槐糖脂相(实施例1和2)。为了比较，在不使用分离器的情况下进行槐糖脂的生产(对比例1C)。使用发酵器和替代的分离器(实施例3)进行另一个实施例的脂质生产。
设备
实施例1和2以及对比例1C中使用的发酵器分别是Electrolab Fermac320发酵系统(Electrolab，UK)，其最大工作体积为2L，H:D为2，使用的初始工作体积为1L。
实施例1和2使用的分离器是图1中所示的内置沉降柱。
分离器100包括分离室110。在分离器100的使用中的第一上端120，分离室110具有圆台部(frusta conical section)111。分离室110还包括直径为50mm且长为150mm的圆柱部112。在使用中，圆柱部的底端113形成为分离器的使用中的下端130。
分离器100包括培养液入口140并且具有通向分离室110的开口，该开口位于分离器100的第一端120，且该开口位于分离室110的纵轴线A-A上。
分离器包括第一出口150、第二出口160和第三出口170。
第一出口150位于分离器100的第一端120，并且具有通过分离室110的侧壁114通向分离室110的开口。在使用中，分离器100的方向设置为使得所述第一出口150位于分离室110的纵轴线A-A的上方。根据从分离器100的培养液中分离出的脂质相密度的不同，在使用中，第一出口150可以用于从分离器100转移脂质产物，或者可选地，第一出口150可以用于卸压。
第二出口160位于分离器100的第二端130，并且具有通过分离室110的侧壁114通向分离室110的开口。在使用中，分离器100的方向设置为使得第二出口160位于分离室110的纵轴线A-A的下方。根据从分离器100中的培养液分离出的脂质相的密度的不同，在使用中，第二出口160可以用于从分离器100转移脂质产物，或者可选择地，第二出口160可以用于从分离器100中转移已分离出脂质产物的培养液。
第三出口170位于分离器100的第二端130，并且具有通过分离室110的侧壁114通向分离室110的开口。在使用中，分离器100的方向设置为使得第二出口170处于分离室110的纵轴线A-A的上方。根据从分离器100中的培养液中分离出的脂质相密度的不同，在使用中，第三出口170可以用于从分离器100转移分离出脂质产物的培养液，或者可选地，第三出口170可以为多余的。
第三出口170位于圆筒的与第二出口160成180度的圆周上，第三出口170与第二出口160距分离室110的端壁113的距离相同。第三出口170位于圆筒的与第一出口150成0度的圆周上，但第三出口170位于圆柱部112与第一出口150相对的端。
分离室110连接于支架(未示出)，该支架使得分离室110的纵轴线A-A相对于水平面的角度可以变化。对于实施例1和2，使用的角度为与水平面成30度。
如图2所示，设备10包括发酵器200和分离器100，并设置为用于实施例1。分离器设置为分离比培养液密度更小的槐糖脂相(脂质产物相)。
分离器100包括根据图1的分离器。
设备10设置为用于分离器100接收来自发酵器的含有脂质产物的培养液300，并从上述培养液中分离出比培养液300密度更大的脂质产物相310，以提供已分离出脂质产物的培养液320。该设备进一步设置为使脂质产物相310通过泵(未示出)转移并收集在容器400中，并且设置为使已分离出脂质产物的培养液320返回发酵器200中。
分离器100的角度设置为使得分离室110的纵轴线A-A与水平面成30度角。第一出口150作为脂质产物相310的出口，第二出口160作为已分离出脂质产物的培养液320的出口，并且第三出口170用塞子180密封而不使用。
发酵器200包括用于乘装培养液300的发酵室210。发酵器200还包括用于搅动培养液的搅拌器220。发酵器还包括用于给培养液曝气的空气分布器(未示出)。发酵器200还包括通过泵(未示出)与分离器的培养液入口140流体连通的培养液出口230。此外，发酵器包括通过泵(未示出)与分离器100的第二出口160流体连通的培养液入口240。
如图3所示，设备10a包括发酵器200和分离器100，并设置为用于实施例2。分离器设置为分离比培养液密度更大的槐糖脂相(脂质产物相)。
设备10a与设备10基本相同，并且类似的部件也相应地编号。设备10a和设备10的设置之间的主要区别在于出口150、160、170的使用以及分离器100和发酵器200之间的流体连通。
分离器100包括根据图1的分离器。
设备10a设置为用于分离器100接收来自发酵器的含有脂质产物的培养液300，并从上述培养液中分离出比培养液300a密度更小的脂质产物相310a，以提供已分离出脂质产物的培养液320a。该设备进一步设置为使脂质产物相310a通过泵(未示出)转移并收集在容器400中，并且设置为使已分离出脂质产物的培养液320a返回发酵器200中。
分离器100的角度设置为使得分离室110的纵轴线A-A与水平面成30度角。第一出口150用作卸压出口并设置有空气过滤器190，第二出口160作为脂质产物相310a的出口，第三出口170作为已分离出脂质产物的培养液320a的出口。
发酵器200包括用于乘装培养液300a的发酵室210。发酵器200还包括用于搅动培养液的搅拌器220。发酵器还包括用于给培养液曝气的空气分布器(未示出)。发酵器200还包括通过泵(未示出)与分离器的培养液入口140流体连通的培养液出口230。此外，发酵器包括通过泵(未示出)与分离器100的第三出口170流体连通的培养液入口240。
发酵
对于实施例1和2以及对比例1C，分别使用假丝酵母菌ATCC 22214间歇进料发酵生产槐糖脂。
用于发酵进料的底物是葡萄糖和菜籽油。对于实施例1和实施例2，底料的进料速率不同以便得到槐糖脂相，以在实施例1中得到分离于分离器的顶部的槐糖脂相，并在实施例2中得到分离于分离器的底部的槐糖脂相。对于对比例1C，底物进料速率与实施例1基本相同。图4示出了实施例1和对比例1C的底物进料，图5示出了实施例2的底物进料。
对于实施例1和2以及对比例1C中任意一个，用于发酵、预培养和琼脂平板的生长培养基含有6g·L-1的酵母提取物和5g·L-1的蛋白胨。在所有发酵、预培养和琼脂平板中葡萄糖的初始浓度均为100g·L-1，发酵器中菜籽油的初始浓度为50g·L-1，预培养中菜籽油的初始浓度为100g·L-1，琼脂平板中菜籽油的初始浓度为0。
首先将假丝酵母菌从低温储存(-80℃)转移到琼脂平板上，并在25℃下培养48h。然后将来自这些平板的单菌落接种于置于250mL摇瓶中的50mL的培养基中，将其在25℃和200rpm培养30h。用新鲜培养基将该接种物稀释至600nm的光密度为20，并用于接种发酵器。
在25℃下进行发酵，通过改变搅拌器速度将溶解氧控制在30％，同时保持1L·min-1的恒定通气速率。通过加入3M的氢氧化钠将发酵器的pH值控制在3.5。
对于实施例1和2，根据生产速率进行分离，在发酵过程中分离分多个场合进行，在这些操作场合之间有停顿。当进行分离时，使用蠕动泵将富含槐糖脂的培养液泵入外径为8mm、壁厚为1mm的硅胶管中，并进行从发酵器、经过分离器并返回到发酵器的连续循环。将进出分离器的培养液的流速控制在约1mL·s-1，使培养液在分离室中的停留时间为76s。
在分离室中，由于相对密度的差异，槐糖脂相从培养液中分离出来。在实施例1中，槐糖脂相向分离室的顶部分离，同时在实施例2中，槐糖脂相向底部分离。
对于实施例1和实施例2，在分离操作期间，培养液最初连续循环并且槐糖脂相累积于分离室中。当累积于分离室中的槐糖脂相达到沉降室高度的50％时(通常在操作约3min后发生)，根据沉降器中槐糖脂相积累或减少，出口泵开始以0.5-2mL·min-1的速率连续除去槐糖脂产物相。
在实施例1和2中间歇地进行分离，分离出大部分可用的槐糖脂相，并且当累积足够的槐糖脂相时再次运行。
在所示的实施例中，虽然分离器设计为在所用规模下连续运行，但分离速率是生产速率的30-150倍。因此，分离器是间歇运行地。使用较大规模的设备(未示出)，培养液可以进行从发酵器、经过分离器并返回到发酵器的连续循环。
在实施例1中在111h、184h和261h进行分离，在实施例2中在71.5h、281h、355h和376h进行分离，并且在对比例1C中没有进行槐糖脂相的分离。
分析技术
对于所有分析，在每个样品时间点从发酵器中取出5mL的培养液。使用Sigma 6-16S离心机(希格玛实验室离心机(Sigma laboratory centrifuges)，德国)将样品在5000rpm下离心5min，并且上清液中的葡萄糖使用
Figure BDA0001970856820000281
血糖监测仪(尼普洛日本(Nipro Japan))定量。
通过重量测量残余油和槐糖脂浓度，首先先用正己烷萃取分离剩余油，再用三乙酸乙酯萃取分离槐糖脂。在环境温度下将提取物在称量皿中干燥30h至恒重。
通过测量干细胞重量和光密度确定细胞生长。溶剂萃取后，将8mL蒸馏水加入离心管的剩余样品中，然后以8000rpm离心10min。弃去上清液，将得到的细胞沉淀在8mL蒸馏水中再悬浮。将该细胞悬浮液转移到干燥盘中，在干燥箱中在90℃下干燥至恒重。当稀释接种物时，用600nm波长下的光密度代表干细胞重量。
在安捷伦6520QTOF质谱仪(安捷伦，美国)上采用负电离电喷雾电离(negativeionization electrospray ionisation)测定生产的槐糖脂的结构。通过将槐糖脂提取物溶解于乙酸乙酯中，并使用0.2μm过滤器过滤来制备样品。使用流动注射分析，0.3mL·min-1，50％的乙腈、0.1％的甲酸、49.9％的水，注射体积为2μL。
结果
实施例1和2中达到的分离参数示于表1中，实施例1和2以及对比例1C的关键指标示于表2中。
表1-分离参数
Figure BDA0001970856820000291
表2-关键指标
Figure BDA0001970856820000301
从表1中可以看出，无论槐糖脂相比培养液的密度低(实施例1)或比培养液的密度高(实施例2)，都证实了在发酵过程中将大部分的槐糖脂从培养液中回收的能力。
由于最大发酵器体积减小，实施例1中使用分离进行槐糖脂回收使得比不进行分离的比较例1C获得了更高的生产率。如图6所示，其显示了将收集到的槐糖脂加回到实施例1的培养液中的效果，使用分离还提供了的较低的维持所需溶解氧水平所需要的搅动需求。
对于实施例1和实施例2，大部分槐糖脂从培养液中除去。从培养液表面(实施例1)分离槐糖脂的回收率为86％，显著高于从底部(实施例2)分离槐糖脂的回收率(57％)，但这可能主要是由于在实施例2中最终分离的分离时间较短。
在实验室规模的实施例1和2中，当沉降柱底部/顶部的槐糖脂层变得太低时必须停止分离，以防止培养基和细胞相被夹带在产物流中。随着规模增大，由于必须再循环回发酵器的最小槐糖脂相的深度与发酵器体积无关，回收率可能会提高。
通过实施例2中的分离几乎不除去细胞或油。对于实施例1，细胞去除可忽略不计。虽然在实施例1中除去了68g的油，但通过更好地控制给油速率来保持发酵器中较低的油浓度，可能基本上减少或消除这种情况。
在不同时间点进行提取的浓缩倍数从3.73到6.07变化显著。由于提取物中的浓度变化很小，约为550g·L-1，因此这种变化被认为主要是由于分离前发酵器中具有的槐糖脂浓度。可能的是随着发酵器体积的增加，系统可以在较低的初始槐糖脂浓度下操作，因此可以改善浓缩倍数。
通过将发酵器中槐糖脂的质量和从发酵器中提取的槐糖脂的质量相加来计算生产的槐糖脂总量。底物进料意味着在大部分发酵过程中体积大于1L的初始体积。
对于实施例1，最大体积的生产率为0.69g·L-1·h-1，对于对比例1C，其为0.62g·L-1·h-1，当使用分离时显示出有效生产率增加11％。这是由于当使用分离时达到的最大体积为1540mL，比不分离时的最大体积1720mL减小。由于发酵的进料速率的差异，实施例2的相应生产率为0.57g·L-1·h-1不能直接比较。
从发酵早期开始以连续模式使用分离可能使得可以将发酵体积控制在约1.3倍的初始体积(而无控制下发酵体积会在280h后升高到约1.7倍的初始体积)。这可以相当于有效的生产力增长30％以上。
在实施例2中，第一次提取槐糖脂是在71.5h，此时可观察到槐糖脂相在2min内在样品瓶中沉降。由于间歇的葡萄糖进料引起的高残余葡萄糖浓度，到283h前沉降一直无法起作用。虽然槐糖脂沉降或漂浮也取决于其他因素，但葡萄糖浓度50g·L-1倾向于代表槐糖脂沉降或漂浮到表面的阈值。更好地控制给料速率可能可以使槐糖脂在发酵过程中始终沉降。
在实施例1中，葡萄糖浓度最初升高，并且在发酵的大部分时间保持在50g·L-1以上，当油大量存在时，葡萄糖与大约140h后残留浓度显著的菜籽油结合，导致槐糖脂上升到发酵器表面并与残油形成混合相。
流体动力学和传质效应
在发酵后收集实施例1的槐糖脂提取物，并在在308.3h于12min内返回发酵器。图6示出了实施例1结束时的溶解氧水平和搅拌器速度，加入粘性槐糖脂相后溶解氧下降。该槐糖脂相的存在有效地降低了发酵器中的Kla，使得将溶解氧保持在设定点所需的搅拌器速度增加。当在整个发酵过程中产生的槐糖脂相增加时，需要提高约75rpm的搅拌速率以维持所需的溶解氧水平，这导致搅拌功率需求增加了40％以上。
实施例3
实施例3使用替代的分离器和发酵条件。所用的分离器是图7中所示的内置沉降柱。
分离器1100包括分离室1110。在使用中，在分离器1100的第一下端1120，分离室1110具有圆台部1111。分离室1110还包括直径为50mm且长为150mm的圆柱部1112。在使用中，圆柱形部分的底部1113形成为分离器的使用中的上端1130。
分离器1100包括培养液入口1140并且具有通向分离室1110的开口，该开口位于分离室1110的第一端1120处，且位于分离室1110的纵轴线A-A上。入口接收受来自发酵器200的含有脂质产物的培养液300。
分离器包括如图7中1160示出的第一出口(IIIA)和图7中1170示出的第二出口(IIIB)。
第一出口1160位于分离器1100的第二端1130，并且具有通过分离室1110的侧壁1114通向分离室1110的开口。在使用中，分离器1100的方向设置为使得第一出口1160位于分离室1110的纵轴线A-A的下方。根据从分离器1100的培养液中分离出的脂质相的密度的不同，在使用中，第一出口1160可以用于从分离器1100转移脂质产物，或者可选地用于从分离器1100转移已分离出脂质产物的培养液。在如图7所示的实施例3中，出口1160用于将已分离出脂质产物的培养液1320转移到发酵器200中。
第二出口1170位于分离器1100的第二端1130，并且具有通过分离室1110的侧壁1114通向分离室1110的开口。在使用中，分离器1100的方向设置为使得第二出口1170位于分离室110的纵轴线A-A的上方。根据从分离器100的培养液中分离出的脂质相的密度的不同，在使用中，第二出口1170可以用于从分离器1100转移脂质产物，或者可选地用于从分离器1100转移已分离出脂质产物的培养液。在如图7所示的实施例3中，出口1170用于将脂质产物1310转移到容器400中。
分离室1110连接到支架(未示出)，该支架使得分离室1110的纵轴线A-A相对于水平面的角度可以变化。对于实施例3，使用的角度为与水平面成30度。
在实施例3中，使用提高的培养基浓度(包括18g·L-1的酵母提取物和15g·L-1的蛋白胨)来实现高细胞密度和更快速的生产。这需要更高的进料速率，如图9所示。将搅拌速率固定在900rpm，并在体积为3L的Applikon生物反应器(发酵器)中进行发酵，初始体积为1.5L。在实施例3中使用图7的分离器，以便更好地从培养液表面分离脂质产物。所有的其他参数与实施例1和2相同。
更高的细胞密度使得槐糖脂生产速度更快，并且槐糖脂的总产量达到689.8g·L-1。整合分离系统对于延长发酵运行过程是必要的，以防止生物反应器溢流(否则会在约165h和392g·L-1的槐糖脂时发生这种情况)和氧气耗尽，其在100h内降至所需的30％设定点以下并通过分离进行校正。
这意味着整个发酵可以保持2.24g·L-1的生产率，除了额外的氮源这一点之外，没有明显降低生产率。这些在270h左右添加，并导致短暂的生物量生长期，然后继续生产。应当理解，这对于使用该技术在连续发酵中长时间生产槐糖脂时的细胞生长期可能是有用的。
发酵过程中产生的79.2％的槐糖脂被回收，即总共819g。
图8示出了生物反应器内的底物的浓度，即葡萄糖的浓度(用实心三角形表示)和油的浓度(用星号表示)以及干细胞重量的浓度(用空心方块表示)。图8还示出了生物反应器内槐糖脂的生产(槐糖脂的浓度由实心圆圈表示，槐糖脂总量由空心圆圈表示)。
图9示出了底物油进料速率(由虚线表示)底物葡萄糖进料速率(由虚线表示)和总底物进料速率(由实线表示)。
在图8中，带有虚线的箭头表示进行整合槐糖脂分离的时间，实线表示将溶解于100mL水的12g酵母提取物和10g蛋白胨中加入生物反应器中。
应当理解，本发明的优选实施方案可以提供改进的生产槐糖脂的方法，并且特别是可以提高生产率和降低能量需求。
需要注意的是，与本申请同时提交或之前提交的与本申请有关的所有的论文和文件、和本申请公开供公众查阅的文件和文件以及所有这些论文和文件的内容通过引用并入本文。
本说明书中公开的所有特征(包括任何从属权利要求、摘要和附图)，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以任意组合，其中至少部分特征和/或步骤相互排斥的组合除外。
除非另外明确说明，否则本说明书中公开的每个特征(包括任何从属权利要求、摘要和附图)可以由用于相同、等同或类似目的的其他特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或类似特征的一个示例。
本发明不限于前述实施例的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何从属权利要求，摘要和附图)中公开的特征的任何新特征，或者任何特征的新组合，或由此公开的任何方法或过程的新步骤，或者任何方法或过程的步骤新组合。

Claims (18)

1.一种生产脂质的方法，其中，所述方法包括：
(a)在发酵器中进行发酵以生产含有脂质产物的培养液；
(b)将含有脂质产物的培养液从所述发酵器转移到重力分离器；
(c)使含有脂质产物的脂质相在所述重力分离器中通过重力与所述培养液的其他成分分离；
(d)使已分离出脂质产物的培养液从所述重力分离器返回至所述发酵器；以及
(e)从所述重力分离器转移脂质产物；
所述重力分离器为步骤(c)中使用的唯一的分离器；
其中，所述脂质产品选自槐糖脂、鼠李糖脂和甘露糖赤藓糖醇脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括：使培养液在所述发酵器和重力分离器之间循环至少50h的时间段，或者，在所述发酵期间，使培养液在所述发酵器和重力分离器之间循环；所述方法包括：从所述发酵器转移培养液并使培养液返回到所述发酵器，以使得：以所述发酵器和重力分离器中所述培养液的总重量计，所述发酵器中含有至少80重量％的所述培养液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，使培养液在所述发酵器和重力分离器之间连续循环。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法使得：以所述发酵器和重力分离器中所述培养液的总重量计，所述发酵器中含有至少90重量％的所述培养液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法使得：以所述发酵器和重力分离器中所述培养液的总重量计，所述发酵器中含有至少95重量％的所述培养液；并且其中，所述方法包括在所述发酵生产期的持续时间内将底物加入到所述发酵器中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括将所述发酵器中的培养液的脂质的浓度保持在80g·L-1以下，以防止生物反应器溢流和溶解氧耗尽。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，搅动所述发酵器中的培养液以防止相分离，并且所述发酵器中不发生相分离。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重力分离器包括分离室，且所述重力分离器适于使得：在使用中，所述室的纵轴线与水平方向呈10度到60度布置。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)包括：使所述培养液在所述重力分离器中通过重力分离以提供含有脂质产物的脂质相和含有培养液的其他成分的大部培养液，并且其中，所述重力分离器中的所述大部培养液含有底物和/或细胞，并且其中，所述方法包括分离出不含细胞的脂质相；并且其中，所述脂质相含有水和脂质产物，浓度为至少80重量％。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，浓度为至少90重量％。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，浓度为至少95重量％。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，控制发酵条件以产生槐糖脂产物，其中，pH为2～5，以至少0.5g·L-1·h-1的速率加入糖，以至少0.5g·L-1·h-1的速率加入植物油，所述发酵器中培养液的溶解氧水平为至少20％。
13.一种适用于权利要求1-12任意一项所述的生产脂质的方法的重力分离器，所述重力分离器适于将脂质相与含有脂质的培养液的其他成分分离，其中，所述重力分离器包括：
(I)分离室，在使用中，所述分离室使得所述培养液能够在其中停留一段时间，以使含有脂质产物的脂质相与所述培养液的其他成分分离；并且其中，所述分离室适于使得：在使用中，所述室的纵轴线与水平方向呈10度到60度布置；
(II)通向所述分离室的培养液入口，用于在使用中将含有脂质产物的培养液转移到所述分离室中；以及
(III)从所述分离室引出的出口，用于：(i)在使用中，从所述分离室转移已分离出脂质产物的培养液；以及(ii)在使用中，从所述分离室转移脂质产物。
14.根据权利要求13所述的重力分离器，其中，所述重力分离器包括三个出口：
(IIIa)第一出口，位于所述分离室的使用中的上端，开口高度为所述分离室的上部纵向长度10％处；
(IIIb)第二出口，位于所述分离室的使用中的下端，开口的高度为所述分离室的下部纵向长度10％处，且所述第二出口处于所述分离室的纵轴线的下方；以及
(IIIc)第三出口，位于所述分离室的使用中的下端，开口的高度为所述分离室的下部纵向长度10％处，且所述第三出口处于所述分离室的纵轴线的上方。
15.根据权利要求14所述的重力分离器，其中，三个出口设置为选择性地如下使用：
(1)第一出口用于卸压，
第二出口用于从所述分离室转移脂质产物；
第三出口用于从所述分离室中转移已除去脂质产物的培养液；或者
(2)第一出口用于从所述分离室转移脂质产物；
第二出口用于从所述分离室中转移已除去脂质产物的培养液；
第三出口不使用。
16.根据权利要求13所述的重力分离器，其中，所述重力分离器包括：
(I)分离室，在使用中，所述分离室使得所述培养液能够在其中停留一段时间，以使含有脂质产物的脂质相与所述培养液的其他成分分离；
(II)培养液入口，位于所述分离室的第一端，所述第一端位于分离室的圆台部，所述培养液入口与发酵器的培养液出口流体连通，用于在使用中将含有脂质产物的培养液转移到所述分离室中；
(IIIA)第一出口，位于所述分离室的第二端，所述第二端位于分离室的圆柱部的底端；以及
(IIIB)第二出口，位于所述分离室的第二端；并且其中所述培养液入口包括通向所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的使用中的下端，所述开口位于所述分离室的纵轴线上；所述第一出口包括通向所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的侧壁上，所述开口位于所述侧壁的区域中且朝向所述分离室的使用中的上端，开口高度为所述分离室的上部纵向长度10％处，并且其中，在使用中，所述通向分离室的开口位于所述分离室的纵轴线的下方；以及
所述第二出口包括通向所述分离室的开口，所述开口位于所述分离室的侧壁上，所述开口位于所述侧壁的区域中且朝向所述分离室的使用中的上端，开口的高度为所述分离室的上部纵向长度10％处，并且其中，在使用中，所述通向分离室的开口位于所述分离室的纵轴线的上方。
17.一种适用于权利要求1-12任意一项所述的生产脂质的方法的设备，所述设备包括具有发酵室的发酵器和根据权利要求13至16中任意一项所述的重力分离器，其中，所述发酵室和所述重力分离器的分离室流体连通，以使得：在使用中，含有脂质产物的培养液能够从所述发酵室转移至所述分离室，并且已分离出脂质产物的培养液能够从所述分离室转移至所述发酵室。
18.根据权利要求17所述的设备，其中，所述分离室适于使得：在使用中，所述室的纵轴线与水平方向呈10度到60度布置。
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