BR102013033410A2 - processo e sistema de produção microbiana de lipídios com recuperação e seus usos - Google Patents

Abstract

processo e sistema de produção microbiana de lipídios com recuperação dos lipídios e seus usos a presente invenção refere-se a um processo e sistema de produção microbiana de lipídeos com recuperação e seus usos. um processo de produção de lipídios que compreende as etapas de crescimento e acúmulo microbianas, em fontes de carbono complexas ricas em açúcares, com recuperação do produto por solvente. um sistema de produção de lipídios que compreende um tanque de armazenagem de dita fonte de carbono complexa (1), biorreator(es) (2), (3) e (4) de crescimento e acumulo e uma unidade de recuperação (5) de produto e células.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção Processo e Sistema de Produção Microbiana de Lipídios Com Recuperação E Seus Usos Campo da Invenção [001 ]A presente invenção refere-se a um processo e sistema de produção microbiana de lipídios por Rhodosporídium toruloides, novo e inventivo, para serem utilizados preferencialmente como combustível. Também é descrita a recuperação de lipídios produzidos pelo processo e sistema da presente invenção. A presente invenção situa-se principalmente nos campos da química, biologia e biotecnologia industrial.

Antecedentes da Invenção [002] O mundo está perseguindo tecnologias voltadas para a produção de combustíveis renováveis devido à possibilidade de esgotamento dos combustíveis não renováveis e preservação do meio ambiente (Cuellar, Heijnen, & Wielen, 2013; S. E. Karatay & Donmez, 2010; Sevgi Ertugrul Karatay & Donmez, 2011; Ong, Mahlia, & Masjuki, 2011). Esses biocombustíveis já são produzidos em escala industrial por vários países, com destaque para o etanol produzido no Brasil, a partir dos açúcares da cana de açúcar (Cuellar et a!.., 2013; Ridley et ai., 2012). Entretanto, intensificar a produção desses biocombustíveis e aumentar os produtos obtidos por essa biotecnologia branca enfrenta vários desafios tanto econômicos como tecnológicos. O seu sucesso tem como gargalo uma matéria prima renovável de baixo custo e processos de transformação maximizados.

[003] Dentro desses desafios, o biodiesel está em destaque no cenário mundial, sendo apontado como o combustível com maior potencial de substituição do diesel de petróleo(Atadashi, Aroua, & Aziz, 2010; Leung, Wu, & Leung, 2010). Seus custos de produção são aproximadamente de 80% para aquisição de matéria prima e 20% operacionais, não sendo atrativo economicamente devido aos altos valores dos óleos vegetais, sua principal matéria-prima (de Carvalho Lopes, Steidle Neto, & Martins, 2011; Haas, McAloon, Yee, & Foglia, 2006).

[004] üma possível solução desse problema podem ser os lipídios microbiológicos (SCO), produzidos por fermentação usando algas, fungos filamentosos e principalmente leveduras, avaliadas por muitos pesquisadores (Economou, Aggelis, Pavlou, & Vayenas, 2011; Economou, Makri, Aggelis, Pavlou, & Vayenas, 2010; M. Li, Liu, Chi, & Chi, 2010). Contudo, diferentemente das algas, os microrganismos não necessitam de luz, dessa forma podem ser cultivados em maiores densidades de carga, gerando melhores rendimentos (WO2010014797).

[005] Estudos mostram que a obtenção desses lipídios microbianos pode vir a ser uma alternativa para fontes de lipídios tradicionais (Hassan, Blanc, Granger, Pareilleux, & Goma, 1996; Meesters, Huijberts, & Eggink, 1996; Meesters, vanderWal, Weusthuis, & Eggink, 1996; Ykema, Verbree, Kater, & Smit, 1988), pois 80 a 90% desses lipídios são triglicerídeos (C. Ratledge, 1991).

[006] Apesar de todos os micro-organismos serem capazes de sintetizar lipídios, somente as cepas oleaginosas podem acumular dentro das suas células quantidades significativas de lipídios em relação à biomassa seca, com concentrações acima de 20% (Moreton, 1987; Papanikolaou & Aggelis, 2011b). A identificação dos micro-organismos que apresentam altos rendimentos de síntese de lipídios tem um grande interesse financeiro e industrial (Papanikolaou & Aggelis, 2011a; C. Ratledge, 2002).

[007] As leveduras oleaginosas possuem características metabólicas comuns às leveduras tradicionais, no entanto, quando as concentrações do nitrogênio no meio extracelular são limitantes, o crescimento celular é reprimido e o carbono consumido é transformado e armazenado na forma de inclusões lipídicas (Hassan et aL, 1996), A exaustão de nitrogênio provoca a rápida diminuição da concentração intracelular de AMP, levando o microrganismo a quebrar AMP em IMP e NH+. Esse NH+ excretado pelo microrganismo é a tentativa de complementação da fonte de nitrogênio do meio extracelular (Evans & Ratledge, 1985). Resumidamente, em condições limitantes de nitrogênio, a concentração de adenosina monofosfato (AMP) diminui e a concentração de citrato aumenta possibilitando o acúmulo de lipídios(C. Ratledge, 1991).

[008] A acumulação de lipídios é fortemente afetada pela natureza da fonte de carbono disponibilizada (Wiebe, Koivuranta et. al. 2012), bem como os custos da fermentação, que dificultam a industrialização do SCO.

[009] A produção de lipídios por leveduras oleaginosas foi estudada em diferentes processos: batelada, batelada alimentada e contínuo, sendo que os dois últimos foram os mais apropriados para maximizar a produção de lipídios devido a possibilidade de ajustar a relação carbono/nitrogênio no meio fermentativo e inicialmente obter altas concentrações celulares e depois estimular a síntese de produtos. As leveduras oleaginosas mais relatadas com características de produção de óleos microbianos são Cryptococcus curvatus (conhecido também como Cândida curvata ou Apiotrichum curvatum) (Gill, Hall, & Ratledge, 1977; Williams et al.., 1995), Rhodotorula gracilis (também conhecida como Rhodotorula glutinis) (Choi et al.., 1982; Granger et al.., 1993; Pradella, 1980; Ykema, Verbree, Vanverseveld, & Smit, 1986) e Rhodosporidium toruloides (Garzón, 2009; Turcotte & Kosaric, 1989) devido à alta produtividade de lipídios, boa estabilidade e a relativa facilidade no cultivo.

[010] Contudo, para que o processo e sistema de produção de lipídios sejam economicamente viáveis, as fontes dos substratos a serem aplicados devem ser de baixo custo. Assim sendo, diversos pesquisadores apresentam resultados de acúmulo de lipídios em micro-organismos, principalmente com leveduras em vários açúcares, mas o melaço com fonte de carbono foi muito pouco abordado.

[011] Destaca-se, como mais conhecido, o melaço da cana-de-açúcar, que é um subproduto da indústria do açúcar e tem aplicação como matéria-prima na obtenção do etanol. No entanto, existem diversas outras fontes do melaço, como de beterraba, soja ou cítricos.

[012] No caso dos melaços da cana, além de açúcares redutores e sacarose não cristalizada, eles também contêm minerais, como por exemplo, potássio, ferro, fósforo, cálcio e sódio, e matéria nitrogenada. Para os melaços de soja, pode-se citar a presença de micro e macronutrientes, nitrogênio e, além dos açúcares encontrados naqueles advindos da cana, há diversos outros açúcares, como a estaquiose e rafinose (Romão, 2011).

[013] Dessa forma, melaço é uma ótima opção como fonte de carbono uma vez que possuí baixo custo e altas concentrações de açúcares, no entanto, a também alta concentração de nitrogênio impede a acumulação dos lipídios em certos organismos (Zhu, Zhong et aL 2008). Sendo assim, é necessário selecionar microrganismos que sejam capazes de viabilizar a utilização dessa fonte, já que muitos deles têm a capacidade de crescer em tal substrato, mas são impedidos de acumular lipídios, pois, conforme relatado por outros autores, a partir do momento que as células consomem todo o nitrogênio do meio fermentativo, o substrato em excesso continua a ser assimilado pelas células e convertidos em lipídios para o armazenamento, até uma fração mássica máxima de cada microorganismo (Pradella, 1980; Papanikolaou et aL, 2009, Wu et al., 2011).

[014] No entanto, após o acumulo dos lipídios é necessário recuperá-los. Vicente et al.. 2009, estudaram o micro-organismo Mucor circinelloides para produção de biodiesel. Estes pesquisadores avaliaram a eficiência da extração de lipídios em três diferentes sistemas com solventes: (1) clorofórmio.metanol; (2) clorofórmio:metanol:água e hexano. Outra forma de extração deste trabalho foi uma extração monofásica usando clorofórmio: metanol: água (1:4: 0,8) seguido de partição das fases orgânicas e aquosa pela adição de clorofórmio e água para chegar à fração de (1:1: 0,9).

[015] Ao final, o lipídio foi convertido a biodiesel por transesterificação via catalise ácida (BF3, H2S04 ou HCI) seguindo duas diferentes abordagens: (1) transesterificação lipídico microbiológico ou (2) transesterificação direta da biomassa seca.

[016] A levedura Rhodotorula glutinis foi avaliada para produção de biodiesel e carotenoides de alto valor, utilizando água residual de cervejaria como fonte de carbono (Schneider, Graeff-Hõnninger et al.. 2013). Estes autores quantificaram os lipídios e carotenoides deste micro-organismo através de uma recuperação da biomassa por centrifugação (3000 rpm por 10 min) e extração dos lipídios totais por uma mistura dos solventes clorofórmio e metanol (Bligh e Dyer 1959), evaporação do solvente e quantificação gravimétrica. Uma solução de metanol com ácido sulfúrico (2%) foi utilizada como catalisador para a transesterificação em banho-maria à 60°C por 2 horas e os éster metílico de ácido graxo foi recuperado com tolueno.

[017] Nota-se, portanto, que há grande esforço dos pesquisadores em viabilizar a produção de lipídios. Uma das formas de se alcançar os resultados esperados é a utilização de linhagens de microrganismos mais promissoras, como é o caso do Rhodosporidium toruloides, mais especificamente Rhodosporidium toruloides CCT 0783. A R. toruloides CCT 0783 apresenta características morfológicas singulares durante o seu crescimento e acúmulo, que facilitam a sua posterior recuperação e, consequentemente, melhora os valores de rendimentos na extração de lipídios.

[018] Outra forma de ação é através do desenvolvimento de sistemas de produção capazes de fornecer unidades de operação que possibilitem o bom desempenho de todas as etapas do processo, como por exemplo, as etapas de: crescimento das células, acúmulo dos lipídios e, principalmente, recuperação das células e do produto.

[019] Para isso, diversas tecnologias vêm sendo desenvolvidas, com o intuito de solucionar o alto custo de produção do biodiesel com um maior rendimento na produção de lipídios, como pode ser notado nas anterioridades a seguir.

[020] O pedido de patente PI 0406347-3 reconhece que melaço e outras fontes de carbono advindos da cana, são bons substratos para a produção de lipídios. Também descreve brevemente a recuperação desses lipídios por solventes. Contudo, o pedido não se concentra em um processo ou sistema de produção que seja destinado ao Rhodosporidium toruloides CCT 0783, que como já levantado anteriormente, é um produtor excepcional de triglicerídeos.

[021 ]0 pedido de patente W0201017610 um processo de obtenção de lipídios a partir de hexoses e pentoses, provenientes de diversas fontes, utilizando microrganismos oleaginosos. Dentre as fontes de carbono cita-se o melaço, contudo, o pedido não se concentra em um processo de recuperação do lipídio, além de não abordar nos exemplos a linhagem Rhodosporidium toruloides CCT 0783.

[022] A presente invenção difere do dito pedido, pois esse último apresenta um processo e sistema de produção de lipídios que não são destinados ao Rhodosporidium toruloides CCT 0783, ou seja, que prejudicam os valores de rendimentos e inviabilizam o uso dos lipídios, produzidos por esse microrganismo, como combustíveis. Por esses motivos, nota-se que os valores de produção de lipídios atribuídos ao Rhodosporidium toruloides são inferiores quando comparados com os de Lipomyces.

[023] A patente GB2091285 descreve um sistema de produção de lipídios onde há uma etapa de crescimento e outra de acumulo. A extração das células ocorre pelo supracitado método Bligh e Dyer 1959.

[024] A presente invenção se difere de dita patente, pois o método Bligh e Dyer tem as desvantagens de aplicar solventes tóxicos e a indesejável extração dos contaminantes não lipídicos da fase orgânica. Ademais, os métodos de recuperação aplicados da presente invenção são destinados preferencialmente ao Rhodosporidium toruloides CCT 0783.

Sumário da Invenção [025] Na presente invenção, é apresentado um processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783. O microrganismo empregado na presente invenção tem a vantagem de conciliar bons resultados de crescimento celular e acúmulo de lipídios, em fontes de carbono complexas, preferencialmente, de melaço.

[026] O dito micro-organismos tem a vantagem de possuir, durante a etapa de acúmulo de lipídios, uma morfologia propícia para sua recuperação pelo sistema da presente invenção, formando um aglomerado celular no meio de fermentativo, com excelente resultado de flotação da biomassa no meio.

[027] Na presente invenção, é apresentado um processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783 que apresenta as etapas de: a) Crescimento das células, em que a concentração iniciai de açúcares advindos de fontes de carbono complexas ricas em açúcares é de 15 à 70 g L'1 e proporção C:N é de 6 à 28; b) Acúmulo de lipídios, em que a concentração inicial de açúcares advindos de fontes de carbono complexas ricas em açúcares, suplementada por adição de fonte de carbono é de 15 à 60 g L~1 e proporção C:N é de 20 à 80; c) Recuperação dos lipídios que compreende lise das céíulas, preferencialmente por solução ácida, e extração dos lipídios celulares, preferencialmente por um solvente que compreende um coeficiente de partição entre 0 e 5.

[028] Em uma realização preferencial do processo da presente invenção a fonte de carbono é suplementada por uma fonte de nitrogênio na etapa a), em que dita fonte de nitrogênio é preferencialmente (ΝΗ4)2δ04 ou solução aquosa de hidróxido de amônia.

[029] Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, o processo é conduzido em batelada alimentada e ocorre suplementação da fonte de carbono por um pulso de alimentação na etapa b), quando a concentração de nitrogênio inorgânico é menor que 0.1 g L*1, aumentando a concentração dos açúcares para até 60 g L~1.

[030] Em uma realização preferencial da presente invenção o inoculo utilizado na etapa a) e b) do Rhodosporidium toruloides CCT 0783 compreende fonte de carbono, preferencialmente glicose, fonte de nitrogênio e fontes de micro e macronutrientes, preferencialmente KH2PO4, Na2HP04, Mg2S04.7.H20, NaCI, CaCE, em pH levemente ácido, preferencialmente 5.8.

[031 ]Em uma realização preferencial do processo da presente invenção a solução ácida da etapa c), é constituída de um ácido forte, preferencialmente HCI, H3PO4 e H2S04, e em que o solvente de dita etapa, compreende um coeficiente de partição octanol/água entre 0 e 5 e é preferencialmente hexano, ciclohexano, éter de petróleo e éter etílico. Ditos solventes podem ser misturados a outros compostos, preferencial mente alcoóis, os quais auxiliam a etapa de extração.

[032]Em uma realização preferencial do processo da presente invenção a solução ácida da etapa c) tem proporção biomassa:H2S04 de 1 à 5.

[033] Na presente invenção, também é apresentado um sistema de produção de lipídios, que compreende: i) tanque de armazenagem, preferencialmente onde ocorre diluição da fonte de carbono por adição de água; ii) biorreator, onde ocorre adição da fonte de nitrogênio e carbono e crescimento das células e/ou onde ocorre preferencialmente alimentação adicional da fonte de carbono e acúmulo de lipídios nas células. iii) unidade de recuperação das células e produto, que compreende reator de lise celular , separador sólido/líquido e extrator e, em sequencia ao extrator, se encontrar um recuperador de solvente, filtro e secador.

[034] Em uma realização preferencial do sistema da presente invenção após a diluição da fonte de carbono pela adição de água, a mistura passa por processo de esterilização em um equipamento esterilizador.

[035] Em uma realização preferencial do sistema da presente invenção após a passagem pelo esterilizador, a temperatura da mistura é diminuída até uma temperatura em que não ocorra morte celular do microrganismo produtor de lipídios.

[036] Em uma realização preferencial do sistema da presente invenção, a etapa de crescimento e acumulo ocorre em biorreatores diferentes.

[037] Em uma realização preferencial do sistema da presente invenção, o separador sólido/líquido é um flotador, onde ocorre concentração da biomassa no meio fermentativo.

[038] Em uma realização preferencial do sistema da presente invenção o extrator é um extrator tipo reator agitado, onde ocorre a recuperação dos lipídios da micela através da quebra de dita micela e a solubilização do lípídio em solvente.

[039] Em uma realização preferencial do sistema da presente invenção, após a passagem pelo extrator, a mistura é encaminhada a um separador líquido:solido:líquido, que utiliza de uma diferença de densidade e/ou força centrífuga para a recuperação dos produtos solução ácida, lama de biomassa desengordurada e mistura solvente-lipídios em 3 correntes.

[040] Em uma outra realização preferencial do sistema da presente invenção a extração do lipídio da micela e recuperação dos produtos solução ácida, lama de biomassa desengordurada e mistura solvente-lipídios, ocorre em um só extrator.

[041 ]Em uma realização preferencial da presente invenção, após a etapa de separação solido:liquido:solido, a corrente contendo óleo e solvente é enviada para um recuperador de solvente, onde ocorre recuperação de solvente e biomassa desengordurada, essa ultima sendo enviada para um segundo tanque de armazenagem.

[042] Em uma realização preferencial da presente invenção o recuperador de solvente é do tipo evaporador.

[043] Em uma realização preferencial da presente invenção, após a etapa de separação solido:liquido:solido, a corrente de detritos de levedura, é enviada para um filtro e posteriormente a um secador. O extrato em pó contendo leveduras é enviado para um silo de armazenagem.

[044] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783, o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios.

[045] Em uma realização preferencial do processo de produção de lipídios microbianos por Rhodosporidium toruloides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, a concentração inicial dos açúcares utilizados na etapa de crescimento são ajustados no tanque de armazenagem pela adição de água.

[046] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, após esterilização e abaixamento da temperatura, a mistura é enviada ao biorreator para iniciar a etapa de crescimento.

[047] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruíoides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, após a etapa de crescimento a mistura é enviada para outro biorreator, onde ocorrerá a etapa de acúmulo de lipídios.

[048] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruíoides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, finalizado o acumulo de lipídios a mistura é enviada para um reator de lise celular.

[049] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruíoides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, a lise celular ocorre por adição de solução ácida que tem proporção biomassa:H2S04 de 1 à 5.

[050] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruíoides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, o separador solido/líquido, é preferencialmente um flotador, onde ocorre concentração da biomassa no meio fermentativo para 200 g L'1.

[051 ]Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruíoides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, as células separadas são enviadas a unidade de extração, onde ocorre a extração dos lipídios, preferencialmente por adição solvente apoiares, com baixa solubilidade em água, com um coeficiente de partição no octanol/água próximo de 0 e 5, em que dito sotvente é preferencialmente ciclohexano (C6Hi2).

[052] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, a mistura do processo de extração é enviada para um separador líquido:solido:líquido.

[053] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, a mistura óleo-solvente é enviada para um evaporador ou destilador.

[054] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, os detritos de levedura são enviados para um filtro e secador. O extrato em pó contendo leveduras é enviado para um silo de armazenagem.

[055] Em uma realização preferencial do processo de produção microbiana de lipídios por Rhodosporidium toruloides CCT 0783, em que o dito processo é realizado pelo sistema de produção microbiana de lipídios, o produto desse processo, lipídios e extrato em pó de levedura, podem passar por diversos tratamentos para serem usados como biocombustível, na indústria de alimentos, ou outros fins.

[056] O microrganismo aqui reivindicado, Rhodosporidium toruloides CCT 0783, foi depositado em março de 1986, no National Collection of Yeast Cultures, com número 1576.

Breve Descrição das Figuras [057] Figura 1 - Fluxograma do processo de produção de lipídios microbiológico para uma planta industrial.

[058] Figura 2 - Resultados cinéticos para um cultivo em batelada alimentada por pulso com Rhodotorula glutinis CCT 2182 (A) e Lipomyces starkeyi DSM 70296 (B): (A) ART; (·) N-Amoniacal; (*) Xr - Biomassa residual; (ο) X - Biomassa total;(m) Lipídios, [059] Figura 3 - Resultados cinéticos para um cultivo em batelada alimentada por pulso com Rhodosporidium toruioides CCT 0783 (C) e Rhodotorula minuta CCT 1751 (D); (A) ART; (·) N-Amoniacal; (*) Xr -Biomassa residual; (ο) X - Biomassa tota!;(·) Lipídios.

[060] Figura 4 - Morfologia da Rhodosporidium toruioides CCT 0783 antes do acúmulo de lipídios (A) e com acúmulo de lipídios (B) [061] Figura 5 - Recuperação dos lipídios via solução ácida {·) HCI; (*) H2S04e (A) H3PO4 em diferentes proporções de biomassa; ácido (m/m) Descrição Detalhada da Invenção [062] O processo de produção de lipídios microbianos da presente invenção é preferencialmente realizado no sistema de produção apresentado na Figura 1, conforme segue: [063] A concentração inicial de açúcares é ajustada pela adição de água no tanque de armazenagem (1) até uma concentração de 15 à 70 g L' 1 [064] A levedura da presente invenção Rhodosporidium toruioides CCT 0783, foi colocada em contato com meio contendo fonte de carbono na etapa a), que ocorre no biorreator (3), e b), que ocorre no biorreator (4), em que dita fonte de carbono compreende açúcares como glicose, frutose, sacarose, xilose e/ou suas combinações, não se limitando aos mesmos, sendo possível cultivar tal linhagem em meios contendo diferentes açúcares como estaquiose e rafinose. Em uma realização preferencial, utiliza-se açúcares do melaço.

[065] O meio contendo a levedura da presente invenção e fonte de carbono é suplementado com fonte de nitrogênio na etapa a), essa fonte podendo ser selecionado entre uréia, sais de amônia, extrato ou hidrolisados de levedura, peptona, caseinatos, resíduos da indústria agro-alimentar e resíduos de soja, puros e/ou combinações dos mesmos. Em uma realização preferencial, utiliza-se sais de amônia, mais especificamente (NH4)2S04.

[066] O pré-inoculo aplicado para o cultivo do Rhodosporidium toruloides CCT 0783, compreende peptona bacteriológica e fonte de carbono, preferencialmente glicose, em pH levemente ácido, preferencialmente 5.8.

[067] O pré-inoculo contém (em g L'1) 1 a 4 de extrato de levedura, 0,5 a 7 de peptona bacteriológica e 1 a 14 de glicose, com pH ajustado a 5.8.

[068] O inoculo contém (g L'1) 5 a 25 de glicose, 0,5 a 2 de (NH4)2S04, 0,5 a 2,0 de KH2P04, 0,5 a 2,0 de Na2HP04, 1,5 a 3,0 de Mg2S04.7H20, 0,5 a 1,5 de NaCI, 0,01 a 0,04 de CaCl2, e 1,5 a 4,0 de extrato de levedura com pH ajustado entre 5,5 e 5,8.

[069] A concentração inicia! de açúcares na etapa de acumulo de lipídios é ajustada pela adição de fonte de carbono para uma concentração entre 20 a 60 g L~1.

[070] Durante a fermentação, na limitação de nitrogênio, é adicionado um pulso de preferencialmente 0,150 L (500 g de ART L"1) de melaço. Nesse cenário, a temperatura é mantida entre 26 a 30 °C, pH ajustado entre 5,5 e 5,8, aeração de 0,1 a 5 vvm e oxigênio dissolvido entre 15 a 30 % em relação a saturação. A agitação preferencialmente poderá variar entre 250 a 900 rpm.

[071] Após o término da fermentação as células são enviadas para uma unidade de recuperação (5), onde é adicionado um ácido no reator (5a). A adição de ácido sulfúrico ocorre em uma proporção biomassa:ácido de até 5:1 (m/m), em uma temperatura entre 90°C à 135°C por 45 à 15 minutos. É possível realizar a lise celular aplicando outras proporções de ácido:biomassa, de acordo com a temperatura utilizada na lise celular. Assim sendo, em uma situação de 90°C por 45 minutos a proporção requerida é de 1:1.

[072] A micela biomassa: lipídios: meio fermentado, é concentrada preferenciaimente via flotador (5b). O flotador empregado tem capacidade de 0.2-1.0 m3 de ar.nr3 de meio.h'1, concentrando a biomassa em um valor máximo de até 200 g L_1 [073] A extração é realizada no extrator (5c) com a adição de um solvente com coeficiente de partição octanol/água de 0 a 5, preferencialmente de 3,0 à 3,5. A adição desse solvente, preferencialmente ciclohexano, ocorre em uma proporção biomassa lisada: solvente de 1:30 à 1:50 (m/m), preferencialmente em uma temperatura de 30°C por 4 h.

[074] A recuperação é realizada com separação da solução solvente e lipídios: biomassa desengordura e meio fermentado ácido, através de um separador liquido:solido:liquido (5d), preferencialmente centrifugação à 400 rpm, por no mínimo 7 minutos e no máximo 24 horas, e/ou um funil de decantação que separa o lipídio-solvente da biomassa desengordurada e meio.

[075] A mistura solvente-lipídio segue para um recuperador de solvente via evaporadores (5.1 e) em circuito fechado do lipídio. Já a biomassa, segue para um filtro (5.2.1e) e secador (5.2.2e), onde será convertido em extrato em pó e armazenado.

[076] Ainda, para melhor compreensão dos termos aplicados no presente pedido, entende-se como concentração inicial de açúcares, como a concentração inicial dos açúcares advindos das fontes de carbono complexas, como sacarose, glicose e frutose, que é admitida ao biorreator, após as devidas etapas de ajustes de concentração, como por exemplo, suplementações ou diluições, e que será consumida pelo microrganismo.

[077] Entende-se como suplementação, o processo de adição controlada de certa substância para melhorar as etapas que vêm a seguir. Por exemplo, suplementação da fonte de carbono, se refere à adição controlada de uma fonte rica em carbono, que irá incrementar a quantidade inicial de açúcares no meio, melhorando o rendimento do processo.

[078] Entende-se como fontes de carbono complexas ricas em açúcares, como fontes que possuem variados açúcares, preferencialmente denominados, mas sem restringir sua origem, como fontes não sintéticas, como por exemplo, resíduos do processo de extração do açúcar, seja ele da cana, soja, beterraba ou qualquer outro material rico em açúcares fermentescíveis, chamados de melaço.

[079] Entende-se como melaço, o resíduo de extração do açúcar de qualquer matéria-prima, preferencialmente da cana-de-açúcar, soja ou beterraba.

[080] Entende-se como unidade de recuperação, a unidade que separará principalmente lipídios, aqui denominados de produto, e biomassa, aqui denominada células, sendo possível recuperar e reaproveitar, através dessa unidade, diversos outros compostos, como por exemplo, solvente e solução ácida.

[081] Entende-se como tanque de armazenagem, esterilizadores, trocadores de calor, biorreatores, reatores, separadores sólido/líquido, extratores, recuperadores de solvente, filtros e secadores, ou outros instrumentos aqui descritos, como quaisquer equipamentos capazes de realizarem as atividades desenvolvidas por aqueles aqui descritos.

Exemplos - realizações preferenciais [082] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma. 1. Microrganismo selecionado [083] As leveduras selecionadas para uma primeira triagem foram Rhodotorula glutinis CCT 2182, Rhodosporidium toruloides CCT 0783, Rhodotorula minuta CCT 1751 e Lipomyces starkeyi DSM 70296. As linhagens liofilizadas adquiridas foram reativadas e mantidas estocadas em 20 % (v V1) de glicerol em freezer -80°C e nitrogênio para posterior uso. 2. Produção de Lipídios [084] As cepas estoque foram transferidas assepticamente ao meio de cultivo chamado de pré-inoculo contendo (em g L~1) 3,0 de extrato de levedura, 5,0 de peptona bacteriológica e 10 de glicose, com pH ajustado a 5.8. O pré-inoculo foi transferido para um meio de cultivo chamado de inóculo contendo (g L~1) 20 de glicose, 1,0 de (NH4)2S04, 1,0 de KH2PO4, 1,0 de Na2HPC>4, 2,0 de Mg2S04.7H20, 1,0 de NaCI, 0,2 de CaCh, e 2,0 de extrato de levedura com pH ajustado a 5.8.

[085] Os cultivos em batelada e batelada alimentada foram realizados em biorreatores. O volume total de trabalho utilizado foi de 1,650 L, sendo um volume inicial de fermentação de 1,350 L de meio, mais 0,150 L de inóculo, com uma concentração de aproximadamente 50 g L~1 açúcares redutores totais (ART) e uma relação de ART: nitrogênio de 50.

[086] Durante a fermentação, na limitação de nitrogênio, foi adicionado um pulso de 0,150 L (500 g de ART L‘1) de melaço. A temperatura foi mantida em 28°C, pH 5,8 (controlado com NaOH 3M e H2SO4 3 M), aeração constante de 0,5 vvm e oxigênio dissolvido do meio à 30 % em relação a saturação, ajustado pela agitação (200-900 rpm).

[087] A massa de lipídios totais para cada fermentação foi quantificada gravimetricamente utilizando o método de extração de Bligh & Dyer (Bligh & Dyer, 1959) modificado por Manirakiza e colaboradores (Manirakiza, Covaci, & Schepens, 2001).

[088] A concentração da ART foi determinada usando um sistema de cromatografia liquida HPLC.

[089] O consumo do nitrogênio inorgânico, na forma de nitrogênio amoniacal, foi determinado mediante a reação de Berthelot, seguindo o protocolo proposto por Srienc e colaboradores (Srienc, Arnold, & Bailey, 1984). 3. Cinética de Crescimento [090] 0s cultivos em batelada alimentada realizadas no biorreator obtiveram parâmetros cinéticos da bioconversão dos açúcares do melaço em lipídios. A Figura 2 e 3 mostram o total de biomassa (X); biomassa residual (Xr), nitrogênio inorgânico; açúcares redutores totais (ART) e acúmulo de lipídios para as leveduras Rhodotorula glutinis CCT 2182 (A); Lipomyces starkeyi DSM 70296 (B); Rhodosporidium toruloides CCT 0783 (C) e Rhodotorula minuta CCT 1751 (D). A Tabela 1 apresenta os parâmetros cinéticos obtidos desses ensaios experimentais, [091] Tabela 1: Parâmetros cinéticos da bioconversão dos açúcares do melaço em lipídios [092] As leveduras R. minuta e R. toruloides não apresentaram fase de latência, equanto R. glutinis e L. starkeyi apresentaram uma dificuldade inicial do consumo dos açúcares do melaço, com valores de 3 h, 12 h, respectivamente.

[093] Considerando a biomassa total (Xr) das leveduras R. glutinis e R. toruloides, a velocidade de crescimento específica máxima (pmáximo) dessas leveduras foram superiores as leveduras L starkeyi e R. minuta, com valores de 0,20 Ir1, 0,23 Ir1, 0,11 h'1 e 0,11 Ir1, respectiva mente.

[094] Os rendimentos de conversão dos açúcares em biomassa residual (Yxr/s) para as leveduras R. minuta e R. glutinis apresentaram valores superiores as leveduras R. toruloides e L. starkeyi, com valores de 0,48, 0,47, 0,42 e 0,16, respectivamente.

[095] Os rendimentos de conversão dos açúcares em lipídios na fase de crescimento (Yupíciío/art) para a levedura R. toruloides apresentou valor superior as leveduras R. glutinis, L. starkeyi e R. minuta com valores de 0,14, 0,12, 0,11 e 0,11, respectivamente.

[096] Considerando a concentração de lipídios, a velocidade de produção de lipídios específica durante o acúmulo (pproduto) da levedura R. toruloides, foi superior e as leveduras L. starkeyi, R. glutinis e R. minuta, com valores de 0,030 tr1, 0,022 Ir1, 0,018 Ir1 e 0,010 Ir1, respectivamente.

[097] Os rendimentos de conversão dos açúcares em lipídios (Yxr/S) durante o acúmulo de lipídios para as leveduras, R. glutinis, R. minuta e R. toruloides apresentaram valores superiores a levedura L. starkeyi, com valores de 0,31, 0,30, 0,28 e 0,18, respectivamente.

[098] Com relação à massa de lipídio por massa de biomassa, nota-se que R. toruloides atingiu melhores resultados que todos os outros microrganismos testados, uma vez que seu valor é de 44%, enquanto que R. glutinis, L, starkeyi e R. minuta, alcançaram 36%, 32% e 27%, [099] As produtividade globais da produção de lipídios (Pr) para as leveduras, R. toruloides e R. glutinis apresentaram valores superiores a levedura R. minuta e L starkeyi, com valores de 0,41, 0,27, 0,13 e 0,11, respectivamente.

[100] A Figura 4 apresenta a morfologia especial da Rhodosporidium toruloides CCT 0783 antes do acúmulo de lipídios (A) e com acúmulo de lipídios (B). Durante o crescimento, esse fungo tem uma morfologia unicelular, de forma esférica e reproduz-se por brotamento. Durante a limitação de nutrientes e acúmulo de lipídios, sua morfologia modifica, formando filamentos e com um aglomerado celular insolúvel em água, que propiciam um bom resultado de flotamento. 4. Recuperação de células e Lipídios [101] Após a etapa de crescimento das células e acúmulo dos lipídios, esse último precisa ser extraído da biomassa. Para isso, a mistura é enviada para uma unidade de recuperação e purificação dos lipídios (RPB), onde a biomassa tem sua parede celular destruída por solução ácida e o bioproduto é extraído por um solvente.

[102] As etapas de RPB podem seguir duas rotas de extração: i) Biomassa com uma alta umidade (via base úmida); ii) Biomassa com uma baixa umidade (via base seca). 4.1 Extração Via Base Seca [103] A biomassa foi centrifugada e liofilizada num vácuo de 22 Pa e temperatura de -51 °C por 24 horas. A biomassa apresentou uma fração lipídica de 15% de acordo com a extração pelo método de (Bligh and Dyer 1959). A recuperação do solvente e lipídio foi realizada via rota-evaporador e quantificado gravimetricamente via balança analítica. A extração foi realizada por 2 rotas: Estratégia 1: A biomassa foi adicionada em um extrator tipo lixiviador chamado de “butter” para uma extração sólido:líquido:líquido (biomassa:!ipídio:solvente). As condições do experimento foram 6 horas de extração á 80°C, com reciclo do hexano. Foi carregada uma massa de 7,37 g de biomassa total seca e 133,40 gramas de hexano no extrator “butter”. A recuperação de lipídios foi de 30% e de hexano 64%.

Estratégia 2: A biomassa foi adicionada em um extrator chamado de “soxhlef para uma extração sólida:líquido:!íquido (biomassa:!ipídio:solvente). As condições do experimento foram 12 horas de extração á 80°C, com reciclo de solvente. O solvente utilizado foi hexano. Foi carregada uma massa de 7,50 g de biomassa total seca e 389,32 gramas de hexano no extrator “soxhlef. Foi obtida uma recuperação de 31.5% do lipídio microbiológico sob essa estratégia. A recuperação do hexano foi de 66%. 4.2Extração via Base úmida [104] Após o término da fermentação, a biomassa apresentou uma fração lipídica de 15% de acordo com a extração pelo método de (Bligh and Dyer 1959). A extração foi realizada por 2 rotas: Estratégia 1: A biomassa foi concentrada até 200 g Lr1 via centrifugação. A biomassa foi adicionada em um cartucho de celulose e, através de um extrator tipo “buttef foi realizada extração do lipídio microbiológico (biomassa: lipídioisolvente). As condições do experimento foram 8 horas de extração á 80°C, com reciclo de solvente. O solvente utilizado foi hexano. Foram carregados 6,5 g de vinho levedurado e 133,7 gramas de hexano no extrator “butter”. Foi obtida uma recuperação de 12,42% do lipídio microbiológico e a recuperação do hexano foi de 56%.

Estratégia 2: Conforme Figura 4, as leveduras do cultivo foram inativadas e lisadas via adição de ácido clorídrico na proporção biomassa:ácido de 2:1 (m/m) à temperatura de 120°C por 30 minutos, em um reator. A micela (biomassa: lipídios) foi concentrada até 100 g L~1 via flotação, em um separador. Foram carregadas 0,150 g de biomassa lisada concentrada (100 gL'1) e 6 mL do solvente hexano, no extrator, e a mistura foi mantida sob agitação por 4 horas. Foi obtida uma recuperação de 100% do lipídio microbiológico sob essa estratégia e a recuperação do hexano foi de 78%.

[105] Nas mesmas condições outros dois ácidos, fosfórico e sulfúrico, foram testados (Figura 5). Nota-se que os resultados mais homogênios podem ser atribuídos ao ácido sulfúrico. Ainda, esse ácido, quando comparado aos outros compostos, é o de maior viabilidade econômica e, por esse motivo, é preferencialmente utilizado no processo e sistemas reivindicados nessa invenção. 4.3 Caracterização [106] A composição dos ácidos graxos da levedura empregada na presente invenção foi determinada por analise de éster metílico de ácido graxo (FAMEs) após a transesterificação (Tabela 2).

[107] Os metil ésteres de cadeia longa foram obtidos via transesterificação direta da biomassa seca através de uma proporção solução ácida:biomassa seca de 150 (v/m) a 90°C durante 1 hora em tubos fechados e vedados com teflon. A solução ácida é formada por metanol, ácido clorídrico e clorofórmio, na proporção (v/v) de 10:1:1, respectivamente. Os ésteres produzidos foram extraídos com uma solução de solventes na proporção solução:biomassa seca de 100 (v/m) a 30°C e agitado por 1 minuto. A solução é formada por hexano e clorofórmio na proporção (v/v) de 4:1 , respectivamente. Foi adicionada uma fração de água destilada na solução heterogênea final numa proporção água: biomassa seca de 50 (v/m), seguido de uma agitação por 1 minuto e centrifugada a 2000 rpm por 10 minutos para uma completa separação das fases. A fase leve (hexano com metil ésteres) é separada, seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada com membrana de 0.45 pm.

[108] Nota-se que os ácidos graxos produzidos pelo processo da presente invenção, possuem aplicação para diversas áreas, uma vez que apresenta tipos de ácidos graxos bastante variados (palmítico, merístico, oleico, linoleico, entre outros citados na Tabela 2). No entanto, o uso preferencial dos ácidos graxos gerados pelo processo da presente invenção, é na produção de biocombustíveis, mais especificamente, biodiesel e combustível para aviação (“jet-fueF’).

[109] Tabela 2 - Composição de ácidos gráxos (m%) dos lipídios R. toluroides (RTO), R. glutinis (RGO), L. starkey (LSO), R. minuta (RMO) e óleo de soja (SOB).

[110]Os exemplos aqui mencionados não possuem intuito de restringir o escopo da invenção, mas de enriquecer o conteúdo técnico do presente pedido.

Reivindicações Processo e Sistema de Produção Microbiana de Lipídios Com Recuperação e Seus Usos

Claims (12)

1. Processo de produção microbiana de lipídios, caracterizado pelo microrganismo ser Rhodosporídium toruloides CCT 0783 e apresentar as etapas de: a) Crescimento das células, em que a concentração inicial de açúcares advindos de fontes de carbono complexas ricas em açúcares, é de 15 a 70 gL-1; b) Acúmulo de lipídios, em que a concentração inicial de açúcares advindos de fontes de carbono complexas ricas em açúcares, preferencialmente suplementada por adição de fonte de carbono, é de 15 a 60 g L'1; c) Recuperação das células, que compreende lise das células, preferencialmente por solução ácida, e extração dos lipídios celulares, preferencialmente por um solvente que compreende um coeficiente de partição entre 0 e 5.

2. Processo de produção microbiana de lipídios, caracterizado pelo microrganismo ser Rhodosporidium toruloides CCT 0783 e apresentar as etapas de: a) Crescimento das células, em que a concentração inicial de açúcares advindos de fontes de carbono complexas ricas em açúcares é de 15 a 70 g L"1 e proporção C:N é de 6 à 28; b) Acúmulo de lipídios, em que a concentração inicial de açúcares advindos de fontes de carbono complexas ricas em açúcares, preferencialmente suplementada por adição de fonte de carbono quando a concentração de nitrogênio inorgânico é menor que 0,1 g L'1, é de 15 a 60 g L'1 e proporção C:N é de 20 à 80, c) Recuperação das células, que compreende lise das células, preferencialmente por solução ácida, e extração dos lipídios celulares, preferencialmente por um solvente que compreende um coeficiente de partição entre 0 e 5.

3. Processo, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelas fontes de carbono complexas ricas em açúcares da etapa a) e b), serem preferencialmente melaços.

4. Processo, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo inoculo, da etapa a) e b), compreender fonte de carbono, preferencialmente glicose, fonte de nitrogênio e fontes de micro e macronutrientes, preferencialmente KH2PO4, Na2HPC>4, Mg2S04.7H20, NaCI, CaCI2, preferencialmente em pH entre 5,5 e 5,8, preferencialmente 5,8.

5. Processo, de acordo com reivindicação 4, caracterizado pela fonte de nitrogênio ser preferencialmente (NhU^SCu ou solução aquosa de amônia.

6. Processo, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela solução ácida da etapa c), ser constituída de um ácido forte, preferencialmente selecionado dentre ácido clorídrico, sulfúrico, fosfórico ou mistura dos mesmos, e o solvente de dita etapa, ser preferencialmente selecionado dentre hexano, ciclohexano, éter de petróleo, éter etílico ou mistura dos mesmos.

7. Processo, de acordo com reivindicação 6, caracterizado por na etapa c) a lise celular ocorrer preferencialmente a 30°C por 4 h e compreender proporção biomassa: H2SO4 de 1 à 5; e extração por solvente ocorrer preferencialmente a 120°C por 30 min e compreender proporção solvente.biomassa de 50:1 (m/m) à 30:1 (m/m).

8. Sistema de produção microbiana de lipídios, caracterizado por compreender tanque de armazenagem da fonte de substrato (1) em que, preferencialmente após o tanque (1), encontra-se um esterilizador (6) e um trocador de calor (7); biorreator(es) (2) ou (3) e (4), preferencialmente (3) e (4); e unidade de recuperação das células e produto (5), que compreende reator de lise celular (5a), separador sólido/líquido (5b) e extrator (5c) e, em sequência ao extrator (5c), se encontrar um recuperador de solvente (5.1e), filtro (5.2.1e) e secador (5.2.2e).

9. Sistema, de acordo com reivindicação 8, caracterizado por separador solido/líquido (5b), ser preferencialmente um flotador; 0 extrator (5c), ser preferencialmente um reator agitado; preferencialmente após o extrator (5c), se encontrar um separador liquido:sólido:liquido (5d), preferencialmente uma centrífuga; e recuperador de solvente (5.1e), ser preferencialmente um evaporador;

10. Sistema de produção microbiana de lipídios, caracterizado pelo microrganismo ser Rhodosporidium toruloides CCT 0783 e por compreender tanque de armazenagem (1) da fonte complexa rica em açúcares, preferencialmente melaço, em que, preferencialmente após o tanque (1), encontra-se um esterilizador (6) e um trocador de calor (7); biorreator (3), onde ocorre adição da fonte de nitrogênio e carbono para atingir concentração inicial de açúcares de 15 à 70 g L"1 e proporção C:N de 6 à 28; biorreator (4), onde ocorre adição de fonte de carbono quando a concentração de nitrogênio inorgânico é menor que 0.1 g L"1, para atingir concentração inicial de açúcares de até 60 g L1 e proporção C:N de 20 à 80; e unidade de recuperação das células e produto (5), que compreende reator de lise celular (5a), separador sólido/ltquido (5b) e extrator (5c) e, em sequência ao extrator (5c), se encontrar um separador liquido:solido:!iquido (5d), um recuperador de solvente (5.1 e), filtro (5.2.1e) e secador (5.2.2e), em que a concentração da biomassa em meio fermentativo para até 200 g L"1, ocorre no separador sólido/líquido (5b), a adição de uma solução de lise celular, preferencialmente uma solução ácida na proporção biomassa:ácido de 1:5, ocorre no reator (5a), e a adição do solvente, preferencialmente um solvente com coeficiente de partição entre 0 e 5, na proporção solvente.biomassa entre 50:1 à 30:1, ocorre no extrator (5c).

11. Sistema de produção, de acordo com reivindicação 10, caracterizado pelo separador solido/líquido (5b) ser preferencialmente um flotador; extrator (5c), ser preferencialmente um reator agitado; e recuperador de solvente (5.1e), ser preferencialmente um evaporador.

12. Produto obtido pelo processo da reivindicação 1 ou 2 ou 8 ou 10, caracterizado por ser preferencialmente utilizado em um processo de produção de biocombustíveis, preferencialmente biodiesel e combustíveis para aviação.