BRPI0804115A2

BRPI0804115A2 - processo para a produção de biodiesel e/ou óleo combustìvel

Info

Publication number: BRPI0804115A2
Authority: BR
Inventors: Neto Dolivar Coraucci
Original assignee: Ouro Fino Participacoes E Empreendimentos Sa
Priority date: 2008-05-02
Filing date: 2008-05-02
Publication date: 2010-01-12
Also published as: PA8807101A1; CO6140030A1; BRPI0804115B1; PE20100287A1

Abstract

PROCESSO PARA A PRODUçãO DE BIODIESEL E/OU óLEO COMBUSTìVEL. A presente invenção trata de um processo para a produção de biodiesel e/ou óleo combustível a partir de biomassa microbiana oleaginosa e/ou algal e/ou de derivados e resíduos da cana de açúcar. Os produtos objeto da presente invenção são adequados para uso direto em motores e na geração de energia ou vapor. O processo integrado segundo a presente invenção compreende a utilização, como matéria prima, biomassa microbiana oleaginosa obtida a partir de derivados e resíduos da cana de açúcar, a qual é integrada com biomassa algal e/ou com glicerol e são processadas através de etapas de produção de biomassa microbiana oleaginosa de leveduras e/ou fungos filamentosos, etapas de produção simultânea de biomassa algal pelo aproveitamento integral dos resíduos, CO~ 2~ e caldo residual da referida produção de biomassa microbiana, bem como etapas de extração e transesterificação dos lipídios contidos biomassa, com reutilização do glicerol residual produzido. O processo descrito trata-se de tecnologia inovadora, ecologicamente sustentável, que não gera qualquer tipo de resíduo, proporcionando ainda a vantagem de liberar importantes volumes de oxigênio na atmosfera.

Description

"PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OU ÓLEOCOMBUSTÍVEL"

Campo da Invenção

A presente invenção trata de um processo para a produção debiodiesel e/ou óleo combustível a partir de biomassa microbiana oleaginosae/ou algal e/ou de derivados e resíduos da cana de açúcar. Os produtos objetoda presente invenção são adequados para uso direto em motores e na geraçãode energia ou vapor.

Histórico da Invenção

Com as previsões atuais de que as reservas de petróleo estarãoextintas nas próximas décadas, outras fontes de energias têm sidopesquisadas em todo mundo. Dentre essas alternativas, os biocombustíveis,tais como etanol e biodiesel, apresentam um potencial significativo, por seremformas de energias pouco poluentes e ao mesmo tempo renováveis.

No caso específico do biodiesel, em produção de grandesescalas, as tecnologias têm sido desenvolvidas a partir de matérias primasricas em lipídios e ácidos graxos de origem vegetal e animal.Desafortunadamente os lipídios e gorduras derivados de plantas e de animais,produzidos em todo mundo, atendem apenas a demanda de consumo paraprodução de alimentos e para a indústria óleo-química. Desta forma, é deextrema importância a busca de outras fontes alternativas de produção delipídios e ácidos graxos para uso na produção de biodiesel e óleo combustível.A síntese de lipídios e gorduras por via microbiana apresenta-se comoalternativa tecnológica para essa finalidade.

Três são as principais vantagens de produção de lipídios pormicrorganismos. A primeira, é a grande rapidez de geração, ou seja, abiomassa microbiana dobra em um intervalo de horas, leveduras produzemuma nova geração entre uma e três horas, algas entre duas e seis horas efungos de quatro a doze horas. A segunda, é a necessidade de menor área deprodução para uma mesma massa de material graxo, ou seja, é possívelproduzir em um fermentador a mesma quantidade de lipídios em muito menostempo e em área até trinta vezes inferior àquela utilizada em plantios devegetais. E a terceira, é a possibilidade de se ter um melhor controle doprocesso de produção e do produto, ou seja, o controle dos biorreatores, oufermentadores, é muito mais simples do que o controle de uma lavouraagrícola, além de não dependerem de variações climáticas e/ou sazonáveis.

Nem todos os microrganismos acumulam lipídios em quantidadesuficiente para viabilizar a sua produção em escala econômica e industrial. Osmicrorganismos considerados oleaginosos aqueles que podem acumular maisde 20% de lipídios em sua biomassa seca. Os fundamentos básicos dafisiologia para acumulação de lipídios por microrganismos têm sido estudadospor vários pesquisadores ao redor do mundo.

As leveduras podem ser citadas como um dos grupos demicrorganismos mais interessantes, por sua capacidade de acumular grandesquantidades de lipídios ao nível intracelular, bem como pelas suas taxas decrescimento relativamente altas e sua semelhança na composição dostriglicerídios com a dos óleos vegetais.

Em alguns casos, esses microorganismos podem acumular até70% de seu peso seco em lipídios, sendo que os principais triglicerídiosformados são de cadeias entre 16 e 18 átomos de carbono.

Durante a Segunda Guerra Mundial, com a escassez de lipídiosde origem vegetal, o cultivo de leveduras possibilitou a fabricação de óleos eseus derivados, como margarinas e outros produtos. Na indústria cosméticaatual, ácidos graxos de alto valor comercial são usados como emulsificantes eestabilizantes. Esses lipídios podem igualmente ser sintetizados por viamicrobiana.As algas representam outra fonte importante de lipídios, sãoigualmente capazes de acumular concentrações de até 65% em relação aopeso de sua biomassa seca. Elas podem ser classificadas como organismosfotossintéticos, como as plantas, pois utilizam energia solar para, juntamentecom água e dióxido de carbono, gerar biomassa. Dentro dessa classificação, apresente invenção tem também como objetivo a utilização de organismosfotossintéticos que crescem em ambiente aquático, ou seja, macroalgas,microalgas e outros organismos aquáticos para produção de produtos deinteresse comercial, em particular lipídios para produção de biodiesel e óleocombustível.

Macroalgas são plantas de crescimento acelerado e alcançamtamanhos consideráveis, em torno de 50m de comprimento. Já as microalgas,como o próprio nome sugere, são organismos fotossintéticos microscópicosencontrados em ambientes marinhos e de água doce.

O estudo das microalgas ainda é relativamente pouco conhecidoe as algas como um todo são organismos ainda muito pouco compreendidos eempregados em termos biotecnológicos. As microalgas são divididas em umavariedade de classes, de acordo com seus pigmentos, ciclo de vida e estruturacelular básica. As quatro classes mais importantes de microalgas em termos deabundância são Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Cyanophyceae eChrysophyceae. Elas são as formas mais primitivas de plantas, possuemmecanismo fotossintético similar àquele das plantas superiores, entretanto,convertem a energia solar em outras formas mais eficientes, devido a suaestrutura celular simples. Além disso, como as células crescem em suspensãoaquosa, elas possuem mais acesso à água, dióxido de carbono e outrosnutrientes. Por esses motivos, as microalgas são capazes de produzir trintavezes ou mais a quantidade de óleo por unidade de área plantada, quandocomparada aos grãos de oleaginosas.Pode-se afirmar, portanto, que as microalgas formam um grupoheterogêneo, o qual engloba microrganismos fotossintetizantes tantoeucarióticos quanto procarióticos. As microalgas são geralmente unicelulares,Gram-negativas e vivem predominantemente em ambiente aquático.

A grande eficiência fotossintética desses microrganismos faz comque eles formem a base da cadeia alimentar nos ecossistemas aquáticos,sendo responsáveis por cerca de 40-50% da fixação de carbono e da produçãode oxigênio do planeta. Além disso, as microalgas sintetizam matéria orgânicaa partir de substratos inorgânicos como sais, dióxido de carbono e água.

A partir desse conhecimento, a produção de lipídios por viamicrobiana surge como uma alternativa viável e inovadora na concorrência coma produção de óleos e gorduras de origem vegetal e/ou animal. Osmicrorganismos, como seres vivos mais simples que plantas e animais,poderão ser utilizados de maneira econômica em larga ou pequena escala naprodução de biodiesel ou na geração de combustíveis energéticos, bem comona produção de outros produtos.

Descrição Resumida da Invenção

É, portanto, objetivo da presente invenção, prover um processoindustrial que possa integrar as diversas fontes de matéria prima para aprodução de biodiesel e/ou óleo combustível, como uma alternativaconsiderável aos combustíveis fósseis atuais.

Os produtos, lipídios de origem microbiana e/ou algal, objeto dapresente invenção não são poluentes e são obtidos de fontes renováveis,compreendendo derivados e resíduos da cana de açúcar tais como caldo,melaço, açúcar refinado e/ou integral, açúcares provenientes da hidrólise dasfolhas e/ou bagaço, os efluentes líquidos residuais provenientes da produçãode biomassa microbiana e o dióxido de carbono, além do glicerol, subprodutoproveniente da produção de biodiesel. Todos esses substratos podem serutilizados de forma isoladas ou de qualquer forma integrados em um mesmoprocesso ecologicamente adequado e inovador.

As figuras ilustrativas, em anexo, detalham as características doprocesso de produção de biodiesel e/ou óleo combustível segundo a presenteinvenção, sendo que:

- A Figura 1 ilustra um fluxograma geral do processo integrado segundo apresente invenção;

- A Figura 2 ilustra um fluxograma das etapas de pré-tratamento e hidrólise debagaço de cana de açúcar;

- A Figura 3 ilustra um fluxograma da unidade de produção de biomassamicrobiana oleaginosa;

- A Figura 4 ilustra o perfil da evolução cinética dos principais parâmetros daprodução de biomassa microbiana oleaginosa;

- A Figura 5 ilustra um fluxograma das unidades de cultivo e recuperação debiomassa algal;

- A Figura 6 ilustra um fluxograma da etapa de extração de lipídios e liquefaçãodireta de biomassa microbiana oleaginosa e biomassa algal;

- A Figura 7 ilustra um fluxograma da etapa de transesterificação de lipídios; e

- A Figura 8 ilustra um fluxograma de utilização alternativa de lipídios.

Descrição Detalhada da Invenção

Como ilustrado na Figura 1, em acordo com a presente invenção,o processo para a produção de biodiesel e/ou óleo combustível a partir dabiomassa microbiana oleaginosa e/ou algal obtida dos derivados e resíduos dacana de açúcar, em sua forma integrada, compreende sete unidades deprocessamento, as quais englobam as etapas de produção e extração delipídios microbianos e algal, a etapa da produção de biomassa microbianaoleaginosa de leveduras e/ou fungos filamentosos obtidos a partir dosderivados e resíduos de cana de açúcar, bem como a etapa da produção debiodiesel e reutilização do glicerol proveniente da unidade de transesterificaçãodos lipídios. A biomassa algal é produzida concomitantemente através doaproveitamento integral dos resíduos, CO2 e caldo residual, efluente liquido daprodução de biomassa microbiana. Essas unidades básicas compreendem:

Um conjunto de Processamento do Bagaço de Cana de Açúcar(Unidade 1);

Um conjunto de Produção de Biomassa Microbiana a Partir deDerivados da Cana de Açúcar, Bagaço de Cana de Açúcar Hidrolisado eGlicerol (Unidade 2);

Um conjunto de Processamento da Biomassa Microbiana Oleaginosa(Unidade 3);

Um conjunto de Cultivo e Recuperação de Biomassa Algal (Unidade 4);

Um conjunto de Extração e Liquefação Direta Térmica de LipídiosMicrobiano e/ou Algal (Unidade 5);

Um conjunto de Transesterificação de Lipídios (Unidade 6); e

Um conjunto de Processamento para Utilização do Óleo CombustívelObtido por Liquefação Direta Termopressurizada para Geração de Calor e/ouVapor e Aplicação como Adjuvante ao Petróleo (Unidade 7).

O processo segundo a presente invenção será a seguir descritoatravés da seqüência operacional de processamento das diversas fontes dematérias primas para a produção de biodiesel e/ou óleo combustível. Oprocessamento descrito foi realizado em instalações de estudos e análises emcondições laboratoriais. Assim sendo, as diversas etapas do processo dainvenção compreendem:

1a Etapa - Hidrólise Ácida do Bagaço de Cana de Açúcar

Na Unidade 1 - Processamento do Bagaço de Cana de Açúcar,conforme ilustrado no fluxograma da Figura 2, o bagaço de cana de açúcarresultante da extração do caldo, que é um resíduo lignocelulósico produzido emgrandes volumes, em média 150 kg/ton de cana moída, é reutilizado apóshidrólise como fonte de carbono no processo de produção de biomassamicrobiana oleaginosa de leveduras e/ou fungos filamentosos. Com essafinalidade, o bagaço de cana de açúcar passa por duas etapas básicasfundamentais, o pré-tratamento e a hidrólise.

Pré-tratamento do Bagaço de Cana de AçúcarO pré-tratamento do bagaço de cana de açúcar é requerido paraalterar o tamanho e a estrutura das fibras lignocelulósicas, micro emacroscopicamente, bem como para alterar a composição química e estruturasub-microscópica das mesmas, para que a hidrólise da fração de carboidratosem açúcares monoméricos possa ser alcançada mais rapidamente e comrendimentos mais elevados. Os objetivos do pré-tratamento são a remoção dalignina e hemicelulose, redução da cristalinidade da celulose e o aumento daporosidade dos materiais. Um bom pré-tratamento melhora a formação deaçúcares ou a habilidade de formação destes através da hidrólise enzimática,assim como evita a degradação ou perda de carboidratos e a formação desubprodutos que possam inibir as reações subseqüentes de hidrólise eformação da biomassa microbiana oleaginosa. O pré-tratamento empregado noprocesso da presente invenção pode ser realizado por meios físicos, tais comoa trituração mecânica ou moagem, ou por meios físico-químicos, químicos,biológicos ou suas combinações.

Segundo a presente invenção, os meios físicos de pré-tratamentosão preferidos, mais preferencialmente a trituração mecânica que é umacombinação de corte, trituração e moagem do bagaço. O bagaço de cana deaçúcar seco é moído em um triturador de facas, tal como o de marca SadrindK8/25. Na seqüência, esse material é peneirado, sendo a fração contendopartículas entre 0,1-0,8 mm encaminhada para a etapa de hidrólise ácida. Natrituração mecânica podem ser utilizados igualmente outros tipos deequipamentos, tais como moinhos de cesto vibratório, moinhos de bola,triturador de martelos, triturador de rolos, amassadores ou qualquer outroequipamento visando sempre a redução das partículas do bagaço, folhas eaparas de cana de açúcar para facilitar a hidrólise desse material celulósico.

Dentre os pré-tratamentos físico-químicos que podem serutilizados igualmente no processo da presente invenção, se faz referência àexplosão a vapor, a explosão com fibra de amônia e a explosão com CO2. Naexplosão a vapor, o bagaço de cana de açúcar deve ser inicialmente moído,tratado com vapor saturado de alta pressão e submetido à redução brusca depressão. Esse procedimento geralmente ocorre entre 100-300°C e 0,43-5,57MPa, durante um período de tempo que pode variar de alguns segundos atévários minutos.

De forma semelhante, no pré-tratamento com amônia faz-se aexposição do bagaço de cana de açúcar à amônia líquida em alta temperaturae sob elevada pressão, seguida de queda abrupta da temperatura. Esseprocedimento utiliza em torno de 1-2 kg de amônia líquida / kg de bagaço decana de açúcar seco, a uma temperatura entre 60-120°C por um período dereação entre 10 e 60 minutos.

Já no caso da explosão a C02, utiliza-se em torno de 2-5 kg deC02 / kg de bagaço de cana de açúcar, a pressões em torno de 5,62 MPa, porum período de tempo similar às outras duas técnicas.

Ainda, segundo a presente invenção, um pré-tratamento químicodo bagaço de cana de açúcar pode ser feito por ozonólise, hidrólise ácida,hidrólise alcalina e deslignificação alcalina, dentre outros.

A ozonólise consiste em degradar a lignina e a hemiceluloseutilizando-se para tanto o ozônio. A ozonólise é preferida por ser maisvantajosa, pois não produz resíduos tóxicos, as reações ocorrem à temperaturaambiente e remove lignina de forma muito eficiente. Já o pré-tratamentoquímico por via ácida pode utilizar, dentre outros, o ácido sulfúrico, ácidoclorídrico e ácido fosfórico, diluídos ou concentrados, em condições críticas depressão e temperatura ou não e de modo contínuo ou em batelada. Essatécnica, no entanto, requer uma etapa de neutralização para que o materialpossa ser utilizado na produção da biomassa microbiana oleaginosa. Por seuturno, o pré-tratamento químico por via alcalina possui as mesmas variáveisdaquele por hidrólise ácida, porém utiliza hidróxido de sódio, amônia ou outroscompostos alcalinos em concentrações variando de cerca de 2 a 30%. Alémdesses três métodos químicos aqui citados, há ainda a possibilidade de serealizar a deslignificação oxidativa do bagaço de cana de açúcar através daexposição deste ao peróxido de hidrogênio em concentrações de 1 a 5% e emtemperaturas entre 20-50°C durante um período de tempo de 5 a 30 minutos.

Adicionalmente, existe ainda a possibilidade de se realizar o pré-tratamento do bagaço de cana de açúcar através de procedimentos biológicos.

Para tanto, são utilizados microrganismos, tais como fungos basidiomicetos(brown-, white- and soft-rot fungi), capazes de degradar lignina e hemicelulose.

Todos os pré-tratamentos do bagaço de cana de açúcar acimacitados estão incorporados no âmbito da presente invenção.

Seguindo-se o pré-tratamento, é efetuada a hidrólise do bagaçode cana de açúcar, através dos quais os polímeros de carboidratos sãoconvertidos em açúcares monoméricos. A celulose pode ser rompidahidroliticamente a glicose tanto via enzimática, através da ação de celulases,quanto quimicamente, através da ação de ácidos. Após a hidrólise, os açúcaresde seis carbonos, também chamados hexoses (glicose, galactose e manose),são prontamente fermentados, enquanto que as pentoses (xilose e arabinose)são fermentadas apenas por algumas poucas cepas ou linhagens demicrorganismos. A hidrólise química pode ser realizada através do uso deácido, diluído ou concentrado, tais como ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácidofosfórico e/ou outros ácidos, com concentrações variando de 2-80%, atemperaturas variando de 25-150°C, durante um período de reação variando dealguns minutos a diversas horas, com ou sem sistemas de recuperação ouneutralização de ácidos.

Também, de acordo com a presente invenção, a hidróliseenzimática do bagaço de cana de açúcar é realizada utilizando-se enzimasaltamente específicas, denominadas celulases. Esse método empregacondições muito mais brandas quando comparado à hidrólise ácida, ocorrendoem faixas de pH em torno de 4,5 e em temperaturas variando de 25-60°C. Ascelulases são geralmente uma mistura de diversas enzimas, sendo que noprocesso de acordo com a presente invenção prefere-se o uso deendoglucanases (EC 3.2.1.4), exoglucanases (EC 3.2.1.91) e/ou B-glucosidases (EC 3.2.1.21). Segundo a presente invenção, a hidrólise pode serrealizada com substratos concentrados ou não, com concentrações decelulases variando de 5 a 40 FPU/g de substrato, tempo de reação variando de24-96 horas e utilizando enzimas imobilizadas ou não.

Por se considerada mais vantajosa e econômica, a hidrólise ácidaé preferida, conforme os resultados práticos obtidos em condições otimizadas.Hidrólise Ácida do Bagaço de Cana de Açúcar

Conforme ilustrado na Figura 2, o bagaço da cana de açúcar secoe moído, com partículas entre 0,1-0,8mm é hidrolisado em um reator de açoInox AISI 316 com capacidade de 10 litros a 125 °C, por 20 minutos, utilizando1 kg de matéria seca para 120 gramas de H2S04 concentrado, com umarelação sólido liquido de 1:10.

Após hidrólise, a suspensão é centrifugada para remoção doresíduo sólido não hidrolisado, o qual é lavado com água para extração dosaçúcares remanescentes. O hidrolisado (sobrenadante) obtido é concentradoem cerca de seis vezes em evaporador rotatório a vácuo tal como o secadorBÜCHI R-215, a uma temperatura de cerca de 65 °C, como forma de aumentara concentração dos açúcares totais presentes no hidrolisado. O hidrolisadoconcentrado é então tratado para eliminar compostos tóxicos derivados dofurano, tais como furfural e hidroximetilfurfural, derivados da degradação dalignina, que são compostos fenólicos, e ácidos fracos tais como ácido acético,ácido fórmico e ácido levulínico, que são formados durante o processo dehidrolise ácida e atuam como substâncias inibidoras do crescimentomicrobiano, neste caso a levedura. O hidrolisado de bagaço de cana de açúcaré finalmente detoxificado segundo técnica descrita por Marton et al. (2003), aqual consiste em alterar o pH através da adição de oxido de cálcio comercial(CaO) até pH 7.0, seguida de uma acidificação com ácido fosfórico até pH 2,5 eposterior neutralização com oxido de cálcio (CaO). Em cada uma dessasetapas de alteração do pH são feitas remoções do precipitado por filtração. Naseqüência, o hidrolisado é misturado com carvão ativado granular numaproporção de 10 gramas de carvão para cada 1 litro de hidrolisado em umreator de aço Inox AISI 316, capacidade de 10 litros, contendo no seu interiorum sistema de agitação mecânica por pás. Os melhores resultados em termosda detoxificação do hidrolisado de bagaço de cana de açúcar foi alcançadoapós um tratamento por um tempo de cerca de 40 minutos, em temperaturasde cerca de 65 °C e com agitação de cerca de 245 rpm.

Os açúcares (glicose, xilose e arabinose) e o ácido acéticopresentes no hidrolisado concentrado foram identificados e quantificados emcromatógrafo liquido de alta eficiência (CLAE) da marca Shimadzu modelo LC-10 AD, detetor de índice de retração em coluna AMINEX HPX-87H da Bio-Radutilizando H2SO4 5 mM como fase móvel, 60 °C como temperatura do fornodetetor de índice de refração. As amostras foram centrifugadas a 4.500 rpmdurante 15 minutos, diluídas com água ultra pura e filtradas em membrana deéster de celulose com porosidade de 0,22 um. A concentração de fenóis totaisfoi feita pelo método de Singleton et al (1999) utilizando reagente de FolinCiocalteau. Na Tabela 1 é apresentada a composição química do hidrolisadode bagaço de cana de açúcar após tratamento para sua detoxificaçãoutilizando carvão vegetal ativado e alteração do pH. A xilose se constitui noprincipal carboidrato, responde por aproximadamente 87% dos açúcarespresentes no hidrolisado de bagaço de cana de açúcar concentrado edetoxificado. O pré-tratamento para detoxificação do hidrolisado de bagaço decana de açúcar reduziu em cerca de 17,41% a concentração de xilose emrelação a seu valor inicial. No caso dos compostos tóxicos fenólicos essaredução foi de cerca de 88,85%, já no caso do ácido acético esta foi de cercade 63,73%.

Tabela 1. Composição química do hidrolisado de bagaço de cana de açúcar

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1= antes da detoxificação ; 2= depois da detoxificação

2a Etapa - Produção de Biomassa Microbiana de Levedura Oleaginosa

Na Unidade 2 - Produção de Biomassa Microbiana, conformeilustrada na Figura 3, as matérias primas básicas utilizadas são os derivadosda cana de açúcar, tais como o caldo, melaço, açúcar mascavo e/ou refinado,bagaço de cana de açúcar hidrolisado concentrado e detoxificado (BHCD),glicerol e/ou suas misturas. Nessa etapa, de acordo com a presente invenção,realiza-se:

Isolamento e Identificação da Cepa de Levedura

A levedura oleaginosa, Rhodosporidium toruloides OF A25 foiisolada do solo em uma plantação de cana de açúcar no Estado do Paraná -Brasil e identificada através de suas características morfológicas epropriedades fisiológicas, metabolismo bioquímico, assim como por técnicas debiologia moleculares. A cepa R. toruloides OF A25 foi selecionada por suahabilidade em acumular triacylglicerol (TAG) em sua biomassa quandocultivada em meios ricos em fontes de carbono, tais como sacorose e xilose,derivadas de melaço, hidrolisado de bagaço de cana de açúcar e glicerol,porém pobre em fontes de nitrogênio. A cepa R. toruloides OF A25 foiconservada por liofilização em freezer, em temperatura de cerca de 80 °C esub-cultivada em caldo e agar YM (Yeast Médium).Crescimento de R. toruloides OF A25 em Diferentes Fontes de CarbonoEsse experimento teve por base a utilização dos diferentesresíduos provenientes da industrialização da cana de açúcar. O melaço decana de açúcar (MCA) é um licor viscoso escuro, rico em açúcares nãocristalizáveis gerado durante a fabricação do açúcar. Sua composição ébastante variável, pois depende de fatores agrícolas e industriais tais como avariedade da cana de açúcar, o grau de maturação e as condições climáticas,dentre outras. Os principais componentes do melaço são água, carboidratos ecompostos de origem orgânica como os aminoácidos, ácidos carboxílicosalifáticos e olefínicos, vitaminas, proteínas e fenóis, dentre outros. O melaçocontém também uma fração de origem mineral de grande importância nosquais estão presentes metais e não metais em proporções significativas. NaTabela 2 abaixo é apresentada a composição média do melaço de cana deaçúcar utilizado no processo da presente invenção conforme aqui descrito, oqual foi adquirido na empresa Jardest S.A. Açúcar e Álcool, Via Anhanguerakm 340 - Jardinópolis - SP, Brasil. A sacarose é o açúcar predominante,responde por cerca de 80% dos açúcares presentes. A presente invençãoprevê igualmente o uso do caldo de cana de açúcar, no qual embora asacarose apareça como açúcar predominante, sua concentração é inferioràquela encontrada no melaço.

Tabela 2 - Composição físico-química do melaço de cana de açúcar

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Como já relatado anteriormente, a presente invenção prevê autilização do glicerol isolado e/ou em associação com melaço e/ou caldo decana de cana de açúcar e/ou hidrolisado de bagaço de cana de açúcar comofonte de carbono para produção da biomassa oleaginosa de Rhodosporidiumtoruloides OF A25. O glicerol se constitui num subproduto, resíduo do processode transesterificação dos lipídios, neste caso triacilgliceróis (TAG), durante afabricação do biodiesel a partir de biomassa de levedura oleaginosa e/ou algal.A reciclagem integrada de todos esses resíduos é fator preponderante para ospropósitos da presente invenção.

Preparo do Inóculo

Para o preparo do inóculo, a cepa Rhodosporidium toruloides OFA25 foi descongelada, repicada em meio YM (Yeast Médium) sólido, esubmetida ao crescimento em estufa a cerca de 30°C durante 5 dias. Foitransferida em câmara de fluxo laminar para frascos Erlenmeyer de 500mlcontendo 100ml do meio liquido YM estéril. Esses frascos foram transferidospara uma incubadora de movimento rotatório New Brunswick Scientific Co., acerca de 30 °C, 150 rpm por um período de cerca de 72 horas. O meio liquidoYM é composto por glicose (10g/l), peptona (5,0 g/l), extrato de levedura (3,0g/l), extrato de malte (3,0 g/l), Agar (20 g/l) e com pH 5,0. A única diferençadesse meio com o YM sólido é a presença do Agar em uma concentração de20 g/l.

Produção de Biomassa da Levedura Oleaginosa Rhodosporidiumtorulóides of a25Frascos Erlenmeyer de 21 contendo 400 ml de diferentes meios decultivo estéril, conforme ilustrado na Tabela 3 (condições 1-15) abaixo foraminoculados com 10% v/v de uma cultura ativa e recém obtida deRhodosporidium toruloides OF A25, segundo descrito no item anterior, com pHajustado para cerca de 5,0 com HCI 1,0N. Os frascos foram então transferidospara uma incubadora de movimento rotatório New Brunswick Scientific Co. auma temperatura de cerca de 30 °C, 150 rpm, por cerca de 72 horas. Comofonte de carbono, foi utilizado o melaço de cana de açúcar (substrato rico emsacarose), hidrolisado de bagaço de cana de açúcar detoxificado econcentrado 6X (substrato rico em xilose), glicerol (sub-produto da produção debiodiesel) e suas associações. Segundo um aspecto da presente invenção, omelaço de cana de açúcar pode ser perfeitamente substituído pelo caldo decana de açúcar em função da disponibilidade, sazonalidade e por economia deprocesso. A concentração em termos de açúcares totais, presentes no melaçode cana de açúcar e hidrolisado de bagaço de cana de açúcar é determinadapelo método do fenol sulfúrico ou em cromatógrafo liquido de alta eficiência(CLAE) da marca Varian Pro Star, modelo 500, com módulo de distribuição desolvente modelo 240, forno modelo 500, detector de índice de retração modelo350, software Workstation 5.0, coluna de separação SZ 5532 Shodex, quesepara os componentes da amostra por tamanho molecular. As condições deanálise foram em fase móvel H20:acetonitrila (20:80), 1 ml/min, 65 °C, volumede injeção 15 Dl (capacidade do loop 5DI). A padronização das leituras deconcentração é feita com soluções aquosas de 1 a 20 g/l de padrão grauanalítico. As amostras são previamente centrifugadas (10.000g, 5 min) efiltradas em membranas PVDF hidrofílicas de 0,22 Dm (Millipore). No caso doglicerol, suas concentrações nos experimentos foram quantificadas por CLAE.Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Duas fontes denitrogênio foram selecionadas e utilizadas, especificamente extrato de levedurae uréia, ou suas combinações e misturas. Ressalta-se que outras fontes denitrogênio, de origem orgânica ou inorgânica, bem como concentraçõesvariadas poderão ser utilizadas, tendo por objetivo maximizar a produção e/ouacúmulo de lipídios na biomassa microbiana segundo a presente invenção.Após cultivo por cerca de 72 horas, os frascos foram retirados do incubador e abiomassa oleaginosa foi separada por filtração em papel de filtro quantitativo,sob vácuo. Após uma primeira filtração, a biomassa foi lavada duas vezes comágua destilada e seca em estufa a vácuo por cerca de 24 horas à cerca de 60°C e pesada em balança analítica. A concentração total de lipídios presente nabiomassa da levedura foi determinada por extração Soxhlet.

Tabela 3 - Produção de biomassa e lipídios por Rhodosporidium

<table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table>

A= Condição de Cultura; B= Melaço de cana (g/l); C= Hidrolisado de bagaço decana detoxificado concentrado 6X (g/l); D= Glicerol (g/l); E= Extrato de levedura(g/l); F= Uréia (g/l); G= Biomassa (g/l); H= Conteúdo lipídio (%)

Os resultados apresentados na Tabela 3 acima demonstram quea levedura Rhodosporidium toruloides OF A25 pode crescer e acumularelevadas concentrações de lipídios em meios contendo resíduos daindustrialização da cana de açúcar, tais como melaço, caldo e hidrolisado debagaço, assim como o glicerol, resíduo gerado durante a fabricação debiodiesel. A Condição de Cultura 3 é a que propiciou as melhores condições aocrescimento celular e acúmulo de lipídios. Como já ressaltado anteriormente, omelaço de cana de açúcar, além de ser rico em sacarose, possuí tambémaminoácidos, ácidos carboxílicos alifáticos e olefínicos, vitaminas, proteínas einúmeros minerais. Mesmo quando se substitui a fonte de nitrogênio de origemorgânica (como o extrato de levedura) por outra de origem fóssil (como auréia), a produção de biomassa seca foi elevada, cerca de 27,60 g/l, com umteor de lipídios da ordem de 31,03%, conforme Condição de Cultura 4. Essalevedura demonstrou ser também capaz de crescer e acumular lipídios quandocultivada em hidrolisado de bagaço de cana de açúcar concentrado edetoxificado (BHCD). Como já citado, esse hidrolisado é rico em xilose. Com apresença de extrato de levedura no meio contendo BHCD, a concentração debiomassa seca foi de cerca de 18,73 g/l, quando se utilizou uréia como fonte denitrogênio, essa concentração foi de 14,21 g/l, as concentrações de lipídios nabiomassa seca foram respectivamente 24,30% e 14,62%, conforme Condiçõesde Cultura 2 e 5. Rhodosporidium torulóides OF A25 demonstrou também serbastante eficiente na assimilação do glicerol quando utilizado como única fontede carbono no meio de cultura. A produção de biomassa seca foi de cerca de16,05 e 12,65 g/l de biomassa seca formada após 72 horas de cultura emshaker, tendo acumulado respectivamente 15,14% e 9,25% de lipídios quandoas fontes nitrogênio foram extrato de levedura e uréia, conforme mostram asCondições de Cultura 1 e 6.

Produção de biomassa da levedura oleaginosa Rhodosporidium

TORULÓIDES OF A25E/W BlORREATOR

Diferentes alíquotas de 20 ml do meio X (inóculo) preparadoconforme metodologia acima descrita, foram transferidas para frascosErlenmeyer estéreis de 21 e misturados em 180 ml do meio Y (adaptação)estéril. Essas composições estão descritas na Tabela 4 abaixo. Esses frascosforam incubados em agitador rotatório do tipo shaker a 30 °C, por cerca de 48horas, a 150 rpm. Após esse tempo, a levedura está perfeitamente adaptada eapresenta um crescimento vigoroso no novo meio. Esse crescimento eadaptação da levedura ao meio Y é avaliado através da retirada de amostras acada 6 horas e realizada contagem das células viáveis, previamente tingidascom eritrosina 1%, em câmara de Neubauer. O biorreator contendo um vasode cerca de 141 foi preenchido com 9.01 do meio de cultura Z. O vaso dobiorreator foi transferido para uma autoclave e o conjunto vaso + meio Z foiesterilizado a cerca de 120 °C por 15 min. Após resfriamento a temperatura de30 °C, esse meio foi inoculado com 11 de uma cultura ativa de cerca de 48horas do meio Y. A produção de biomassa da levedura oleaginosa embiorreator foi conduzida durante cerca de 72 horas, em um equipamento damarca New Brunswick Scientific, modelo Bioflo 110, volume total de 141,volume útil de 101, módulo de controle de pH e d02 com sonda de 02 MettlerToledo InPro 6800 Series 02 Sensors e sonda de pH Mettler Toledo 425mmmodelo 405 DPAS-SC-K85/425 e duas bombas peristálticas para adição deácido ou base, módulo de controle de nível e espuma, com duas sondascontrole e duas bombas peristálticas para adição de antiespumante e água,agitador mecânico com velocidade entre 100-1200rpm, eixo de agitação comduas hélices de Rushton (6 pás) de 74mm, rotâmetro para controle de aeraçãorange de 0 a 151/min e escala de 1 em 1. Os parâmetros da fermentação foramtemperatura de 30 °C, pH 5,0 controlado pela adição de ácido fosfórico 5%e/ou hidróxido de sódio 3 normal, d02 30%, velocidade entre 100-1200rpm,controle automático conforme a saturação de oxigênio e variação de 1vvm (5-101/min conforme volume de meio.

Tabela 4 Meios utilizados para produção de biomassa oleaginosa no

<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>

Na Tabela 5 a seguir, e Figura 4, são apresentados a evoluçãodos principais parâmetros cinéticos, bem como rendimentos globais dessafermentação em biorreator. Os resultados obtidos demonstram que cerca de29,95% das fontes de carbono (Tabela 4, Meio Z) foram utilizados pelalevedura na produção de biomassa e cerca de 10,81% para produção delipídios. A biomassa total produzida em biorreator foi de cerca de 22,21%superiores aquela produzida em frascos Erlenmeyer em meio de cultura similar(Tabela 3, Condição Cultura 13), quanto ao acúmulo de lipídios na biomassa foicerca de 7,5% maior.

Tabela 5. Evolução dos principais parâmetros cinéticos no biorreator

<table>table see original document page 21</column></row><table>No processo de acordo com a presente invenção fica evidenciadaa possibilidade concreta de se empregar como substratos na produção debiomassa oleaginosa de levedura, os resíduos da industrialização da cana deaçúcar, tais como o melaço de cana de açúcar e hidrolisado de bagaço de canade açúcar concentrado e detoxificado, assim como o glicerol, resíduo datransesterificação dos triacilgliceróis durante a produção de biodiesel. Essesresíduos podem ser empregados de maneira isolada ou em combinações emdiversas proporções, juntamente com diferentes fontes de nitrogênio de origemorgânica ou inorgânica ou suas combinações, objetivando sempre altasconcentrações de biomassa contendo elevados teores em de lipídios, conformedemonstrados nos experimentos da presente invenção acima descritos.Valores superiores e/ou inferiores aos apresentados nesses exemplos deexperimentos poderão ser obtidos em função das condições físico-químicas,nutricionais, equipamentos, microrganismos, otimizações e melhorias quepossam ser aportadas ao processo da presente invenção.

A produção de biomassa microbiana oleaginosa, conforme apresente invenção, poderá ser realizada utilizando-se outros gêneros eespécies de leveduras e fungos filamentosos, modificados geneticamente ounão. De modo preferencial, os grupos de leveduras e fungos filamentosos sãocompostos por Cândida curvata, Cândida guilhermondi, Cândida tropicalis,Cândida sp., Cândida oleophila, Cândida lipolitica, Criptococcus terricolus,Hansenula saturnus. Hansenulla ciferrii, Lipomyces starkei, Rhodutoralagracilis, Aspergillus fischeri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans,Aspergillus ochrceus, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Cladosporiumfulvum, Cladosporium herbarum, Mucor miehei, Penicillium gladiololi,Penicillium javanicum, Penicilium lilacinum, Penicillium spinulosum,Peniciliumm ultimum, Criptococcus albidus, Lypomices starkeyi, Rhodotorulaglutinis, Trichosporon pullulans, Mortierrella hygrophila, M. zychae, M. elengata,M. parvispora, M. schmuckerí, M. alpina, Lypomyces lipofeer, Lipomycestetrasporus, Williopsis satumus, Cândida diddensiae, Yarrowia lipolitica,Trichosporon cutaneum, dentre outros, todos capazes de acumular lipídios emsua biomassa durante a fase de crescimento e pós-crescimento. Essesmicroorganismos são utilizados de maneira isolada ou em associações de doisou mais.

As referidas leveduras e fungos filamentosos podem sercultivadas em diferentes modelos de biorreator, dentre outros, do tipo tanqueagitado, coluna de bolhas, airlift, leito empacotado, leito fluidizado ou leitogotejante, operando em batelada, batelada alimentada ou de modo contínuo.Os meios de cultivo ilustrados nas Tabelas 3 e 4 poderão ser suplementadosou não com uma fonte mineral ou orgânica de nitrogênio, tal como amônia,sulfato de amônio, fosfato de amônio, farelo de soja, extrato de carne,hidrolisados protéicos de soja, além de KH2P04, K2S04, MgS04) ZnS04,CuS04, FeS04, outros minerais e oligoelementos. Durante a formação dabiomassa e o acúmulo de lipídios pelas células microbianas poderá serutilizado, nos biorreatores, uma relação carbono/nitrogênio variando de cercade 0,5 a 500, um pH variando de 2,5 a 8,5 e uma temperatura na faixa de 10 a50 °C. O meio de cultivo a base dos derivados da cana de açúcar, seushidrolisados de bagaço e glicerol, poderá ser ou não pasteurizado ouesterilizado pelo uso do calor como forma de eliminar a carga microbiananaturalmente presente, porém indesejável nas matérias primas. Caso se adotea prática da pasteurização ou esterilização, a temperatura poderá variar decerca de 62 a 142 °C, em um tempo de exposição térmica variando entrealguns segundos a algumas horas, em função da técnica utilizada. Os meiospoderão ser ainda tratados com antibióticos e antifúngicos para redução dacarga microbiana indesejável presente nos substratos. No caso do uso deantibióticos, os mesmos deverão ser de amplo espectro, ou seja, possuir açãocontra bactérias Gram (+) ou Gram(-). Após a pasteurização e/ou esterilização,os meios de cultura a base dos derivados da cana de açúcar serão resfriados atemperaturas que poderão variar de 15 a 50 °C. Os meios de culturadestinados a produção de biomassa microbiana e conseqüente produção delipídios serão inoculados com linhagens de leveduras e/ou fungos oleaginososselecionados e cultivados em biorretores de menor volume, com meio demesma e/ou diferente composição ao descrito anteriormente. É importante queesses inóculos possuam concentrações elevadas de células viáveis, superior àcerca de 103 UFC/cm3, podendo mesmo atingir valores da ordem de 1012UFC/cm3 ou mais. O volume de inóculo utilizado nos tanques de produçãopoderão variar de 1 a 99 % do volume de trabalho do biorreator de produção,dependendo sempre do sitema empregado, ou seja, batela, bateladaalimentada ou sistema contínuo. O meio de cultura no interior do biorreator teráuma temperatura controlada de 15 a 50 °C através de camisas ou serpentinasde aquecimento/resfriamento, na qual poderá circular água fria ou vapor. O pHno interior do biorreator será mantido na faixa de pH 2,5-8,5 em função dalinhagem microbiana empregada e será feito através do bombeamento de umasolução contendo ácido ou álcali concentrado. O meio de cultivo no interior dobiorreator poderá ser agitado mecanicamente ou não. No caso do uso deagitação, a mesma será feita por um sistema de pás a uma velocidade quepoderá variar de 5 a 500 rpm. O meio de cultivo para produção da biomassamicrobiana oleaginosa é aerado com um volume de ar na faixa de 0,1 a 5 v/v/m(volume de ar por volume de meio por minuto). Poderá ser utilizando apenasar, ou uma mistura ar/oxigênio ou apenas oxigênio. A injeção do ar no interiordos biorreatores será realizado por compressores e todo o ar será filtrado emfiltros com capacidade de retenção de partículas de até 0,2 um. O tempo decultivo para para produção de biomassa e acúmulo de lipídios será variável ena ordem de 24 horas a cerca de 150 horas, em função do gênero e espécie domicroorganismo, assim como do sistema de cultivo e do modelo de biorretorempregado, podendo ser de até semanas ou meses, no caso de cultura queopera em sistema contínuo.

A biomassa microbiana produzida na Unidade 2, pode atingirconcentrações variando de 15 a 130g/l, dependendo da técnica de culturaempregada, e a acumulação de lipídios pode chegar a concentrações de até65% ou mais em relação ao seu peso.

3a Etapa - Cultivo e Recuperação de Biomassa AlgalNa Unidade 4 - Cultivo e Recuperação de Biomassa Algal,integrada ao processo segundo a presente invenção, realiza-se o preparo docaldo, efluente liquido resultante da produção de biomassa oleaginosa dalevedura Rhodosporidium torulóides OF A25, para uso como substrato nocultivo de microalgas. A Figura 5 ilustra um fluxograma da integração daUnidade 4 ao processo da presente invenção, até aqui descrito.

No estudos de desenvolvimento do processo segundo a presenteinvenção, foi constatado que o caldo, efluente líquido proveniente da separaçãoda biomassa microbiana oleaginosa, quer seja produzido por levedura ou porfungos filamentosos, é um excelente substrato para o cultivo de microalgasoleaginosas ou não. No exemplo de experimento segundo a presente invenção,o caldo da produção de biomassa oleaginosa de Rhodosporidium torulóidesOF A25 produzida em biorreator foi utilizado para tal finalidade. Esse caldo, foianalisado quanto a sua composição físico-química e utilizado como substratono cultivo da microalga Botryococcus braunii OF C27 nos exemplos deexperimentos apresentados a seguir. O caldo, como demonstrado na Tabela 6a seguir, além de água, possui concentrações importantes de sais minerais ecomponentes orgânicos, tais como açúcar residual não consumido pelasleveduras, biomassa e fragmentos das células de leveduras, proteínassolúveis, etc. Portanto, por ser rico em matéria orgânica e minerais, dito caldopossui igualmente uma carga poluidora significativa, com valores de DBO(Demanda Bioquímica de Oxigênio) e DQO (Demanda Química de Oxigênio)superiores a cerca de 13.000 mg/l, o que é considerado muito alto em termosambientais.

Tabela 6 - Composição do Caldo Fermentado de Rhodosporidium

<table>table see original document page 26</column></row><table>*Analise realizada no CEPPA - Centro de Pesquisa e Processamento deAlimentos - UFPR

Como é de conhecimento geral da arte, as indústrias queproduzem fermento biológico (biomassa) para panificação ou para aditivos paraalimentação animal a base de leveduras do gênero Saccharomyces, além deoutros, também descartam esse mesmo tipo de resíduo líquido depois deseparada a biomassa. O único e tradicional destino desse resíduo são asestações de tratamento de efluentes industriais, nas quais são empregadossistemas de digestão aeróbica e anaeróbica como forma de redução da cargapoluente em termos de DBO e DQO.

Como alternativa ao descarte do caldo efluente proveniente daseparação da biomassa microbiana, o processo segundo a presente invençãoincorpora o referido caldo como meio de cultivo de algas, como forma deredução de carga poluente, bem como para produzir lipídios além deproporcionar a liberação de oxigênio, pelas ditas algas, para o meio ambiente.

Os elementos nutricionais presentes nesse caldo, em particularsais minerais, o tornam um excelente substrato para o cultivo de vários gruposde algas oleaginosas ou não, cujos rendimentos obtidos em termos debiomassa são compatíveis aos meios clássicos descritos na literaturainternacional. Observou-se, também, surpreendentemente, que esses efluenteslíquidos provenientes da filtração da biomassa de leveduras poderão serutilizados no cultivo de algas para produção não apenas de lipídios, mastambém de proteínas e outros produtos de interesse comercial.

Adaptação da microalga ao caldoForam realizados estudos prévios de adaptação da microalgaBotryococcus braunii OF C27 em misturas crescentes de 5, 10, 20, 30 até100% de caldo ao meio de cultura ESP, ilustrado na Tabela 7 abaixo. Essaadaptação foi feita em frascos Erlenmeyer de 250 ml, contendo 50 ml de meio.Os frascos foram transferidos para uma incubadora do tipo shaker, marcaTECNAL, modelo TE-421, contendo fotoperíodo, temperatura e agitaçãocontroladas. Os cultivos foram incubados por um período de cerca de 15 dias,nos quais foram mantidos constantes preferencialmente os seguintesparâmetros: temperatura 25 °C (± 2 °C), agitação de 110 rpm, 1500 Lux deintensidade de irradiação luminosa por períodos de 12 horas alternados com 12horas no escuro. A intensidade de luz no interior do incubador foi avaliadadiariamente, neste caso foi utilizado luximetro digital Minip MLM 101. Paraavaliação do crescimento algal foram coletadas amostras a cada 2 dias paraanálise por peso seco. A biomassa algal formada foi filtrada o vácuo em papelfiltro de 50um e em seguida lavada com água destilada e seca por 24 horas emestufa a 100°C, os resultados expressam a média de 2 determinações. Esseprocesso prévio de adaptação das microalgas ao caldo possibilitou a obtençãode resultados mais expressivos em termos de produtividade diária debiomassa, bem como, maiores taxas de redução de DBO e DQO, quandocomparado com um processo no qual a alga não passou por essa adaptaçãoprévia.

Tabela 7 - Composição do meio ESP utilizado no cultivo e adaptação

<table>table see original document page 28</column></row><table>Preparo do Inóculo

O inóculo para o cultivo da Botryococcus braunii OF C27 em caldopode ser realizado em diferentes modelos de frascos de vidros ou outromaterial transparente a luz. No experimento segundo a presente invenção foirealizado em frascos Erlenmeyer de 500 ml contendo 90 ml de caldo ou umamistura de caldo + água. Os frascos contendo esse meio podem ser ou nãoesterilizados. No caso do experimento da presente invenção não foi realizadaesterilização, sendo dito frasco inoculado com 10 ml de uma cultura ativa deBotryococcus braunii OF C27 adaptada em meio contendo ESP+caldo, demodo que a concentração inicial de biomassa algal atinja valores de no mínimoa 0,2 g/l. Processos similares poderão ser realizados empregandoconcentrações de biomassa algal superiores e/ou inferiores a essa, utilizando-se adaptação prévia da alga ao caldo ou não, porém o objetivo é sempre se terum inóculo vigoroso e de boa qualidade para atender as necessidades daetapa seguinte do cultivo algal em caldo. Os frascos são transferidos paraincubadora do tipo shaker e cultivados nas mesmas condições acima descritas.A biomassa algal obtida foi empregada para inocular os fotobiorreatorestubulares nas etapas seguintes.

Cultivo Botryococcus braunii OF C27 em concentrações crescentes decaldo

A microalga Botryococcus braunii OF C27 é cultivada em caldopuro ou diluído em água como único substrato do meio de cultivo. Osfotobiorreatores foram preenchidos com 1,81 de caldo não esterilizado,inoculados com uma cultura ativa de Botryococcus braunii OF C27 de formaque a concentração de biomassa algal no inicio do cultivo seja da ordem 0,2g/l. A agitação e aeração dos fotobiorreatores é realizada através de um fluxode ar atmosférico de 1 v/v/m (volume de ar por volume de meio), utilizando-secanículas de vidro com pedras porosas em sua extremidade como formamelhorar a difusão dos gases no meio líquido. Os experimentos são conduzidos em sala climatizada, com temperatura controlada na faixa de 30 °C (±2 °C) através de uso de um condicionador de ar. Nessa sala são instaladas duas estufas com fotoperíodos para controle de tempo ciclomático digital marca Full Gauge, modelo PROGS I com alimentação direta de 220 VCA, contendo doze lâmpadas fluorescentes 20 Watts luz do dia. A iluminância dos fotobiorreatores é de 1500 Lux fornecida pelas lâmpadas fluorescentes tipo luz do dia, por um período de 12 horas, alternados com 12 horas de ambienteescuro. O tempo de cultura é de cerca de 15 dias. O volume das culturas foi mantido constante pela reposição diária de água destilada para compensar as perdas por evaporação.

<table>table see original document page 30</column></row><table>

A biomassa algal formada foi filtrada a vácuo em papel filtro de 50 um e em seguida lavada com água destilada e seca por 24 horas em estufa a100°C. Os resultados expressam a média de 2 determinações para cadaexperimento. Observa-se na Tabela 8 acima que o melhor resultado em termosde biomassa algal produzida após 15 dias de cultivo foi obtido com 100% decaldo puro (6,17 g/l). Porém, observa-se que nessa condição a porcentagem delipídios presente na biomassa algal foi de 11,04%, valor inferior aos 19,07%obtido no experimento com caldo diluído em 75% de água. Entretanto, se oscálculos forem feitos em termos de produtividade dos lipídios por litro de meiode cultura utilizado, essa situação se inverte. Desta forma, observamos que aprodução de lipídios foi 0,68 g/l quando Botryococcus braunii OF C27 foicrescido em um meio contendo 100% de caldo, frente a 0,57 g/l quando omeio era composto por 25% de caldo + 75 % H20. A quantidade de biomassa elipídios produzidos pela microalga Botryococcus braunii OF C27 quandocultivada em caldo puro ou diluído foi superior em comparação ao meio (EPS-Solução nutritiva), referenciado na literatura como ideal para o cultivo dessaespécie de microalga (Tabela 8). Pelos resultados obtidos é possível concluirque o caldo residual proveniente do cultivo da levedura oleaginosa (Unidade 2)puro ou diluído, se constitui num excelente substrato para o cultivo damicroalga Botryococcus braunii OF C27 visando à produção complementar debiomassa e lipídios, segundo o processo integrado objeto da presenteinvenção.

Efeito do CQ2 no cultivo de Botryococcus braunii OF C27 em caldo

Na descrição acima é possível verificar que a produtividade deóleo em (g/l) é mais expressiva quando a microalga Botryococcus braunii OFC27 é cultivada em um meio contendo 100% de caldo. Assim, procurou-seavaliar o efeito do C02 na formação de biomassa e síntese de lipídio.Diferentes concentrações de C02 foram misturadas ao ar de alimentação dosfotobiorreatores tubulares durante o cultivo da Botryococcus braunii OF C27 emcaldo puro. O C02 proveniente de um cilindro de gás é conduzido a ummisturador de gases, o qual é alimentado concomitantemente com ar, de formaque os gases na saída do misturador apresentem concentrações de 5%, 10% e15% de C02. Os experimentos são conduzidos em bateladas de 15 (quinze)dias em fotobiorreatores tubulares de vidro com 52 cm de comprimento por 8cm de diâmetro, com volume total de 2 litros (1,8 litros de volume útil). Todosos cultivos foram mantidos em agitação constante proporcionada por um fluxode ar atmosférico filtrado de 1,0 v/v/m. Os cultivos foram iniciados com umaconcentração celular algal da ordem de 0,20 g/l e foram mantidos durante oexperimento sem correção ou ajuste de pH. Os volumes das culturas forammantidos constantes pela reposição diária da água perdida por evaporação. Ascondições de inoculação e incubação dos fotobiorreatores foram as mesmasempregadas acima. Todos os experimentos foram conduzidos em duplicata eos resultados expressam a média dessas determinações.Tabela 9 - Efeito da presença do CO? no crescimento de Botryococcus

brauniiOF C27 em caldo

Condição de Biomassa Algal Biomassa Algal %

cultura Inicial (g/l) Final (g/l) Lipídio

Ar 0,207 6,17±0,44 11,04

Ar + 5%C02 0,199 6,54±0,34 11,56

Ar+10%CO2 0,197 6,74± 0,27 11,87

Ar+15C02 0,205 6,68±0,53 12,79

Na Tabela 9 acima estão ilustrados os resultados obtidos.Constata-se que a adição de CO2 exerce um efeito positivo na produção dabiomassa e acúmulo de lipídios durante o cultivo da microalga de Botryococcusbraunii OF C27 em meio à base de caldo residual da produção de biomassa delevedura oleaginosa. Quando se comparam os cultivos nos quais C02 foimisturado ao ar, com aquele que recebeu apenas ar atmosférico, percebe-seque a maior concentração em termos de biomassa algal e lipídios acumulados(6,68 g/l de biomassa com 12,79% de lipídios) após 15 dias de cultivo emfotobiorreator tubular foi obtida com a mistura (Ar + 15% C02), enquanto comapenas ar, foi de 6,17 g/l. Certamente valores superiores e/ou inferiores aesses poderão ser obtidos em cultivos da microalga Botryococcus braunii OFC27 ou com outros gêneros e espécies de algas quando cultivadas em caldopuro ou diluído, bem como em níveis de C02 que não testados nesse estudo.Reciclagem do sobrenapanteO cultivo da microalga Botryococcus braunii OF C27 é realizadoreciclando-se o sobrenadante após separação, por exemplo utilizandofiltragem. A reciclagem do sobrenadante é foi realizada nos mesmosfotobiorreatores acima descritos, alimentados em todos os experimentos comapenas uma mistura gasosa (Ar+15% CO2), pois foi essa condição queforneceu os melhores resultados em termos de produção de biomassa eacúmulo de lipídios, embora seja possível utilizar outras concentrações de C02.Assim, no processo da presente invenção, é previsto a reciclagem da fraçãolíquida (sobrenadante) da primeira produção para utilização como meio decultivo para uma segunda, uma terceira ou mais bateladas, até que osobrenadante residual se encontre totalmente exaurido em seu nutrientesoriginais.

Após cultivo e filtração, o sobrenadante pode apresentar pHalterado, havendo necessidade de sua correção para faixa ótima. A grandevantagem dessa recirculação, diz respeito ao fato de que, além do tratamentobiológico conferido a esse resíduo altamente poluente, proveniente da Unidade2, se consegue implementar a produção de lipídios destinados à produção debiodiesel e/ou óleo combustível. Na Tabela 9 abaixo podemos observar quecom o passar dos ciclos, os macro e microelementos vão sendo consumidos,os níveis de DQO e DBO vão sendo significativamente reduzidos, chegando aofinal do terceiro ciclo com taxas muito próximas de zero. Fica, portanto,claramente observada a importância econômica e ambiental da recuperação doC02 gerado durante a produção de biomassa de levedura Rhodosporídiumtorulóides OF A25 e reutilização do mesmo na produção de biomassa damicroalga Botryococcus braunii OF C27, se reaproveitado assim todos osresíduos gerados na Unidade 2 em um circuito integrado.

Tabela 10 - Produção de biomassa algal ao longo dos ciclos derecuperação de caldo de produção de biomassa de levedura oleaginosa

Tempo de Cultivo Ar +15% C02 %

(dias) g/l Lipídio

0 0,211

15 6,68±0,53 12,79

30 4,54±0,34 15,74

45 1,94±0,27 17,65

Na tabela 10 se constata que a reciclagem do sobrenadanteinterfere positivamente na taxa de acúmulo de lipídios do Botryococcus brauniiOF C27, porém não na produção de biomassa.Tabela 11- Redução dos níveis de DQO e DBO do caldo proveniente daUnidade 2 ao longo dos ciclos

DQO DBO(mg/l 02) (mg/l 02)

Início 23.414±724 13.900±589

1o. Ciclo 4682±234 1210±65,7

2o. Ciclo 265±67 97±3,12

3o. Ciclo 24±1,57 <5,0

As análises de DBO e DQO, cujos resultados estão listados naTabela 11 acima, foram realizadas segundo Standard Methods for theExamination of Water and Wastewater, 20ed.,1998,Hach Company e WTW. Aquantificação de lipídios totais presentes na biomassa algal foi determinadaempregando-se a metodologia proposta por BLIGH & DYER (1959).

Ainda, de acordo com a presente invenção, o caldo residualpoderá ser diluído em água, acrescido ou não de outras substâncias químicastendo por finalidade ajustar seu pH ou ainda complementar determinadosmacros e micro-nutrientes. Também, se necessário, o caldo poderá serdecantado, filtrado ou clarificado utilizando-se carvão ativado ou agentesfloculantes, dependendo da concentração de sólidos em suspensão. Observa-se, igualmente, que a pasteurização ou esterilização do caldo não proporcionadiferenças significativas na produção de biomassa e acúmulo de lipídios nosdiferentes grupos de algas pesquisados, sendo, portanto, uma operaçãounitária dispensável, embora possa ser empregada quando se fizer necessário.De acordo com apresente invenção, essa mesma metodologia poderá serempregada com outras algas e/ou cianobactérias que poderão ser cultivadasde forma isolada e/ou em co-culturas (linhagens combinadas) e sãopreferencialmente aquelas dos gêneros e espécies formadas pelo grupoEuglena sp. (gracilis), Anabaena sp. (variabilis, cylindrica, hassali, planctonica),Dunaliella sp. (salina, bardawi\, tertioleta), Achananthes oríentalis, Amphora(delicatissima, cafeiformis), Ankistrodesmus falcatus, Chaetoceros sp. (muelleri,gracilis, muelleri subsalsum), Clorococcum sp., Chlorrella sp. (ellipsoidea,salina), Chromonas sp. Chrysosphaera sp., Cricophaera sp., Cryptomonas sp.,Cyclotella sp. (meneghiniana, cryptica), Navícula sp. Amphiprora hyalina,Eustigmatophyte flagellate, Pleuorochysis sp., Franceia sp., Gleocapsasp. ,Gloeothamnion sp., Hymenomonas sp., Isochrysis aff. Galbana,Monoraphidium sp., Nannochloropsis sp. (salina), Navícula (saprophil,pseudotenelloides, biskanterae, acceptata, saprophila, pseudotenelloides),Nephrochloris sp., Nitzschia sp. (pusilla monoensis, elliptica, alexandrina,quadrangula, pusila monoensis, inconspicua, microcephala, frustulum,hantzchianna, intermédia, frustulum, communis), Ochromonas sp., Oocystis sp.(pusilla), Oscillatoria sp. (subborevis, limnetica), Phaeodactylum tricornutum,Platymonas sp., Pleurochrysis sp. (dentate), Prymnesiophyte sp.,Pseudoanabaena sp., Pyraminonas sp., Stichococcus sp., Synechococcus sp.,Tetraselmis suecica, Thalassiosira weissflogii, Nitzschia sp., bem como seusmutantes e/ou linhagens modificadas geneticamente capazes de acumularlipídios em sua biomassa.

Essas algas e cianobactérias poderão também ser cultivadas emescala industrial. Diferentes formatos e tamanhos de tanques podem serutilizados, podendo ser abertos ou fechados, aerados ou não, agitados ou não,contínuos, semi-contínuos ou descontínuos, horizontais, verticais, do tiporaceway, de placas, tubulares, ovais, circulares, retangulares ou quadrados.

O cultivo de algas ou cianobactérias em reatores abertos érealizado em tanques naturais ou artificiais com volumes que podem variarentre algumas dezenas de litros até vários milhões de litros. Esses reatoresocupam grandes áreas, podendo atingir em média 10.000m2ou mais, no casode um único tanque horizontal ou vertical. O sistema mais comum de agitaçãoemprega pás, que são agitadas mecanicamente, sendo que ditas pás sãodistribuídas em espaços regulares por toda a superfície do meio, ou entãolocalizadas nas extremidades ou no centro do reator. Em conjunto com aagitação por pás, pode ser injetado ar comprimido. Esse ar poderá ser filtradoou não. Os reatores poderão ser fechados, através do uso de uma coberturaremovível, porém essa cobertura deverá ser construída de um materialtransparente ou translúcido à luz natural ou artificial. Materiais apropriados sãoplástico, acrílico e vidro.

No caso de produção industrial, o dióxido de carbono (C02)produzido na Unidade 2 - Produção de Biomassa Microbiana oleaginosa, érecuperado no topo dos biorreatores através de um coletor acoplado ao mesmoe transferido através de tubulações até os tanques de produção de algas e/oucianobactérias. O C02 é distribuído através de borbulhadores ou difusoresapropriados instalados no meio de cultivo, de forma que a concentração deC02 na forma dissolvida no meio seja da ordem 0.1-30%. O C02 poderá sercomprimido e/ou purificado e estocado em reservatórios pressurizados antesde ser injetado nos tanques de cultivo de algas e/ou cianobactérias. No caso deserem purificados, os gases provenientes dos biorreatores de produção debiomassa microbiana oleaginosa (Unidade 2) passam através de duas torreslavadoras recheadas com espirais de cerâmica até chegar ao gasômetro. Nasditas torres, em que o líquido de lavagem é água desaerada, ocorre a remoçãoquase que total de todas as impurezas solúveis em água. O líquido de lavagemretorna por bombeamento aos biorreatores de produção de biomassamicrobiana (Unidade 2), podendo ainda ser enviados aos tanques de produçãoda biomassa algal. Do gasômetro, o gás é conduzido a um depurador contendoK2Cr207 em solução, o qual oxida metabólitos voláteis tais como aldeídos,álcoois, entre outros, presentes no gás, que é então resfriado. Num segundodepurador, contendo H2S04, completa-se a oxidação e o gás é desidratado. OC02 que sai deste depurador arrasta um pouco de ácido que é eliminado numatorre recheada com coque, na qual circula uma solução de Na2C03. Quando oácido é neutralizado, há liberação de C02. O gás passa por um lavadorcontendo uma pequena porção de glicerina que tem por finalidade absorver osprodutos oxidados e fornecer um gás inodoro que pode ser estocado sobcompressão em tanques para ser utilizado no cultivo de algas e/oucianobactérias.

A separação ou colheita da biomassa algal produzida poderá serrealizada de maneira contínua, semi-contínua ou descontínua, manual oumecânica, floculada ou não, utilizando centrífugas, filtros, filtros prensa,peneiras, decantadores ou ciclones. Prefere-se, segundo o processo dapresente invenção, a centrifugação e/ou filtração. A biomassa algal poderá serextrusada ou não, seca naturalmente ou em secadores de leito fixo ou móvel,ou ainda por atomização (spray-drier), ou tambor rotatório para extraçãoposterior de lipídios. A biomassa oelaginosa algal recuperada poderá ainda,alternativamente, ser submetida à uma etapa de rompimento celular e a seguirenviada a um misturador.

4a Etapa - Processamento da Biomassa Microbiana Oleaginosa e/ou Algal

Tanto a biomassa oleaginosa como a biomassa algal produzidasegundo o processo da presente invenção são separadas do caldo de culturada mesma forma, ou seja por centrifugação. Nos experimentos foi utilizada umacentrifuga marca Car Padberg Zentrifugenbau, modelo 241, 20.000rpm,capacidade, 250l/h. Após separação do caldo, as referidas biomassas foramlavadas duas vezes com água potável. Essas biomassas podem também serseparadas por outras operações unitárias, tais como decantação ou filtração,embora a centrifugação possa figurar como o processo preferido na presenteinvenção. No caso presente, a biomassa foi processada por dois métodosdistintos, com e sem secagem.

Secagem

A secagem das biomassas de levedura oleaginosa e algal foirealizada em uma estufa à vácuo marca BTM Medicai, Modelo Vacucell, comcapacidade de 111 litros. A secagem foirealizada em temperatura de 60 °C,pressão de 500 mmHg e tempo de 24 horas. Após secagem, o teor de umidadedessas biomassas variaram entre 8,5-10%.

Tratamento da Biomassa úmida

As biomassas de levedura oleaginosa e algal recuperadas apóscentrifugação são enviadas para a Unidade 5 - Extração de Óleos (lipídios) eLiquefação Direta, conforme ilustrada na Figura 6. Alternativamente, abiomassa úmida ou seca poderá passar por um processo de rompimentocelular para facilitar a extração dos lipídios subseqüentemente no extrator abase de solventes orgânicos. Esse rompimento celular poderá ser realizadoatravés do uso de métodos mecânicos ou não mecânicos. Os métodosmecânicos consistem no uso de pressão, trituração ou ultrasom. Os métodosnão mecânicos se baseiam fundamentalmente no uso de enzimas queprovocam lise celular, como a lisozima ou outras, ou em métodos químicospelo uso de detergentes ou ainda em métodos físicos, através do choqueosmótico ou congelamento. As biomassas ainda úmidas (em pasta) denatureza microbiana e algal submetidas ou não ao rompimento celular poderãoainda opcionalmente serem enviadas a um misturador onde são igualmentealimentados suportes naturais desidratados, tais como farelo de soja, proteínade soja concentrada, polpa cítrica e bagaço de mandioca, dentre outros. Aadição desses suportes naturais à biomassa oleaginosa de levedura e/oufungos filamentosos e/ou algal, tem por finalidade suprimir a etapa de secagemda mesma antes de ser conduzida ao extrator, bem como gerar um produtodestinado ao cosumo animal, após extração dos lipídios.

5a Etapa - Extração dos Óleos (lipídios) e Liquefação DiretaTermopressurizadaAs biomassas das leveduras oleaginosa Rhodosporidiumtorulóides OF A25 e da microalga Botryococcus braunii OF C27, produzidas eprocessadas segundo a presente invenção, têm seus óleos (lipídios) extraídosatravés de dois processos distintos, em extrator tipo Soxhlet e por liquefaçãodireta termopressurizada.

Extrator tipo Soxhlet semi-pilotoUm extrator semi-piloto baseado na metodologia Soxhlet, comcâmara/vaso de extração contendo um volume de 3 litros é alimentado com300 gramas de biomassa de levedura oleaginosa e algal moída com partículasde 0,1-1 mm. A extração do óleo (lipídios) é feita nessa câmara através darecirculação de 2,5 litros de n-hexano que percola através da biomassa contidano interior de um envoltório de papel de filtro. Como fonte de aquecimento dacâmara é utilizado vapor fluente a 4 atm. A temperatura de extraçãoempregada nesse extrator é de 95 °C, com um tempo de extração otimizado de4 horas. Outros solventes e/ou condições de extração poderão ser testadosnesse equipamento.Analise dos óleos (lipídios)

Os óleos produzidos pela levedura Rhodosporidium torulóides OFA25 e pela microalga Botryococcus braunii OF C27 foram analisados conformemetodologia abaixo:

1- Metilação dos ácidos graxos presentes nas amostras das biomassas delevedura e algal utilizando o método Metcalfe.Smith & Pelka (1966);

2- Separação e detecção dos ácidos graxos presentes nas amostras utilizandoum cromatógrafo marca Varian, modelo 3300, equipado com detector deionização de chama, injetor tipo "split/splitless", com coluna Carbomax 20M. Osparâmetros da operação: temperatura do detector - 280°C ; temperatura doinjetor - 250 °C ; temperatura da coluna - 110 °C (2 min), programação a 5°C/min até 180 °C (7min), programação a 10 °C/min até 210 °C;

3- Gás de arraste, H2 com fluxo na coluna de 1mL/min;

4- Gás "make up", N2 (30ml_/min); e

5- Técnica de injeção "split, razão 1:100.

O tempo de retenção (tr) e porcentagem(%) dos componentesforam obtidos através do integrador INTRALAB 4290 que é acoplado aocromatógrafo.

A identificação dos ácidos graxos presentes em cada amostra foifeita através dos seguintes procedimentos:

i) tempo de retenção e tempo de retenção corrigido (tr e trc) de ésteresmetílicos dos ácidos graxos das amostras e padrões;ii) técnica da co-iluição (spiking) de padrões junto com amostra; e

iii) comprimento equivalente de cadeia (ECL).

Os valores do ECL foram calculados segundo Miwa et al.,1960,Bano et al., 1988. Nas Tabelas 12 e 13 são apresentados a composição média(3 determinações) dos ácidos graxos presentes (em 3 amostras distintas) deóleos produzidos pela levedura oleaginosa Rhodosporidium torulóides OF A25e pela microalga Botryococcus braunii OF C27.

Tabela 12 Perfil de Ácidos Graxos da levedura Rhodosporidiumtorulóides OF A25<table>table see original document page 41</column></row><table>Extração por liquefação direta termopressurizadaEste processo é designado extração por liquefação diretatermopressurizada (ELDT), em razão de que o extrator/reator opera compressões superiores à atmosférica. Este acréscimo de pressão não éocasionado pela injeção de um gás inerte, mas sim pela elevação acima doponto de ebulição e vaporização do liquido no interior do vaso/reator. O reator éformado por um vaso de aço carbono revestido internamente em aço inox AISI316. Este revestimento interno deve ser de aço inoxidável para não sofrercorrosão em virtude dos diversos sais que são adicionados ao caldo defermentação que inevitavelmente estarão presentes em quantidadesapreciáveis na biomassa úmida.

O extrator é constituído por um cilindro de 40 cm de comprimento,20 cm de diâmetro externo e 15 cm de diâmetro interno, resultando numvolume total de 7,o litros. Internamente existem 3 chicanas anguladas entre siem 120° e com largura de 1 cm, o suficiente para elevar as esferas e fazê-lascair. O reator repousa sob eixos horizontais que o movimentam a umavelocidade de 40 rpm, promovendo eficiente mistura entre solvente, biomassae esferas de porcelana, propiciando uma melhora na eficiência do rompimentocelular e facilitando a extração do óleo. 500g de biomassa de leveduraoleaginosa e algal na forma de pasta com 70% de umidade são misturadoscom 2,1 litros de solvente e 50 esferas de porcelana. Nessas condiçõesoperacionais a taxa de ocupação do volume útil do reator é deaproximadamente 35%. O reator é lacrado, tendo inicio o processo deextração, que é realizada a uma temperatura de cerca de 120 °C, para o casoda utilização do n-hexano como solvente ou cerca de 145 °C para no caso doemprego do metanol. A pressão utilizada para ambos os tratamentos é de 7bar, otimizadas previamente. Temperaturas e pressões superiores e/ouinferiores a essas poderão ser utilizadas. O tempo de extração é de 1h 30 min,conforme condição otimizada, previamente.

Após término da extração, a fração sólida formada por detritoscelulares é separada da fração liquida formada por óleo + solvente + água, pormeio de filtração a vácuo em filtro Büchner com papel filtro de porosidade de 4um. A fase sólida fica retida no filtro sendo desidratada e podendo serutilizada como suplemento na alimentação animal. A mistura das fasesorgânica e oleosa é encaminhada a uma funil de decantação. Após 1 hora asfases estão bem distintas. A camada superior é composta por uma mistura deóleo e solvente. Essa mistura é destilada para recuperação do solvente que poderá ser reciclado no processo, obtendo-se um óleo bruto viscoso decoloração escura.

Tabela 14 Propriedades do óleo obtido por liquefação diretatermopressurizada (eldt)

<table>table see original document page 43</column></row><table>Na Tabela 14 acima são apresentadas as propriedades dos óleosmicrobiano e algal obtidos através do processo ELDT, segundo a presenteinvenção, em comparação com o óleo BPF (tipo A) derivado do petróleo. Osexperimentos demonstram que esse óleo obtido de biomassa de levedura(OBL) e de microalga (OBM) se enquadram dentro das normas brasileiras(ANP, Portaria 80 e estrangeira ASTM) para essa calasse de combustíveldestinado à geração de calor/vapor. O processo ELDT acima descrito possuigrande potencial aplicativo na área da produção dos biocombustíveis, poisdispensa a operação de secagem da biomassa, que é considerada de grandeimpacto econômico. Desta forma, a presente invenção através de suastecnologias integradas contempla a possibilidades de se optar pela viatecnológica que seja mais vantajosa economicamente e/ou do tipo dobiocombustível que se deseja produzir, o biodiesel ou o óleo combustível parageração de vapor/energia.

Ainda, segundo o processo da presente invenção, a biomassamicrobiana oleaginosa e/ou algal com alto teor de umidade pode,alternativamente, ser liqüefeita em um reator sob pressão e temperatura, napresença de catalisadores químicos, preferencialmente na presença de álcalis.Durante a liquefação, o reator pode ser purgado com um gás inerte, tal como onitrogênio, pois a purga impede a evaporação da água e auxilia na remoção doar residual no equipamento. De acordo com a proveniência da biomassa(microbiana, algal ou suas misturas), o procedimento de liquefação diretatermopressurizada pode durar de 5 minutos e 120 minutos, a temperaturainterna do reator pode variar de 120 °C e 400 °C e a pressão interna podevariar de 1 MPa e 5 MPa. O material liqüefeito obtido a partir desta técnicapossui alto poder calorífico, cerca de 5.000-11.500 Kcal/kg, dependo do teor delipídios presente na biomassa, bem como das condições empregadas noprocesso de liquefação e natureza do catalisador. O produto obtido poderá serutilizado diretamente como combustível ou então pode ser misturado aopetróleo fóssil durante a operação de refino, com vistas a aumentar as fraçõesde diesel e/ou gasolina. Poderá ainda ser enviado para uma nova etapa deextração líquido-líquido, com vistas à extração de hidrocarbonetos esubseqüente produção de biodiesel.

6a Etapa - Transesterificação dos óleos (lipídios) por catalise ácida

Os lipídios de biomassa oleaginosa de levedura e microalgalextraídos e analisados conforme acima descrito foram transesterificadossegundo técnica descrita por Miao & Wu (2006).

As reações de transesterificação foram realizadas em frascos devidro do tipo Becker com capacidade de 1 litro. Foi utilizando uma relaçãometanol.óleo de 56:1 e 100% H2S04 como catalisador. Os frascos recobertoscom papel de alumínio foram transferidos para uma estuda com temperaturacontrolada em 30 °C, sendo a reação de transesterificação conduzida sobagitação por um período de 4 horas. Após esse período, o produto da reaçãofoi transferido para um funil de separação. A parte superior constituída debiodiesel foi separada e lavada com éter de petróleo e, na seqüência, comágua a temperatura 45 °C até a mesma se tornar neutra, demonstrando queocorreu completa remoção da acidez residual da reação de transesterificação.O biodiesel foi então obtido por separação do éter de petróleo por destilação. Aparte inferior do funil de separação é constituída basicamente por glicerina que érecirculada para o reator da Unidade 2, efetivando assim o ciclo de aproveitamentointegral dos resíduos no processo segundo a presente invenção.

Avaliação da qualidade do biodiesel produzidoA Tabela 15 a seguir apresenta uma série de parâmetros dobiodiesel produzido a partir dos ésteres metílicos obtidos a partir dasbiomassas oleaginosas da levedura Rho dosporídium torulóides OF A25 emicroalga Botryococcus braunii OF C27. Esses resultados foram comparadoscom amostras de diesel derivado do petróleo adquirida no mercado na cidade de Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, Brasil. Os resultados evidenciam queo biodiesel produzido através do processo da presente invenção apresentauma qualidade próxima ao diesel derivado do petróleo, podendo serempregado integralmente ou em mistura com esse combustível fóssil emmotores tipo Diesel. Outra possibilidade é sua utilização como substituto ao biodiesel produzido a partir de produtos agrícolas que são amplamentedemandados na alimentação humana e animal, como por exemplo, a soja.Tabela 15. Comparação das propriedades do biodiesel produzido a partir

de óleo de levedura e microalga com diesel derivado do petróleo

<table>table see original document page 46</column></row><table>ASTM: American Society for Testing and Materials

Segundo um outro aspecto da presente invenção, atransesterificação dos óleos provenientes de uma das sub-unidades deextração ou de liquefação direta, ou mesmo suas misturas, podem sertransesterificados com o uso de etanol, isopropanol, butanol ou quaisqueroutros álcoois primários, anidros ou hidratados, ou suas misturas em quaisquerproporções estequiométricas de óleo/álcool. A temperatura da reação deverávariar de 25 °C a 120 °C. A Figura 7 ilustra um fluxograma da unidade detransesterificação, parte integrante do presente processo.

Nessa Unidade 6, a transesterificação poderá ainda ser realizadautilizando-se diferentes catalisadores químicos. Se a catalise for alcalina, pode-se utilizar o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou outros e, se a catalisefor ácida, pode-se utilizar o ácido fosfórico, ácido clorídrico, o carbonato decálcio ou outros. No caso de catalise enzimática, pode-se utilizar quaisquerenzimas classificadas como lipolíticas/lípases. De acordo com o catalisadorutilizado no processo, deve-se aplicar o neutralizador correspondente na etapade lavagem do biodiesel. A transesterificação pode também ser realizadautilizando-se co-solventes tais como o tetrahidrofurano ou outros, os quais irãoaumentar a solubilidade do álcool primário utilizado. Neste caso, ficadispensada a neutralização, pois são recuperados juntamente com o álcool.

Além destas duas opções, há uma terceira, a reação detransesterificação em estado supercrítico, no qual a reação ocorrerá atemperaturas variando de 350 °C a 400 °C e pressões variando na ordem de60 a 100 atm.

De um modo geral, a reação de transesterificação poderá aindaocorrer em batelada ou em sistema contínuo. O catalisador, o co-solvente, oálcool e a biomassa processada poderão ser adicionados ao tanque detransesterificação conjuntamente ou poderão ser previamente misturados emoutra ordem utilizando-se tanques adicionais para estas misturas. A reaçãopoderá ocorrer com ou sem catalise ácida, básica ou enzimática, homogêneaou heterogênea, com ou sem o uso de co-solventes, em estado supercrítico ounão e com ou sem agitação.

Após a etapa de transesterificação, o álcool utilizado poderá serrecuperado por processos de evaporação ou destilação flash, visando reduzir asolubilidade do glicerol no biodiesel. Caso seja utilizada transesterificação comco-solvente, nesta etapa ele será removido junto ao álcool.

Em seguida a etapa de transesterificação, é realizada aseparação de fases, resultando em uma fase leve compreendendo o biodiesel(fase superior) e em uma fase pesada compreendendo o glicerol (fase inferior).A separação de fases poderá ocorrer naturalmente por decantação ou atravésda ação de um campo gravitacional centrífugo para acelerar este processo,podendo-se então utilizar uma centrífuga. Após a separação de fases, o glicerolé retirado do sistema e recirculado como fonte de carbono para a produção debiomassa microbiana oleaginosa, no início do processo integrado segundo apresente invenção. O biodiesel assim obtido passa, alternativamente, por umaetapa de lavagem, visando a remoção de quaisquer impurezas ou de outroscompostos químicos adicionados ao processo. Esta lavagem é realizadautilizando-se diferentes proporções água/biodiesel e por qualquer métodoadequado. O efluente dessa etapa de lavagem consiste em uma mistura deágua e catalisador, caso este tenha sido empregado na etapa detransesterificação.

O biodiesel purificado poderá então ser armazenado ou,desejando-se um produto com qualidade superior, pode-se ainda submetê-lo auma etapa de evaporação da água remanescente.

Gomo alternativa à produção de biodiesel, os lipídios provenientesda Unidade 5 - Extração de Óleos (lipídios) e Liquefação Diretatermopressurizada, conforme ilustrada na Figura 6 e acima descrita, podem serutilizados diretamente na indústria. Vantajosamente, os lipídios provenientes dasub-unidade de liquefação direta podem ser utilizados como combustíveis paraa geração de calor e/ou vapor, enquanto que os lipídios provenientes da sub- unidade de extração, ou suas misturas com aqueles provenientes da sub-unidade de liquefação direta, podem ser utilizados como adjuvantes ao petróleobruto ou suas frações pesadas provenientes do refino, o que proporcionaráaumento nos rendimentos em gasolina, diesel e demais frações durante orefino ou craqueamento. A Figura 8 ilustra um fluxograma mostrando tais alternativas.

Os técnicos no assunto perceberão, pela descrição acima, que oprocesso para a produção de biodiesel e/ou óleo combustível a partir debiomassa microbiana oleaginosa e/ou algal segundo a presente invenção éuma tecnologia inovadora, ecologicamente sustentável, que não gera qualquer tipo de resíduo, proporcionando ainda a vantagem de liberar importantesvolumes de oxigênio na atmosfera a partir dos tanques de produção debiomassa algal.

Claims

1. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, caracterizado por compreender como matéria primabiomassa microbiana oleaginosa obtida a partir de derivados e resíduos dacana de açúcar, a qual pode ser integrada com biomassa algal e/ou comglicerol.

2. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado porcompreender, em sua forma integrada, pelo menos uma etapa de produção debiomassa oleaginosa de leveduras e/ou fungos filamentosos a partir dosderivados e resíduos de cana de açúcar, uma etapa de produção de biomassaalgal pelo aproveitamento integral dos resíduos, C02 e caldo residual, geradosna referida produção de biomassa oleaginosa, uma etapa de extração doslipídios contidos nas ditas biomassas microbiana oleaginosa e algal, ditoslipídios sendo encaminhados diretamente para uso na geração de energia ouvapor, e/ou encaminhado para uma etapa de transesterificação para produçãode biodiesel, da qual o glicerol residual é recirculado como matéria prima paraprodução da referida biomassa microbiana oleaginosa.

3. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a etapa de produção de biomassa microbiana oleaginosa érealizada com o uso da levedura Rhodosporídium toruloides OF A25.

4. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a etapa de produção de biomassa microbiana oleaginosa érealizada com o uso de uma ou mais dentre as leveduras e fungosfilamentosos, modificados geneticamente ou não, escolhida do grupoconsistindo de Cândida curvata, Cândida guilhermondi, Cândida tropicalis,Cândida sp., Cândida oleophila, Cândida lipolitica, Críptococcus terricolus,Hansenula saturnus. Hansenulla ciferrii, Lipomyces starkei, Rhodutoralagracilis, Aspergillus fischeri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans,Aspergillus ochrceus, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus, Cladosporium fulvum, Cladosporium herbarum, Mucor miehei, Penicillium gladiololi,Penicillium javanicum, Penicilium lilacinum, Penicillium spinulosum,Peniciliumm ultimum, Críptococcus albidus, Lypomices starkeyi, Rhodotorulaglutinis, Trichosporon pullulans, Mortierrella hygrophila, M. zychae, M. elengata,M. parvispora, M. schmuckeri, M. alpina, Lypomyces lipofeer, Lipomycestetrasporus, Williopsis saturnus, Cândida diddensiae, Yarrowia lipolitica,Trichosporon cutaneum.

5. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a etapa de produção de biomassa algal é realizada com o uso da microalga Botryococcus braunii OF C27.

6. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a etapa de produção de biomassa algal é realizada com o uso dealgas e/ou cianobactérias que poderão ser cultivadas de forma isolada ou em co-culturas (linhagens combinadas) e são formadas pelo grupo consistindo deEuglena sp. (gracilis), Anabaena sp. (variabilis, cylindrica, hassali, planctonica),Dunaliella sp. (salina, bardawi\, tertioleta), Achananthes orientalis, Amphora(delicatissima, cafeiformis), Ankistrodesmus falcatus, Chaetoceros sp. (muelleri,gracilis, muelleri subsalsum), Clorococcum sp., Chlorrella sp. (ellipsoidea, salina), Chromonas sp. Chrysosphaera sp., Cricophaera sp., Cryptomonas sp.,Cyclotella sp. (meneghiniana, cryptica), Navícula sp. Amphiprora hyalina,Eustigmatophyte flagellate, Pleuorochysis sp., Franceia sp., Gleocapsasp., Gloeothamnion sp., Hymenomonas sp., Isochrysis aff. Galbana,Monoraphidium sp., Nannochloropsis sp. (salina), Navícula (saprophil,pseudotenelloides, biskanterae, acceptata, saprophila, pseudotenelloides),Nephrochloris sp., Nitzschia sp. (pusilla monoensis, elliptica, alexandrina,quadrangula, pusila monoensis, inconspicua, microcephala, frustulum,hantzchianna, intermédia, frustulum, communis), Ochromonas sp., Oocystis sp.(pusilla), Oscillatoria sp. (subborevis, limnetica), Phaeodactylum tricornutum,Platymonas sp., Pleurochrysis sp. (dentate), Prymnesiophyte sp.,Pseudoanabaena sp., Pyraminonas sp., Stichococcus sp., Synechococcus sp.,Tetraselmis suecica, Thalassiosira weissflogii, Nitzschia sp., bem como seusmutantes e/ou linhagens modificadas geneticamente capazes de acumularlipídios em sua biomassa.

7. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de os derivados da cana de açúcar serem bagaço de cana de açúcarhidrolisado concentrado e detoxificado (BHCD), caldo, melaço, açúcar mascavoe/ou refinado.

8. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de o bagaço de cana de açúcar sofrer um pré-tratamento para alterar otamanho e a estrutura das fibras lignocelulósicas, micro e macroscopicamente,e alterar a composição química e estrutura sub-microscópica das mesmasantes de ser hidrolisado, dito pré-tratamento sendo efetuado por meios físicos,físico-químicos, químicos, biológicos ou suas combinações, preferencialmentepor meio de trituração mecânica ou moagem, sendo em seguida hidrolisado pormeios 'químicos ou enzimáticos.

9. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de o bagaço de cana de açúcar pré-tratado, seco e com partículas decerca de 0,1-0,8mm, ser hidrolisado a cerca de 125 °C, por um período decerca de 20 minutos, utilizando-se para cada 1 kg de matéria seca cerca de120 gramas de ácido sulfúrico concentrado, com uma relação sólido liquido de1:10, sendo o hidrolisado concentrado e detoxificado.

10. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OU ÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ser preparado um inoculo da cepa Rhodosporidium toruloides OFA25 em meio YM (Yeast Médium) sólido, a qual é submetida ao crescimentoem estufa a cerca de 30°C durante 5 dias e incubada por um período de cerca10 de 72 horas, sendo dito meio YM composto por glicose (10g/l), peptona (5,0g/l), extrato de levedura (3,0 g/l), extrato de malte (3,0 g/l), Agar (20 g/l) e pH5,0.

11. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com as reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a biomassa microbiana oleaginosa ser produzida em biorreator dotadode agitação mecânica, em um tempo de cerca de 24 horas a cerca de 150horas, em uma relação carbono/nitrogênio variando de cerca de 0,5 a 500, umpH variando de 2,5 a 8,5 e uma temperatura na faixa de 10 a 50 °C, sendo omeio de cultivo aerado com um volume de ar na faixa de 0,1 a 5 v/v/m (volume de ar por volume de meio por minuto).

12. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com as reivindicação 2, caracterizado pelofato de a produção de biomassa microbiana oleaginosa compreender:- a preparação de um meio de pré-inóculo compreendendo cerca de 10 g/l de glicose, 5 g/l de peptona, 3 g/l de extrato de levedura e 3 g/l de extrato de malte;- a preparação de um meio de adaptação compreendendo 10 g/l de melaço decana de açúcar, 5 g/l de hidrolisado de bagaço de cana de açúcar concentradoe detoxificado, 5 g/l de glicerol e 5 g/l de extrato de levedura; e- um meio de propagação compreendendo cerca de 40 g/l de melaço de canade açúcar, 30 g/l de hidrolisado de bagaço de cana de açúcar concentrado edetoxificado, 30g/l de glicerol, 5 g/l de extrato de levedura, 2,5 g/l de uréia e 0,5ml/l de anti-espumante, sendo todos esses meios desenvolvidos em um pH emcerca de 5,0.

13. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com as reivindicação 2, caracterizado pelofato de a etapa de produção de biomassa algal compreender:- a adaptação da microalga em caldo residual de biomassa microbianaoleaginosa, em cultivos incubados por um período de cerca de 15 dias, nosquais são mantidos uma temperatura de 25 °C (± 2 °C), agitação de cerca de 110 rpm, cerca de 1500 Lux de intensidade de irradiação luminosa porperíodos de 12 horas alternados com 12 horas no escuro, sendo biomassaalgal formada filtrada, lavada com água destilada e seca por 24 horas emestufa a cerca de 100°C;- preparação de inóculo para o cultivo da microalga em caldo residual debiomassa microbiana oleaginosa, ou uma mistura de caldo + água, sendo aconcentração inicial de microalga adaptada com valores mínimos na ordem de 0,2 g/l; e- ativação, por meio da cultura ativa (inóculo), de fotobiorreatores contendocaldo residual de biomassa microbiana oleaginosa, os quais são providos deagitação e aeração através de um fluxo de ar atmosférico de cerca de 1 v/v/m(volume de ar por volume de meio), com temperatura controlada na faixa de 30°C (±2 °C), ditos fotobiorreatores possuindo uma iluminância de cerca de 1500Lux, por um tempo de cultura de cerca de 15 dias.- injeção de dióxido de carbono residual da etapa de produção de biomassamicrobiana oleaginosa nos fotobiorreatores, nos quais são borbulhado de modoa atingir uma concentração na forma dissolvida no meio na ordem 0,1-30%; e- separação ou colheita da biomassa algal produzida por centrifugação e/oufiltração.

14. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com as reivindicação 2, caracterizado pelofato de as biomassas de levedura oleaginosa e algal passarem por umprocesso de rompimento celular para facilitar a extração dos seus óleos(lipídios) através de extrator tipo Soxhlet e por liquefação diretatermopressurizada.

15. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com as reivindicações 2 ou 14,caracterizado pelo fato de os lipídios extraídos das biomassas oleaginosamicrobiana e algal serem transesterificados para a produção de biodieselsegundo um processo no qual o glicerol residual é recirculado para alimentar obiorreator de produção de biomassa microbiana oleaginosa.

16. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BIODIESEL E/OUÓLEO COMBUSTÍVEL, de acordo com as reivindicações 2 ou 14,caracterizado pelo fato de os lipídios extraídos das biomassas oleaginosamicrobiana e algal serem utilizados diretamente como combustíveis para ageração de calor e/ou vapor, ou como adjuvantes ao petróleo bruto ou suasfrações pesadas provenientes do refino.