CN106543267A

CN106543267A - β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl,其合成和制备抗肝炎药物的应用

Info

Publication number: CN106543267A
Application number: CN201510591927.1A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王枫; 彭莉
Original assignee: Beijing Yisheng Kanghua Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Yisheng Kanghua Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2015-09-16
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2017-03-29

Abstract

β‑咔啉‑3‑甲酰‑Trp‑Lys‑Lys‑OBzl,其合成和制备抗肝炎药物的应用。本发明公开了下式的1‑(4‑羟基‑3‑甲氧羰基)苯基‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑Trp‑Lys‑Lys‑OBzl,公开了它的合成,公开了它对肝炎的治疗作用,因而本发明公开了它在制备抗肝炎药物中的应用前景。

Description

β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl,其合成和制备抗肝炎药物的应用

技术领域

本发明涉及下式结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl,涉及它的制备方法,涉及它对四氯化碳导致的小鼠急性肝损伤的治疗作用,因而本发明涉及它在制备治疗急性肝损伤的药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

肝损伤是多种致病因素造成的肝脏病理过程的一部分,长期肝损伤是肝纤维化,肝硬化和肝癌的重要诱因。肝损伤是危害我国人民健康的重要疾病之一。例如在全球超过4亿乙肝病毒表面抗原阳性者中,我国占1.2亿,大约30％。大约1/4急性肝损伤患者会转化为慢性肝损伤。例如在我国1.2亿乙肝病毒表面抗原阳性者中,慢性乙肝患者为3000万,大约占25％。慢性肝损伤会导致肝纤维化,肝硬化和肝癌。全球每年约有100万人死于乙肝病毒感染的疾病,位于疾病致死人数的第9位。发明治疗急性肝损伤的新药具有重要的。

在抗炎药物研究中,发明人不仅认识到β-咔啉-3-羧酸在肝脏的高分布性质,还认识到它对急性肝损伤的可靠疗效。经过长期实验,发明人进一步认识到将β-咔啉-3-羧酸的1位用水杨酸甲酯基取代,将β-咔啉-3-羧酸的3位羧基用Trp-Lys-Lys-OBzl修饰,可获得治疗急性肝损伤的优秀化合物。根据这些知识,发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供本发明涉及下式结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl。

本发明的第二个内容是提供1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl的制备方法,该方法包括以下步骤:

(1)L-色氨酸苄酯与5-甲酰水杨酸甲酯进行Pictet-Spengler缩合生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(2)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯芳构化为1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(3)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化下氢解脱苄生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸；

(4)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸与L-Trp-OBzl缩合生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-OBzl；

(5)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-OBzl在Pd/C催化下氢解脱苄生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp；

(6)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp与L-Lys(Boc)-OBzl缩合生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-OBzl；

(7)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-OBzl在Pd/C催化下氢解脱苄生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)；

(8)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)与L-Lys(Boc)-OBzl缩合生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OBzl；

(9)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OBzl与4N氯化氢-乙酸乙酯溶液冰浴下反应生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl。

本发明的第三个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl,对四氯化碳导致的小鼠急性肝损伤的治疗作用。

附图说明

图1.1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl的合成路线.i)CH₃OH,浓H₂SO₄,微波90℃；ii)多聚磷酸,苯甲醇,油浴75℃；iii)CH₂Cl₂,TFA；iv)THF,DDQ；v)CH₃OH,Pd/C,H₂；vi)二环己基碳二亚胺(DCC),1-羟基苯并三唑(HOBt),N-甲基吗啉(NMM),四氢呋喃(THF)；vii)氯化氢-乙酸乙酯(4N),冰浴。

图2.CCl₄治疗,生理盐水治疗,CCl₄加甘草酸二胺治疗和CCl₄加化合物9治疗小鼠肝组织HE染色图.A)生理盐水治疗4小时后小鼠肝组织HE染色图；B)CCl₄治疗4h后小鼠肝组织的HE染色图；C)CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗小鼠肝组织HE染色图；D)CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后再用1.0μmol/kg化合物9治疗小鼠肝组织HE染色图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备5-甲酰水杨酸甲酯

称取1.660g(10.0mmol)5-甲酰水杨酸于微波反应罐中,加入25mL甲醇及1mL浓H₂SO₄,放入搅拌子,在微波反应发生器中90℃反应2h,降至室温,将反应液转移至100mL茄瓶中用浓氨水调节pH值至8,将反应液减压浓缩除去甲醇,向反应瓶中加入100mL乙酸乙酯,依次用饱和NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液各洗3遍,然后用无水Na₂SO₄干燥30min,减压过滤,滤液减压浓缩至干,得1.635g(91％)目标化合物,为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):181[M+H]⁺。

实施例2制备L-色氨酸苄酯

称取15.0g(44.4mmol)多聚磷酸于500mL茄形瓶中,加入80mL苯甲醇,50℃搅拌使溶解。升温至75℃,加入10g(49.0mmol)L-色氨酸反应48h。停止加热,反应液降至室温,冰浴搅拌下加入400mL无水乙醚,此时有无色固体析出。搅拌过夜,减压过滤出无色固体,用200mL乙酸乙酯和10mL水混悬,搅拌下用三乙胺调节溶液pH值至8,使固体完全溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液各洗3遍,乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥,过滤,滤液减压浓缩至干,得12.85g(89％)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):295[M+H]⁺。

实施例3制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

将100mL CH₂Cl₂,10mL三氟乙酸,11.76g(40.0mmol)L-色氨酸苄酯和7.92g(44.0mmol)5-甲酰水杨酸甲酯的混合无室温搅拌48h。冰浴搅拌下往里缓慢滴加浓氨水,调节反应液pH至8,,静置,将CH₂Cl₂层依次用饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液各洗3遍,用无水Na₂SO₄干燥,过滤,滤液减压浓缩至干,得14.59g(80％)目标化合物,为黄色固体。ESI-MS(m/e):457[M+H]⁺。

实施例4制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)

室温搅拌下4.56g(10.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯用THF溶解,加入4.54g(20.0mmol)DDQ,4h后终止反应,过滤,滤出的固体依次用饱和NaHCO₃水溶液,甲醇和乙醚洗,得3.75g(83％)目标化合物,为灰白色固体。ESI-MS(m/e):453[M+H]⁺；Mp 190-191℃；¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝8.87(s,1H),8.42(dd,J＝8.4Hz,J＝2.4Hz,2H),8.10(dd,J＝8.7Hz,J＝2.1Hz,1H),7.69(d,J＝8.1Hz,1H),7.57(m,3H),7.37(m,4H),7.05(d,J＝8.7Hz,1H),5.46(s,2H),3.88(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ/ppm＝169.28,165.93,142.35,137.07,135.13,131.75,129.30,128.98,128.47,128.41,122.40,121.73,120.62,116.54,114.71,66.39,52.47。

实施例5制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸(3)

将2.26g(5.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)混悬于120mL甲醇中,室温搅拌下加入400mg Pd/C,使用三通连接反应瓶和氢气袋,先用真空水泵抽走反应液中的空气,然后通入氢气,如此反复3次,室温搅拌48h,过滤,滤液减压浓缩至干,得1.08g(60％)目标化合物,为淡黄色固体。Mp 227-228℃；ESI-MS(m/e):361[M-H]^-。

实施例6制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-OBzl(4)

将1.81g(5.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-羧酸(3)混悬于20mL无水THF,室温搅拌下加入0.675g(5.0mmol)HOBt,冰浴搅拌下加入1.133g(5.5mmol)DCC,得到反应液I,冰浴搅拌30分钟。将1.47g(5.0mmol)L-Trp-OBzl混悬于20mL无水THF,然后逐渐加入NMM调节pH至9,得到反应液II。将反应液II加入反应液I中,先在冰浴下搅拌1h,再在室温搅拌至TLC(CH₂Cl₂/CH₃OH,150:1)监测原料点消失。过滤除去生成的二环己基脲,滤液减压浓缩除去THF,残留物用150mL乙酸乙酯溶解,将得到的溶液依次用5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗3次,乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥,过滤,滤液减压浓缩至干,得到的黄色泡状物经硅胶柱层析纯化(CH₂Cl₂/CH₃OH＝500/1-100/1),得2.23g(70％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):639[M+H]⁺.Mp157-158℃；[α]₂₀ ^D＝-1.33(c＝0.43,CH₃OH).IR(KBr)3413.41,1731.68,1673.74,1660.21,1651.91,1633.40,1622.27,1615.71,1537.95,1520.14,1504.14,1494.43,1462.99,1455.25,1446.15,1355.63.¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ/ppm＝10.90(s,1H),8.99(s,1H),8.71(t,J＝8.4Hz,2H),8.34(d,J＝2.1Hz,1H),8.13(t,J＝8.1Hz,2H),7.74(dd,J＝8.7Hz,J＝2.1Hz,1H),7.58(dd,J＝15.6Hz,J＝7.8Hz,3H),7.38(m,8H),7.14(t,J＝6.9Hz,1H),6.99(dd,J＝15.6Hz,J＝8.4Hz,3H),5.27(m,1H),5.16(s,2H),3.94(s,3H),3.48(m,2H).

实施例7制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp(5)

将3.19g(5.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-OBzl(4)溶于50mL甲醇,室温搅拌下加入500mg Pd/C,使用三通连接反应瓶和氢气袋,反应液先用真空水泵抽走空气,然后通入氢气,如此反复3次,室温搅拌下反应8h,过滤,减压浓缩至干得1.97g(72％)目标化合物,为黄色固体。Mp 190-191℃；ESI-MS(m/e)547[M-H]^-；[α]₂₀ ^D＝-29.58(c＝0.83,CH₃OH)。

实施例8制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-OBzl(6)

将1.096g(2.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp(5)混悬于10mL无水THF,室温搅拌下加入0.270g(2.0mmol)HOBt,冰浴搅拌下加入0.453g(2.2mmol)DCC,得到反应液I,冰浴搅拌30分钟。将1.016g(2.0mmol)L-Lys(Boc)-OBzl混悬于10mL无水THF,然后逐渐加入NMM调节pH至9,得到反应液II。将反应液II加入反应液I中,先冰浴下搅拌1h,再室温搅拌至原料点消失。过滤除去生成的二环己基脲,滤液减压浓缩除去THF,残留物用100mL乙酸乙酯溶解,将得到的溶液依次用5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗3次,乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥,过滤,滤液减压浓缩至干,得到的黄色泡状物经硅胶柱层析纯化(CH₂Cl₂/CH₃OH＝500/1-100/1),得1.12g(65.4％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):867[M+H]⁺。

实施例9制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)(7)

将1.04g(1.2mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-OBzl(6)溶于20mL甲醇中,室温搅拌下加入150mg Pd/C,使用三通连接反应瓶和氢气袋,反应液先用真空水泵抽走空气,然后通入氢气,如此反复3次,室温搅拌下反应10h,过滤,减压浓缩至干,得0.896g(96％)目标化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):775[M-H]^-。

实施例10制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OBzl(8)

将0.776g(1.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)(7)混悬于10mL无水THF,室温搅拌下加入0.135g(1.0mmol)HOBt,冰浴搅拌下加入0.227g(1.1mmol)DCC,得到反应液I,冰浴下搅拌30分钟。将0.508g(1.0mmol)L-Lys(Boc)-OBzl混悬于10mL无水THF,然后逐渐加入NMM调节pH至9,得到反应液II。将反应液II加入反应液I中,先冰浴下搅拌1h,再室温搅拌至原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩除去THF,残留物用100mL乙酸乙酯溶解,将得到的溶液依次用5％KHSO₄水溶液和饱和NaCl水溶液各洗3次,乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥,过滤,滤液减压浓缩至干,得到的黄色泡状物经硅胶柱层析纯化(CH₂Cl₂/CH₃OH＝300/1-60/1),得0.91g(83％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):1095[M+H]⁺。

实施例11制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)

冰浴搅拌下缓慢向0.548g(0.5mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OBzl(8)滴加5.5mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N),搅拌下反应4小时后终止反应。反应液减压浓缩至干,残留物加乙酸乙酯溶解,再减压浓缩至干,该操作重复3次；残留物加无水乙醚充分混悬后静置,倾倒出乙醚,残留物减压浓缩至干,该操作重复3次,得0.448g(93％)标题化合物,为淡黄色粉末。

Mp178-179℃；ESI-MS(m/e):895[M+H]⁺；[α]₂₀ ^D＝-49.68(c＝0.35,CH₃OH)；¹H NMR(800MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.945(s,1H),10.922(s,1H),10.814(s,1H),8.746(s,1H),8.608(d,J＝7.2Hz,1H),8.517(d,J＝7.2Hz,1H),8.440(m,2H),8.393(d,J＝8.0Hz,1H),8.017(d,J＝2.4Hz,1H),8.006(d,J＝2.4Hz,1H),7.973(m,6H),7.691(d,J＝8.8Hz,1H),7.658(d,J＝8.0Hz,1H),7.331(m,10H),7.010(t,J＝7.5Hz,1H),6.856(t,J＝7.5Hz,1H),5.126(dd,J＝19.2Hz,J＝12.8Hz,2H),4.867(dd,J＝12.8Hz,J＝8Hz,1H),4.413(dd,J＝8.8Hz,J＝4Hz,1H),4.295(d,J＝6.4Hz,1H),3.963(s,3H),3.250(m,2H),2.732(m,4H),1.716(m,2H),1.562(m,6H),1.372(m,4H).¹³C NMR(125MHz,DMSO):δ/ppm＝172.44,172.23,171.68,169.31,164.68,160.75,149.32,142.05,140.09,139.48,136.66,136.36,135.85,134.56,130.76,130.30,129.17,128.99,128.91,128.57,128.51,128.37,128.26,127.92,124.46,122.55,121.68,121.32,120.77,119.06,118.66,114.39,113.30,113.18,111.77,66.44,53.91,53.09,52.59,52.49,38.99,38.77,32.10,30.42,28.57,27.01,26.89,22.72,22.65,21.54。

实施例12评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)的抗炎活性

使用小鼠二甲苯致炎模型评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)。化合物9和阿司匹林均一次给药,化合物9的口服剂量为0.01,0.1和1μmol/kg,阿司匹林的口服剂量为1.11mmol/kg。生理盐水为空白对照。ICR雄性小鼠(体重20±2g)随机分为生理盐水组,阿司匹林组及化合物9组,每组10只。静息一天,操作间维持温度为22℃,实验开始,口服给药,单次给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μL二甲苯,2h后乙醚麻醉断臼处死小鼠,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,求出两耳肿胀差值,作为肿胀度,肿胀度＝左耳圆片重量–右耳圆片重量。结果列入表1。表1数据说明,化合物9剂量依赖地抑制小鼠的炎症反应,最低有效剂量为0.1μmol/kg。1μmol/kg化合物9抑制小鼠的炎症反应的活性与1.11mmol/kg阿司匹林抑制小鼠的炎症反应的活性没有显著差异。可见,化合物9抑制小鼠的炎症反应的活性比阿司匹林强1110倍。显然,本发明取得了意想不到的抑制炎症的结果。

表1 化合物9对小鼠二甲苯致耳肿胀的影响

a)与生理盐水组比p<0.01；b)与生理盐水及0.01μmol/kg化合物9组比p<0.01；c)与生理盐水组及0.01μmol/kg化合物9组比p<0.01,与0.1μmol/kg化合物9组比p<0.05,与阿司匹林组比p>0.05；d)与生理盐水组比p>0.05；n＝10,实验数据统计均采用t检验。

实施例13评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)对CCl₄致急性肝损伤小鼠肝指数的影响

清洁级ICR雄性小鼠,体重20±2g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,每9只小鼠为1组,随机分为生理盐水(空白对照)组,CCl₄(模型)组,26.3μmol/kg甘草酸二铵(阳性对照4h)组,26.3μmol/kg甘草酸二铵(阳性对照8h)组,26.3μmol/kg甘草酸二铵(阳性对照12h)组,26.3μmol/kg甘草酸二铵(阳性对照22h)组,1.0μmol/kg化合物9(4h)组,1.0μmol/kg化合物9(8h)组,1.0μmol/kg化合物9(12h)组和1.0μmol/kg化合物9(22h)组,共10组。造模时除空白对照组外其余各组小鼠均灌胃给予含0.5％CCl₄的植物油溶液,剂量为10ml/kg,空白对照组小鼠灌胃给予植物油,剂量为10ml/kg。小鼠禁食不禁水,分别在造模4,8,12和22h腹腔给药。造模24h后称量体重,摘眼球取血,1000g离心10min,取上清,-20℃冰箱中保存待测ALT,AST,IL-8和TNFα。将小鼠乙醚麻醉脱颈椎处死,迅速取出肝脏称重,计算肝指数。数据见表2。肝指数＝肝脏重量(g)/体重(g)×100％。肝指数是公认的反映肝损伤的最重要的参数之一。表2的数据说明,CCl₄治疗小鼠由于急性肝损伤,肝指数显著大于生理盐水治疗小鼠的肝指数。表2的数据还说明,CCl₄治疗小鼠的急性肝损伤4h,8h和12h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵或1.0μmol/kg化合物9治疗均可得到缓解,肝指数显著下降。表2的数据进一步说明,CCl₄治疗小鼠的急性肝损伤22h之后无论用26.3μmol/kg甘草酸二铵还是用1.0μmol/kg化合物9治疗治疗都不再缓解。甘草酸二铵是公认的治疗急性肝炎的药物。由于1.0μmol/kg化合物9的疗效与26.3μmol/kg甘草酸二铵的疗效没有差异,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.3倍,体现了明显的技术进步。

表2 化合物9对CCl₄致急性肝损伤小鼠肝指数的影响

a)与生理盐水组比p<0.01；b)与CCl₄组比p<0.05；c)与CCl₄组比p<0.01；d)与CCl₄组比p>0.05；a)n＝9,实验数据统计均采用t检验。

实施例14评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)对CCl₄致急性肝损伤小鼠血液ALT和AST的影响

从实施例13小鼠获得的-20℃冰箱中保存的血清,按说明书规定的方法用谷丙转氨酶(ALT)试剂盒和谷草转氨酶(AST)试剂盒测定小鼠血液ALT和AST水平。结果见表3。

表3的数据说明,与生理盐水治疗小鼠血液中ALT相比,CCl₄治疗小鼠血液中ALT含量明显升高。CCl₄治疗4h和8h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗可降低小鼠血液中ALT含量。若CCl₄治疗12h和22h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗,则不能降低小鼠血液中ALT含量。CCl₄治疗4h,8h和12h之后用1.0μmol/kg化合物9治疗,可降低小鼠血液中ALT含量。若CCl₄治疗22h之后再用1.0μmol/kg化合物9治疗,则不能降低小鼠血液中ALT含量。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表3的数据还说明,与生理盐水治疗小鼠血液AST含量相比,CCl₄治疗小鼠血液AST含量明显升高。CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵和1.0μmol/kg化合物9治疗,均可显著降低小鼠血液中ALT含量。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表3 化合物9对小鼠血液中ALT和AST水平的影响

a)与生理盐水组比p<0.01；b)与CCl₄组比p<0.01；c)与CCl₄组比p<0.05；d)与CCl₄组比p>0.05；n＝9,实验数据统计均采用t检验。

实施例15评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)对CCl₄致急性肝损伤小鼠病理形态学的影响

接受实施例13评价的小鼠肝脏继续用于本实施例评价肝损伤状况。在距肝大叶边缘0.5cm处取一小块肝组织,放入10％福尔马林溶液中固定,做HE染色。结果见图2。生理盐水治疗小鼠的肝脏呈鲜红色,光泽较好,质地柔软而有弹性。CCl₄治疗小鼠的肝脏色泽发灰,体积明显增大,质地较硬。CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗,小鼠肝脏的大小和颜色界于生理盐水治疗小鼠和CCl₄治疗小鼠之间。CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后用1.0μmol/kg化合物9治疗,小鼠肝脏的大小和颜色接近生理盐水治疗小鼠肝脏的大小和颜色。

图2A表明,HE染色显示生理盐水治疗小鼠肝小叶结构清晰,肝细胞索排列规则,肝细胞结构及形态正常。图2B表明,CCl₄治疗小鼠肝小叶结构模糊,肝细胞索排列紊乱,细胞明显水肿,气球样变,肝小叶呈内灶状坏死。图2C表明,虽然CCl₄治疗4h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗,CCl₄导致的小鼠肝小叶结构模糊,肝细胞索排列紊乱,细胞明显水肿,气球样变,肝小叶呈内灶状坏死完全好转,但是CCl₄治疗8h,12h和22h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗,CCl₄导致的小鼠肝小叶结构模糊,肝细胞索排列紊乱,细胞明显水肿,气球样变,肝小叶呈内灶状坏死几乎没有好转。图2D表明,CCl₄治疗4h,8h和12h之后用1.0μmol/kg化合物9治疗CCl₄导致的小鼠肝小叶结构模糊,肝细胞索排列紊乱肝,细胞明显水肿,气球样变,肝小叶内灶状坏死完全好转。即使CCl₄治疗22h之后再用1.0μmol/kg化合物9治疗CCl₄导致的小鼠肝小叶结构模糊,肝细胞索排列紊乱肝,细胞明显水肿,气球样变,肝小叶内灶状坏死也明显好转。这些病理形态学的差异,加上化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,所以本发明体现了明显的技术进步。

实施例16评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)对CCl₄致急性肝损伤小鼠肝脏MDA及SOD的影响

接受实施例13评价的小鼠肝脏继续用于本实施例测定肝脏中丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平。取0.5g的肝组织，加入生理盐水制成10％的肝组织匀浆,1000g离心10min,按说明书规定的方法用MDA试剂盒和SOD试剂盒测定MDA和SOD,结果见表4。

表4的数据说明,与生理盐水治疗小鼠肝脏中MDA相比,CCl₄治疗小鼠肝脏中MDA含量明显升高。CCl₄治疗4h,8h和12h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗可降低小鼠肝脏中MDA含量升高程度。若CCl₄治疗22h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗,则不能降低小鼠肝脏中MDA含量升高程度。而CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后用1.0μmol/kg化合物9治疗,均可降低小鼠肝脏中MDA含量升高程度。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表4的数据还说明,与生理盐水治疗小鼠肝脏中SOD活性相比,CCl₄治疗小鼠组肝脏中SOD活性明显降低。虽然CCl₄治疗4h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗可恢复小鼠组肝脏中SOD活性,但是CCl₄治疗8h,12h和22h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗则不可恢复小鼠组肝脏中SOD活性。而CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后用1.0μmol/kg化合物9治疗,均恢复小鼠肝脏中SOD活性。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表4 化合物9对肝组织中MDA含量和SOD活力的影响

a)与CCl₄组比p<0.01,与生理盐水组比p>0.05；n＝9,实验数据统计均采用t检验。

实施例17评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl(9)对CCl₄致急性肝损伤小鼠IL-8及TNF-α的影响

接受实施例13小鼠肝脏继续用于本实施例测定肝脏中IL-8及TNF-α水平。取0.5g的肝组织，加入生理盐水制成10％的肝组织匀浆,1000g离心10min,按说明书规定的方法用小鼠IL-8ELISA试剂盒和小鼠TNF-αELISA试剂盒测定IL-8及TNF-α水平,结果见表5。

表5的数据说明,与生理盐水治疗小鼠肝脏中IL-8相比,CCl₄治疗小鼠组肝脏中IL-8含量明显升高。CCl₄治疗4h,8h和12h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵和1.0μmol/kg化合物9治疗均可降低小鼠肝脏中IL-8含量。若CCl₄治疗22h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵和1.0μmol/kg化合物9治疗,则均不能降低小鼠肝脏中IL-8含量。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表5的数据还说明,与生理盐水治疗小鼠肝脏中TNF-α相比,CCl₄治疗小鼠肝脏中TNF-α含量明显升高。CCl₄治疗4h和8h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵和1.0μmol/kg化合物9治疗只能有效地降低小鼠肝脏中TNF-α含量。而CCl₄治疗12h和22h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵和1.0μmol/kg化合物9治疗都不能降低小鼠肝脏中TNF-α含量。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表5 化合物9对肝脏中IL-8及TNF-α水平的影响

a)与生理盐水组比p<0.01；b)与CCl₄组比p<0.05,与生理盐水组比p>0.05；c)与生理盐水组及CCl₄组比p>0.05；n＝9,实验数据统计均采用t检验。

从实施例13小鼠获得的-20℃冰箱中保存的血清,按说明书规定的方法用小鼠IL-8ELISA试剂盒和小鼠TNF-αELISA试剂盒测定IL-8及TNF-α水平。结果见表6。

表6的数据说明,与生理盐水治疗小鼠血液中IL-8相比,CCl₄治疗小鼠血液中IL-8含量明显升高。CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵和1.0μmol/kg化合物9治疗均可降低小鼠血液中IL-8含量。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表6的数据还说明,与生理盐水治疗小鼠血液中TNF-α相比,CCl₄治疗小鼠血液中TNF-α含量明显升高。CCl₄治疗4h之后用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗能明显降低小鼠血液中TNF-α含量。若CCl₄治疗8h,12h和22h之后再用26.3μmol/kg甘草酸二铵治疗,则不能降低小鼠血液中IL-8含量。而CCl₄治疗4h,8h,12h和22h之后用1.0μmol/kg化合物9治疗则均能明显降低小鼠血液中TNF-α含量。由于化合物9的剂量比甘草酸二铵的剂量低26.1倍,所以化合物9的活性比甘草酸二铵的活性强26.1倍,体现了明显的技术进步。

表6 化合物9对小鼠血液IL-8及TNF-α水平的影响

a)与生理盐水组比p<0.01；b)与CCl₄组比p<0.05,与生理盐水组比p>0.05；c)与生理盐水组比p<0.05,与CCl₄组比p>0.05；n＝9,实验数据统计均采用t检验。

Claims

1.下式结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl

2.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl的制备方法，该方法包括:

3.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基)苯基-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Lys-Lys-OBzl在制备抗肝炎药物中的应用。