CN106540175A - 一种莪术油对白血病细胞株治疗方法 - Google Patents
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Abstract
一种莪术油对白血病细胞株治疗方法，取HL-60、K562细胞传代接种于96孔板，同时每孔分别加入不同浓度的莪术油液100μL(终浓度分别为400、200、100、50mg/L)；空白对照组加入100μL含体积分数为1%吐温80的RPMI-1640培养液。药物和细胞作用24、48、72h后，每孔加入四氮唑化物(MTT)10μL(5g/L)，37℃孵育后于570nm波长处用酶联免疫检测仪测其D值，计算细胞生长抑制率(ＲＩ)。
Description
技术领域
本发明涉及一种莪术油对白血病细胞株治疗方法，具体地说是一种莪术油对白血病细胞株治疗方法。
背景技术
目前公知的莪术油在实体瘤的治疗中已取得较满意的效果，近年来也有用莪术油治疗白血病的临床报道，但至今莪术油对白血病的作用机理尚不清楚。本研究通过观察在不同药物浓度和不同作用时间条件下，莪术油对白血病细胞株HL-60和K562细胞的抑制作用，比较莪术油对不同白血病细胞株的敏感性。
发明内容
诊断标准：
1.材料 A. 主要试剂，莪术油：广东省中医院制剂室提供；吐温80：美国Sigma公司产品；RPMI-1640培养液：德国Gibco公司产品；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品；四氮唑化物(MTT)：美国Sigma公司提供。主要实验仪器；超净工作台：北京伟达净化厂生产；二氧化碳培养箱：美国NAPCO公司产品；恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器厂生产；倒置显微镜：日本NIKON公司产品；超低温冰箱：日本SANYO公司生产；电子分析天平：德国DENNER公司产品；96孔培养板：美国Costar公司产品；5810R离心机：德国EPPENDORF公司产品。主要试剂配制；RPMI-1640培养液：取RPMI-1640粉剂104g加入三蒸水1000mL,NaHCO３ 20g，Hepes 27g，测pH值为73，滤过除菌分装；新生牛血清：56℃水浴30min灭活后分装，-20℃保存；5g/L MTT染液：200mg MTT充分溶解于40mL 001mol・L－１磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)，滤过除菌后4℃避光保存；含体积分数为1%吐温80的RPMI-1640培养液：取99mL RPMI-1640培养液，加入1mL吐温80，滤过除菌，4℃避光保存备用；莪术油液：取08mL1g/L莪术油，10mL吐温80，9892mL RPMI-1640培养液，配成800mg/L莪术油(含1%吐温80)。再依次配成400、200、100mg/L莪术油(均含1%吐温80)，细胞株；HL-60、K562细胞，购自武汉大学中国典型物保藏中心，体外培养于含体积分数为10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃、体积分数为5%的CO２培养箱中培养。 B. 方法:四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)原理：活细胞线粒体中存在与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)相关的脱氢酶，可将黄色的四氮唑化物(MTT)还原为不溶性的蓝紫色的甲瓒(Formazan)，死细胞中此酶消失，MTT不被还原。用二甲基亚砜(DMSO)溶解Formazan后可用酶标仪在570nm波长处检测光密度(Ｄ）。取对数生长期的HL-60、K562细胞，传代接种于96孔板，每孔100μL (５×１０４/孔)，同时每孔分别加入不同浓度的莪术油液100μL (终浓度分别为400、200、100、50mg/L)；空白对照组加入100μL含体积分数为1%吐温80的RPMI-1640培养液。每一浓度设3个复孔。药物和细胞作用24、48、72h后，每孔加入MTT 10μL(5g/L)， 37℃孵育4h， 2000r/min离心5min，弃上清，每孔加入DMSO 100μL，37℃空气浴摇床振荡20min后于570nm波长处用酶联免疫检测仪测其D值，计算细胞生长抑制率 (RI）。ＲＩ＝（１－Ｄ加药组/Ｄ对照组）×１００％。实验重复3次。 C. 统计方法：数据分析采用SPSS 80统计软件处理，采用４×３×２析因分析。 D. 结果；不同浓度、作用时间的莪术油对HL-60、K562细胞的抑制率。MTT结果显示，不同浓度的莪术油对HL-60、K562细胞的生长均具有抑制作用。莪术油对HL-60、K562细胞的生长抑制作用随着作用时间的延长明显增加，24、48、72h的抑制率之间比较有显著性差异(Ｐ＜001)；莪术油对HL-60、K562细胞的生长抑制作用随着其浓度的增加而增加，400、200、100、50mg/L的抑制率之间比较有显著性差异(Ｐ＜001)。但莪术油对HL-60、K562两种细胞的生长抑制作用比较无显著性差异(Ｐ＞005)。
发明目的：莪术油是从中药莪术中提取的有效成分。它具有莪术活血祛瘀、消积止痛的功效，是能进行静脉注射的新型制剂。在众多抗癌中药中，莪术的研究开展最早，研究最多。有研究显示，莪术油除具有细胞毒作用外，还具有免疫调节功能，能诱导淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)产生。莪术油含有β榄香烯、莪术醇、莪术二酮等多种抗癌成分，具有增强免疫功能的作用，能升高白细胞计数，对骨髓正常造血细胞有保护作用。尽管临床有莪术油治疗小儿急性白血病取得较好疗效的报道，但该药对白血病细胞(CFUL)的作用机理至今未明。
技术方案：方法 取HL-60、K562细胞传代接种于96孔板，同时每孔分别加入不同浓度的莪术油液100μL(终浓度分别为400、200、100、50mg/L)；空白对照组加入100μL含体积分数为1%吐温80的RPMI-1640培养液。药物和细胞作用24、48、72h后，每孔加入四氮唑化物(MTT)10μL(5g/L)，37℃孵育后于570nm波长处用酶联免疫检测仪测其D值，计算细胞生长抑制率(ＲＩ)。
发明有益效果：莪术油对HL-60、K562细胞的生长抑制作用随着作用时间的延长明显增加，24、48、72h的抑制率之间差异有显著性(Ｐ＜001)；莪术油对HL-60、K562细胞的生长抑制作用随着药物浓度的增加而增加，400、200、100、50mg/L的抑制率比较有显著性差异(Ｐ＜001)。但莪术油对HL-60、K562两种细胞的生长抑制作用比较无显著性差异(Ｐ＞005)。莪术油对HL-60、K562细胞的生长有抑制作用，且其抑制作用与药物浓度和作用时间相关。
最佳实施方式：对患者进行干预治疗。
创新之处：本项新型发明专利涉及一种降低2型糖尿病合并冠心病患者sVCAM-1的方法，莪术油对HL60和K562细胞有良好的生长抑制作用，且随着莪术油药物浓度增加和对细胞作用时间的增加，抑制率明显升高。因此推测，莪术油治疗白血病的作用机理可能在于抑制白血病细胞的生长。由此认为临床使用莪术油注射液治疗白血病，既可抑杀白血病细胞，又可保护正常造血干细胞的损伤，可作为自体造血干细胞移植体外净化药物，使移植物体外净化更彻底。
Claims (1)
1.一种莪术油对白血病细胞株治疗方法，取HL-60、K562细胞传代接种于96孔板，同时每孔分别加入不同浓度的莪术油液100μL(终浓度分别为400、200、100、50mg/L)；对照组加入100μL含体积分数为1%吐温80的RPMI-1640培养液;药物和细胞作用24、48、72h后，每孔加入四氮唑化物(MTT)10μL(5g/L)，37℃孵育后于570nm波长处用酶联免疫检测仪测其D值，计算细胞生长抑制率(ＲＩ)。
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