CN106539786A - 一种组胺h1受体拮抗剂及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菊科植物中倍半萜内酯类化合物作用靶点的发现和应用，具体地说是倍半萜内酯类化合物沼菊素的作用靶点的发现和治疗炎症药物中的应用。本发明通过采用无标记细胞靶点药理学技术，首先筛选了亚贡叶中的化合物对组胺H1受体的拮抗活性，从中发现沼菊素具有较强的H1受体拮抗活性。进一步量效关系研究表明沼菊素剂量依赖性地拮抗组胺引起的DMR响应信号，表明沼菊素为组胺H1受体拮抗剂。所述组胺H1受体拮抗剂以沼菊素及沼菊素药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分。目前研究表明H1受体与变应性炎症反应如过敏、哮喘、水肿等疾病相关，据此可为相关疾病提供作用靶点明确的高效新配体。

Description

一种组胺H1受体拮抗剂及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于天然药物活性成分作用机制的发现及应用领域，具体涉及一种组胺H1受体拮抗剂及其筛选方法和应用，所述组胺H1受体拮抗剂作为药物应用于预防和/治疗通过拮抗组胺H1受体治疗的疾病。

背景技术

亚贡Smallanthus sonchifolius(Poeppig and Endlicher)H.Robinson为菊科Compositae菊薯属Smallanthus植物^[1]，我国又称其为菊薯、雅龙果或雪莲果。亚贡原产于南美的安第斯地区，从厄瓜多尔到西北的阿根廷均有分布，现已在日本、新西兰、捷克和巴西等地广泛种植，我国台湾、云南、海南、湖南、辽宁等地已引种成功。亚贡作为药食兼用的品种，其根茎味甜可以作为水果生吃，是印第安人传统食品，其叶药用主要用于治疗糖尿病。化学研究表明亚贡叶中主要含有单萜、倍半萜、二萜及绿原酸衍生物等成分^[2-4]，其中的倍半萜内酯沼菊素为其主要成分^[4]。有关亚贡叶药理活性的报道主要集中在降血糖^[5]、抗炎^[4]及抗癌^[6,7]等方面。

应用无标记细胞靶点药理学技术^[8,9]，前期研究中我们建立了组胺H1受体拮抗剂的筛选模型，并应用该模型筛选了天然抗炎药物有效成分对组胺H1受体的拮抗活性，从中发现亚贡叶中的一种化学成分显示了组胺H1受体拮抗活性。本发明采用无标记细胞靶点药理学技术对亚贡叶中分离得到的化学成分的H1受体拮抗活性进行了研究。

参考文献：

[1]Grau A,Rea J.Yacon.Smallanthus sonchifolius(Poep.&Endl.)H.Robinson.In:Hermann M,Heller J,editors.Andean rootsand tubers:Ahipa,arracacha,macaand yacon.Rome:IPGRI,1997.p.199-242.

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发明内容

本发明涉及一种倍半萜内酯类化合物沼菊素作用靶点的发现及此类化合物作为药物的应用，目的之一是提供沼菊素的作用靶点为H1受体；目的之二是提供该化合物在临床上的应用范围。

本发明的技术方案为：

所述H1受体拮抗剂为沼菊素以及沼菊素对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分。

沼菊素及其衍生物化学结构如下：

所述H1受体拮抗剂是以沼菊素以及沼菊素药学上可接受的盐中的一种或两种以上的活性成分，其中还可添加药学上可接受的载体或赋形剂，如：淀粉、氯化钠、微晶纤维素、山梨酸和/或甘露醇等。该组合物的给药方式可以是但不限于经静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、局部注射等方式给药，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、凝胶剂、贴片、膏剂等，其中优选注射液、冻干粉针剂、片剂和胶囊剂。

本发明所述的倍半萜内酯类化合物在制备预防和/或治疗炎症、过敏性哮喘、过敏性皮炎等疾病药物中的应用，其中倍半萜内酯类化合物为沼菊素以及沼菊素对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上。

所述药物是以沼菊素及沼菊素对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分，其中还可添加有药学上可接受的载体或赋形剂。

所述H1受体拮抗剂是以沼菊素以及沼菊素药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分，其中还可添加药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的优点和有益效果为：

本发明中的沼菊素及其衍生物作用于H1受体，此受体为G蛋白偶联受体，H1受体与变应性炎症反应如过敏、哮喘、水肿相关，根据靶点与疾病的相关性，可以拓宽此化合物的临床应用范围。

附图说明

图1.组胺H1受体拮抗剂的DMR信号及组胺受体拮抗剂预处后组胺引起的DMR信号：

a.不同浓度的阿司咪唑处理A-431细胞后引起的DMR信号；

b.不同浓度的阿司咪唑预处理A-431细胞后，再加入组胺(16μM)引起的DMR信号；

c.不同浓度的氯雷他定处理A-431细胞后引起的DMR信号；

d.不同浓度的氯雷他定预处理A-431细胞后，再加入组胺(16μM)引起的DMR信号

图2.亚贡叶中化合物(32μM)预处理后组胺(16μM)在A-431细胞上引起的最大DMR响应。

图3.亚贡叶中化合物预处剂量与16μM组胺引起的DMR信号的量效关系曲线。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。

本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得；组胺、阿司咪唑、氯雷他定购自Sigma公司；亚贡叶中的化合物由辽宁中医药大学窦德强教授提供；DMSO购买自Bio Basic公司；HBSS和McCoy’s5A培养液购自Gibco公司；384孔生物感应器微型板购自Corning公司；A-431人表皮癌细胞从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库获得(中国，上海)。

实施例1亚贡叶中的化合物对组胺H1受体拮抗活性的筛选

1.方法

1.1细胞培养

A-431人表皮癌细胞从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库获得(中国，上海)。A-431细胞用含有10％的胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、100μg/ml硫酸链霉素的DMEM培养基(GIBCO，货号12800017，含D-Glucose 4.5g/L，添加NaHCO₃1.5g/L)，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

1.2亚贡叶中的化合物对组胺H1受体拮抗活性的筛选

A-431细胞以2×10⁴个/孔的密度接种到384孔生物感应器微型板中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h，然后用不含FBS的培养基饥饿处理24h，检测前用HBSS缓冲液洗2次，再在每孔中加入30μL HBSS缓冲液，置于系统上平衡孵育1h。平衡后首先在系统上建立一个2min的基线，然后将组胺、阿司咪唑、氯雷他定及从亚贡叶中分离得到的化学成分(化合物编号及结构见附表1)分别加入已接种A-431细胞的384孔生物感应器微型板中，在系统上监测30min，得化合物的DMR响应曲线。然后加入组胺(16μM)继续监测30min，得组胺DMR响应曲线。通过监测组胺引起的DMR响应信号是否被预处理时加入的待测化合物所抑制来判断化合物对组胺H1受体的拮抗活性。

1.3数据分析

DMR数据由Epic Imager软件(康宁公司，美国)记录，并经Imager Beta 3.7软件(康宁公司，美国)处理得到。采用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism软件进行统计分析。所有的DMR信号都经空白校正得到。所有数据来自2次独立实验，每次4个重复。

2.结果

2.1组胺H1受体拮抗剂对组胺引起的DMR响应信号的影响

分别以不同浓度(最高工作浓度1μM，2倍稀释，9个浓度梯度)的组胺H1受体拮抗剂阿司咪唑或氯雷他定处理A-431细胞后，两者都不引起DMR响应信号，见图1a、1c，再次加入16μM组胺(EC₈₀)，组胺引起的DMR响应信号被抑制，且拮抗剂的浓度越高抑制活性越强，呈剂量依赖性，见图1b、1d。由此得出，组胺H1受体拮抗剂特征DMR谱为拮抗剂本身不引起DMR响应信号，而拮抗组胺引起的DMR响应信号。

2.2亚贡叶中的化合物对组胺引起的DMR响应信号的影响

采用无标记细胞靶点药理学技术对从亚贡叶中分离得到的13个化合物的组胺H1受体拮抗活性进行了筛选。首先，将10μL待测化合物(最高工作浓度64μM，2倍稀释，2个浓度梯度)加入已接种A-431细胞的384孔生物感应器微型板中，在系统上监测30min，然后加入10μL组胺(16μM)继续监测30min，根据第二步加入组胺后30min内引起的最大DMR响应信号被拮抗程度来判断待测化合物对组胺H1受体拮抗活性。结果如图2所示，在筛选的亚贡叶的13个化学成分中沼菊素(Enhydrin)、YG-4、YG-6、YG-8在32μM浓度下能够明显抑制组胺引起的DMR响应信号，为对照组预处理后再加入组胺所引起的DMR响应信号的80％以下。由此推断沼菊素、YG-4、YG-6、YG-8对组胺H1受体具有拮抗活性，且沼菊素的拮抗活性最强。

实施例2沼菊素对组胺H1受体拮抗活性

采用无标记细胞靶点药理学技术对活性筛选中H1受体拮抗活性较强的化合物沼菊素、YG-4、YG-6、YG-8进行了进一步量效关系考察。首先，将10μL待测化合物(最高工作浓度64μM，2倍稀释，7个浓度梯度)加入已接种A-431细胞的384孔生物感应器微型板中，在系统上监测30min，然后加入10μL组胺(16μM)继续监测30min。以化合物的对数剂量对第二步加入组胺后30min内引起的最大DMR响应信号作图，结果如图3。从图中可以看出，沼菊素预处理剂量与再次加入组胺引起的DMR响应信号呈剂量依赖性，即沼菊素浓度越高抑制活性越强。由此推断，沼菊素为组胺H1受体拮抗剂。

附表1.亚贡叶中化学成分编号和结构式对照表

Claims (6)

1.一种组胺H1受体拮抗剂，其特征在于：所述组胺H1受体拮抗剂为沼菊素，具有如下结构式：

或其药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分。

2.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1所述组胺H1受体拮抗剂和药学上可接受的载体或赋形剂。

3.一种权利要求1所述组胺H1受体拮抗剂的筛选方法，其特征在于：首先监测待筛选化合物预处理人表皮癌细胞(A-431细胞)后所引起的DMR响应信号，如果待筛选化合物不引起DMR响应信号，则继续加入组胺，监测组胺所引起的DMR响应信号是否被抑制，由此判断待筛选化合物对组胺H1受体的拮抗活性。

4.一种权利要求1所述组胺H1受体拮抗剂作为药物的应用。

5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：应用于预防和/治疗通过拮抗组胺H1受体治疗的疾病。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：所述疾病为炎症、过敏性哮喘、过敏性皮炎等。