CN112691105A - 甲基莲心碱抑制SARS-CoV及SARS-CoV-2感染的新用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了甲基莲心碱在抑制SARS‑CoV及SARS‑CoV‑2感染方面的应用，属于天然药物技术领域。实验结果显示甲基莲心碱(Nef)能够安全有效地抑制SARS‑CoV及SARS‑CoV‑2假病毒颗粒对宿主细胞的感染。随着甲基莲心碱浓度的增加，假病毒颗粒对细胞的感染率逐渐降低。甲基莲心碱作用于SARS‑CoV假病毒的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.43μM，作用于SARS‑CoV‑2假病毒的IC₅₀为0.36μM。另外，CCK8结果显示甲基莲心碱的半数毒性浓度(CC₅₀)为29.17μM，经计算甲基莲心碱的选择性指数(SI＝CC₅₀/IC₅₀)分别为67.84和81.03。通过不同时间点给药和VSV‑G假病毒排除实验确认了甲基莲心碱作用于SARS‑CoV及SARS‑CoV‑2的侵染阶段。本研究证明了甲基莲心碱可作为一种SARS‑CoV及SARS‑CoV‑2感染的候选抑制剂，展示了其作为临床治疗药物及制剂的新用途。

Description

甲基莲心碱抑制SARS-CoV及SARS-CoV-2感染的新用途

技术领域

本发明涉及天然药物技术领域，具体提供了甲基莲心碱作为一种抑制剂在抗SARS-CoV及SARS-CoV-2感染中的应用。

背景技术

莲子心(Lien Tze Hsin)是我国常用的中药材之一，是睡莲科莲属植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)成熟种子的胚芽，最早见于《食性本草》。莲子心性寒、味苦，具有清热、固精、安神、强心等功效，已被广泛应用于高热烦躁、神经紊乱、抗纤维化、高血压、心律失常等疾病的中医治疗中。药理研究表明莲子心的主要成分为生物碱，如莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱等。

甲基莲心碱(Neferine)是一种双苄基异喹啉类生物碱，分子式为C₃₈H₄₄N₂O₆，分子量为624.778g/mol，其化学结构式如下。

药理学研究表明甲基莲心碱具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、扩血管、降血压、抑制血小板聚集、抗心率失常以及抗肿瘤等多重作用。在抗癌方面，有研究发现其可通过与细胞周期阻滞、细胞凋亡、内质网应激、细胞自噬等相关的途径，实现多种抗癌作用。此外，也有研究报道甲基莲心碱具有逆转多药耐药的作用，能够增强化疗药物如顺铂的抗肿瘤作用。在抗病毒方面，有研究表明甲基莲心碱具有较强的抗艾滋病病毒活性，半数有效浓度(EC₅₀)＜0.81μg/mL，半数毒性浓度(CC₅₀)约为8μg/mL。在抗糖尿病方面，有研究表明甲基莲心碱可以增强胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性，对实验性糖尿病及肥胖大鼠有一定的降低血糖及调节血脂的作用，还可通过降低颈上神经节中趋化因子受体5(CCR5)和趋化因子配体(CCL5)的表达，进而调节糖尿病心血管自主神经并发症。

冠状病毒是一类具有包膜的单股正链RNA病毒，在系统分类上属套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属。历史上已知的能够感染人的冠状病毒有七种，其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1四种只造成轻度或中度的感冒症状。迄今为止，SARS-CoV-2的全球性感染仍未得到完全有效的遏制，临床上也尚无针对性的特效药，而多以对症治疗、预防干预为主。有研究表明，在重症新冠肺炎患者中，比较有效的是瑞德西韦和氯喹，但需要更多的临床数据支持。而对于普通新冠肺炎患者，连花清瘟胶囊被证明是有效的。作为一种高传染性病毒，新型冠状病毒SARS-CoV-2具有一定突变性、潜在宿主多、潜伏期长等特点，另外很多特性尚待阐明。因此，目前迫切需要尽快找到更多安全有效的抗新型冠状病毒的候选药物。

本发明人在科学实验中发现，甲基莲心碱对SARS-CoV-2假病毒感染具有显著的抑制作用，且在作用浓度范围内不具有细胞毒性，此外，还发现甲基莲心碱对 SARS-CoV假病毒的感染同样具有显著的抑制作用，其具体作用机制正在研究中。本研究发现将为SARS-CoV及SARS-CoV-2的药物开发及临床治疗提供新的思路和方案。

因此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供甲基莲心碱作为SARS-CoV及SARS-CoV-2感染的抑制剂的应用。本发明采用不同浓度的甲基莲心碱作用于HEK293的人血管紧张素转换酶2 (hACE2)稳转细胞系(HEK293/hACE2)，然后利用SARS-CoV及SARS-CoV-2 假病毒感染细胞，发现病毒颗粒的感染率随甲基莲心碱浓度的增加而下降。甲基莲心碱作用于SARS-CoV假病毒的IC₅₀为0.43μM，作用于SARS-CoV-2假病毒的IC₅₀为 0.36μM。另外，CCK8结果显示甲基莲心碱的CC₅₀为29.17μM。针对SARS-CoV及 SARS-CoV-2假病毒，甲基莲心碱的选择性指数(SI＝CC₅₀/IC₅₀)分别为67.84和81.03。通过不同时间点给药和VSV-G假病毒排除实验确认了甲基莲心碱作用于SARS-CoV 及SARS-CoV-2的侵染阶段。此研究可为抑制SARS-CoV及SARS-CoV-2的感染提供新途径。

本发明的具体技术方案如下：

一、构建SARS-CoV、SARS-CoV-2 S蛋白及VSV G蛋白假病毒系统

利用慢病毒三质粒包装系统构建SARS-CoV、SARS-CoV-2 S蛋白及VSV G蛋白假病毒系统，该假病毒系统以SARS-CoV或SARS-CoV-2 spike蛋白或VSV G蛋白为表面膜蛋白，以萤火虫荧光素酶为报告基因。

二、甲基莲心碱全程给药以研究其对SARS-CoV、SARS-CoV-2、VSV-G假病毒感染HEK293/hACE2细胞的抑制作用

将HEK293/hACE2细胞与不同浓度的甲基莲心碱在37℃孵育0.5h，之后换液，细胞感染与不同浓度的甲基莲心碱混合的SARS-CoV或SARS-CoV-2或VSV-G假病毒，感染过程中甲基莲心碱一直存在。最后通过检测细胞中荧光素酶的活性来判断假病毒颗粒的感染情况。

三、CCK8法检测甲基莲心碱对HEK293/hACE2细胞的毒性

将HEK293/hACE2细胞与不同浓度的甲基莲心碱进行孵育，孵育条件与 SARS-CoV或SARS-CoV-2假病毒孵育条件保持一致。通过CCK8法检测细胞在波长为450nm处的吸光值。

四、甲基莲心碱不同时间点给药以研究其抑制SARS-CoV-2假病毒感染 HEK293/hACE2细胞的具体阶段

将HEK293/hACE2细胞接种于96孔板中，过夜贴壁后，按照以下三种方式进行给药。第一组为感染前给药(Pre-treatment)：将HEK293/hACE2细胞先与不同浓度的甲基莲心碱孵育再感染SARS-CoV-2假病毒；第二组为感染中给药(Co-treatment)：将HEK293/hACE2细胞与不同浓度的甲基莲心碱及SARS-CoV-2假病毒共同孵育；第三组为感染后给药(Post-treatment)：将HEK293/hACE2细胞先感染SARS-CoV-2 假病毒再与不同浓度的甲基莲心碱进行孵育。之后细胞更换为新鲜培养液并在37℃培养一段时间后，通过检测细胞中荧光素酶的活性来判断假病毒颗粒的感染情况。

附图说明

图1为甲基莲心碱对SARS-CoV假病毒感染HEK293/hACE2细胞的抑制效果。

图2为甲基莲心碱对SARS-CoV-2假病毒感染HEK293/hACE2细胞的抑制效果。

图3为甲基莲心碱对VSV-G假病毒感染HEK293/hACE2细胞的作用。

图4为甲基莲心碱对HEK293/hACE2的细胞毒性。

图5为甲基莲心碱不同时间点给药对SARS-CoV-2假病毒感染HEK293/hACE2 细胞的抑制效果

具体实施方式

1)构建SARS-CoV、SARS-CoV-2、VSV-G假病毒系统

利用慢病毒三质粒包装系统构建SARS-CoV、SARS-CoV-2及VSV-G假病毒系统。该假病毒系统以SARS-CoV或SARS-CoV-2spike蛋白或VSV G蛋白为表面膜蛋白，以萤火虫荧光素酶为报告基因。利用GenJet Ver.II转染试剂将spike包膜质粒或 G蛋白包膜质粒、包装质粒psPAX2及含荧光素酶报告基因的HIV质粒共转染到 HEK293T细胞中，12h后更换新鲜培养液。在转染24、36、48、60h后收集上清培养液，并将其在800×g下离心5min，然后经过0.45μm的滤膜过滤，除去细胞碎片，得到的假病毒分装保存于-80℃。

2)甲基莲心碱全程给药以研究其对SARS-CoV、SARS-CoV-2、VSV-G假病毒感染HEK293/hACE2细胞的抑制作用

将生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的对数生长期HEK293/hACE2细胞按照1×10⁴个/孔的密度均匀接种于96孔板中，过夜贴壁后，将细胞与不同浓度的甲基莲心碱在37℃孵育0.5h，之后换液，细胞感染与不同浓度甲基莲心碱混合的SARS-CoV或SARS-CoV-2或VSV-G假病毒，感染过程中甲基莲心碱一直存在，继续培养6h后更换新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养36h。更换新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养12h后检测荧光素酶活性。

3)CCK8法检测甲基莲心碱对HEK293/hACE2细胞的毒性

将生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的对数生长期HEK293/hACE2细胞按照1×10⁴个/孔的密度均匀接种于96孔板中，过夜贴壁后，将细胞与不同浓度的甲基莲心碱在37℃孵育6.5h。更换新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养36 h后再次更换新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养12h后利用CCK8检测细胞活性(与给药过程保持完全一致)。具体操作如下，在避光条件下，细胞更换含10％CCK8试剂的DMEM培养液后在37℃避光孵育1h。只加含10％CCK8试剂的DMEM培养液的孔作为空白对照。通过酶标仪检测细胞在波长为450nm处的吸光值。

4)甲基莲心碱不同时间点给药以研究其抑制SARS-CoV-2假病毒感染HEK293/hACE2 细胞的具体阶段

将生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的对数生长期HEK293/hACE2细胞按照1×10⁴个/孔的密度均匀接种于96孔板中，过夜贴壁。将甲基莲心碱的给药方式分为三组：第一组为感染前给药(Pre-treatment)：将HEK293/hACE2细胞先与不同浓度的甲基莲心碱在37℃孵育3h，用新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液清洗后再感染SARS-CoV-2假病毒并在37℃孵育3h；第二组为感染中给药(Co-treatment)：将HEK293/hACE2细胞与不同浓度的甲基莲心碱及SARS-CoV-2假病毒在37℃共孵育3h；第三组为感染后给药(Post-treatment)：将HEK293/hACE2细胞先感染 SARS-CoV-2假病毒并在37℃孵育3h，用新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液清洗一遍后再与不同浓度的甲基莲心碱在37℃孵育3h。之后将以上三组细胞再次清洗后更换新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养36h。最后再次更换新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养12h后检测荧光素酶活性。

5)荧光素酶活性检测

取出细胞培养板在室温平衡10min，每孔加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，室温孵育10min，使用化学发光免疫分析仪进行化学发光检测。

Claims (8)

1.甲基莲心碱或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物在抑制SARS-CoV感染中的应用。

2.甲基莲心碱或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物在抑制SARS-CoV-2感染中的应用。

3.根据权利要求1～2所述，其特征在于，所述药学上可接受的盐可为其盐酸盐、高氯酸盐、甲磺酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐等形式的无机酸或有机酸的碱式盐。

4.根据权利要求1～2所述，其特征在于，所述药学上可接受的溶剂合物为水合物或DMSO溶剂合物。

5.一种用于抑制SARS-CoV或SARS-CoV-2感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由权利要求1～2所述的甲基莲心碱或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

6.根据权利要求5所述，其特征在于，所述药学上可接受的辅料或辅助性成分为稀释剂、增溶剂、潜溶剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、矫味剂、抗氧剂、粘合剂、吸收剂、湿润剂、缓冲剂、交联剂等。

7.根据权利要求5所述，其特征在于，所述药物组合物制备为丸剂、片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、滴丸、滴剂、喷雾剂、注射液、混悬液等临床上常用的剂型。

8.根据权利要求5、7任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，将甲基莲心碱及其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合来制备。

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