CN106536557B - 结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，且涉及免疫学，尤其涉及人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子。人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子尤其用于医学治疗和/或用于人Vγ9Vδ2 T细胞的检测，其中人Vγ9Vδ2 T细胞是可调节的。

Description

结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白
技术领域
本发明属于医药领域，且涉及免疫学。本发明涉及结合T细胞的免疫球蛋白。本发明尤其涉及结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白。本发明提供结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白分子，例如抗体、单链抗体或单域抗体，其中所述人Vγ9Vδ2 T细胞是可调节的。
背景技术
成人中的大多数γδ外周血淋巴细胞(PBLs)表达包含Vγ9区和Vδ2区的T细胞受体(TCR)。Vγ9Vδ2 T细胞可与广泛的病原体和肿瘤细胞反应。这种广泛的反应性被理解为由能够以TCR依赖性方式特异性地激活该T细胞亚群的磷酸抗原赋予。Vγ9Vδ2 T细胞的广谱抗微生物和抗肿瘤反应性表明直接参与癌症和感染的免疫控制。除了抗击疾病之外，在一些疾病或医学治疗中Vγ9Vδ2 T细胞可能被过度刺激或无意激活。
因此，因为可激活Vγ9Vδ2 T细胞的试剂可以促进Vγ9Vδ2 T细胞对病原体或感染的细胞或癌症的反应性，所以这些试剂可用于治疗感染或癌症。此外，阻断Vγ9Vδ2 T细胞激活的试剂可用于其中有利于减少Vγ9Vδ2 T细胞激活的疾病或医学治疗，即其中Vγ9Vδ2T细胞被过度刺激或无意激活。最后，可结合Vγ9Vδ2 T细胞但对Vγ9Vδ2 T细胞(磷酸抗原)激活没有作用的试剂可用于标记细胞，例如用于筛选或鉴定Vγ9Vδ2 T细胞。因此，本领域需要提供可结合Vγ9Vδ2 T细胞的试剂，以及可以阻断Vγ9Vδ2 T细胞的磷酸抗原激活或可激活Vγ9Vδ2 T细胞的试剂。
发明概述
本发明现提供可结合Vγ9Vδ2 T细胞的新试剂。所提供的试剂为免疫球蛋白。所提供的免疫球蛋白结合Vγ9Vδ2 T细胞受体。意外地发现，本发明提供的免疫球蛋白具有实质的序列同一性。因此，在本发明的第一方面，提供了结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白分子，其包含CDR 1区和CDR 2区，其中，CDR1区包含与SEQ ID NO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和其中CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中，优选地免疫球蛋白分子为单域抗体。
此外，该免疫球蛋白包含CDR3区，其中，CDR3区有助于Vγ9Vδ2 T细胞受体结合并且可对免疫球蛋白分子的作用具有影响。在不受理论约束的情况下，这可以使CDR3序列涉及免疫球蛋白分子的功能，即调控类型，例如阻断Vγ9Vδ2 T细胞的激活、诱导Vγ9Vδ2 T细胞的激活或既不阻断也不诱导Vγ9Vδ2 T细胞的激活。本发明的免疫球蛋白尤其用于医学治疗和用于涉及Vγ9Vδ2 T细胞的测定中。
优选地，本发明的免疫球蛋白分子包含CDR3区，其中CDR3区包含选自氨基酸序列SEQ ID NO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的组的氨基酸序列。如下文详细讨论的，提供这些与CDR1和CDR2序列结合的CDR3区用于结合和功能。
附图说明
图1：VHH序列的比对，其中显示框架区(1、2、3和4)以及CDR1、CDR2和CDR3。还显示每个VHH的编码(即5C7是VHH 5C7的序列)。
图2：VHH 5E7和VHH 6F6不激活Vγ9Vδ2 T细胞。数据通过健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞与阳性对照(表达磷酸抗原(pAg+)的HeLa细胞)比较来表明激活标记CD25、促炎性细胞因子IFN-γ和细胞毒性分子颗粒酶B的相对表达。
图3：VHH 5E7中和了健康供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞的磷酸抗原诱导的激活。一个典型的实例证明了使用VHH 5E7磷酸化Ag诱导的Vγ9Vδ2 T细胞激活的剂量依赖性中和，而非特异性VHH(阴性对照)不能中和磷酸化Ag诱导的Vγ9Vδ2 T细胞激活。纵轴表示通过CD25表达评估Vγ9Vδ2 T细胞的激活，横轴表示不同的VHH浓度。使用表达磷酸抗原的HeLa细胞进行Vγ9Vδ2 T细胞刺激，表达磷酸抗原的HeLa细胞通过用递增剂量的氨基双膦酸帕米膦酸盐(aminobisphosphonate pamidronate)(其导致HeLa细胞的磷酸抗原表达水平增加)预处理HeLa细胞而产生。
图4：Vγ9Vδ2 TCR特异性VHH能够在健康供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞中诱导激活和细胞因子产生。数据通过健康供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞与阳性对照(表达磷酸抗原(pAg+)的HeLa细胞；标准化为1)和阴性对照VHH比较来表明激活标记CD25和促炎性细胞因子IFN-γ的相对表达。每个条代表单个Vγ9Vδ2 TCR特异性VHH；在Vγ9Vδ2 T细胞中单个VHH在诱导激活和细胞因子产生的能力方面不同。
图5：健康供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞的剂量依赖性激活。数据表示用递增浓度(10-100-500nM)的非激活的抗-Vγ9Vδ2 TCR VHH或激活的抗-Vγ9Vδ2 TCR VHH刺激24小时后的CD25表达(MFI)的变化。
图6：当与作为双特异性分子的肿瘤抗原特异性VHH融合时，Vγ9Vδ2 TCR特异性VHH可促进肿瘤细胞死亡。在实验的典型实例中，在存在(有)或不存在(没有)双特异性纳米抗体构建体的情况下，Vγ9Vδ2 T细胞与肿瘤细胞系A431共培养过夜，双特异性纳米抗体构建体由与激活抗-Vγ9Vδ2 TCR VHH融合的肿瘤抗原特异性VHH组成。数据表明Vγ9Vδ2 T细胞和7AAD+肿瘤细胞(表明肿瘤细胞死亡)的CD25表达(激活)和CD107a表达(脱粒)。
图7：使用流式细胞计数法测定的T细胞受体Vγ9和/或Vδ2结合特异性：典型的流式细胞计数法直方图表明Vγ9Vδ2 TCR特异性VHH(空心直方图)和阴性对照VHH(填充的直方图)与Vγ9Vδ2 TCR表达细胞的结合。
图8：克隆VHH 5C7不激活健康供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞，也不中和磷酸抗原诱导的健康供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞的激活。典型的实例证明VHH 5C7对磷酸Ag诱导的Vγ9Vδ2 T细胞激活没有抑制和激活作用。纵轴表示通过CD25表达评估的Vγ9Vδ2 T细胞的激活，横轴表示不同的VHH浓度。使用表达磷酸抗原的HeLa细胞进行Vγ9Vδ2 T细胞刺激，表达磷酸抗原的HeLa细胞通过用递增剂量的氨基双膦酸帕米膦酸盐(其导致HeLa细胞的磷酸抗原表达水平增加)预处理HeLa细胞而产生。
图9：免疫球蛋白的示意图。
A)由两条重链和两条轻链组成的人抗体；B)由可通过二硫桥键二聚化的两条单链(或两条重链)组成的单链抗体(或仅重链抗体)，其中每条链含有可变结构域。这种单链抗体(或仅重链抗体)可以是美洲驼抗体；C)单域抗体含有一个可变抗体结构域，例如单链抗体(或仅重链抗体)。单域抗体可仅由所描述的结合区组成。可变结构域用灰色表示，而恒定区用白色表示。轻链的可变结构域用黑色表示。
定义：
在下面的描述和实施例中，使用了多个术语。为了提供对说明书、权利要求和条款的清楚和一致的理解，包括给予这些术语的范围，提供以下定义。除非本文另有定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。
实施本发明的方法中使用的常规技术的方法对于本领域技术人员是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术的实践是本领域技术人员熟知的，并且例如在下列参考文献中讨论：Sambrook et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；以及Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego系列。
在本文档及其权利要求和条款中，动词“包括”及其变形以其非限制性意义使用，意味着包括该词之后的项，但是不排除未具体提及的项。它涵盖了动词“基本上由...组成”以及“由...组成”。
如本文所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数个指代物。例如，如上所用的用于分离“一个”DNA分子的方法包括分离多个分子(例如10、100、1000、成千个10、成千个100、数百万个或更多分子)。
对齐(aligning)和比对(alignment)：术语“对齐”和“比对”是指基于相同或相似氨基酸的短或长延伸的存在的两个或更多氨基酸序列的比较。用于比对氨基酸序列的几种方法是本领域已知的，如下文将进一步解释的。术语“对齐”和“比对”也意指基于相同或相似核苷酸的短或长延伸的存在的两个或更多核苷酸序列的比较。用于比对核苷酸序列的几种方法是本领域已知的，如下文将进一步解释的。
“基因的表达”或“蛋白质的表达”是指这样的过程，其中可操作地连接到合适的调节区特别是启动子的DNA区域被转录成RNA，其能够通过机械翻译将细胞转化成由核苷酸序列编码或其本身具有活性(例如在转录后基因沉默或RNAi中)的蛋白质或肽(或活性肽片段)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指功能关系中的多核苷酸单元的连接。当核酸与另一核酸序列置于功能关系中时，其是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或者转录调节序列影响编码序列的转录，则其可操作地连接于编码序列。可操作地连接是指被连接的DNA序列通常是连续的，并且在必要时连接连续的并且在阅读框中的两个或多个蛋白质编码区。
术语“遗传构建体”是指包含可操作地连接到合适的调节区(例如启动子)的区域(转录区)的DNA序列，转录区在细胞中转录成RNA分子(例如mRNA)。因此，遗传构建体可以包含几个可操作地连接的序列，例如启动子，包含例如参与翻译起始的序列的5'前导序列、(蛋白质)编码区、剪接供体和受体位点、内含子和外显子序列，以及包含例如转录终止序列位点的3'非翻译序列(也称为3'未翻译序列或3'UTR)。
“序列同一性”是核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的量度。一般来说，对序列进行比对，以便获得最高阶匹配。“同一性”本身具有本领域公认的含义，并且可以使用公开的技术计算。参见例如：(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY(计算分子生物学),Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOMEPROJECTS(生物计算：信息学和基因组工程),Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA(序列数据的计算分析),PART I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SEQUENCE ANALYSIS INMOLECULAR BIOLOGY(分子生物学中的序列分析),von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及SEQUENCE ANALYSIS PRIMER(序列分析引物)；Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。尽管存在多种方法测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，术语“同一性”是本领域技术人员熟知的(Carillo,H.,and Lipton,D.,SIAMJ.Applied Math(1988)48:1073)。通常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于在GUIDE TO HUGE COMPUTERS(大型计算机指南),Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,和Carillo,H.,and Lipton,D.,SIAM J.Applied Math(1988)48:1073中所公开的。用于确定同一性和相似性的方法编码在计算机程序中。确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCS程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.(1990)215:403)。
作为说明，通过与SEQ ID NO：31的参考氨基酸序列具有至少例如70％“序列同一性”的氨基酸序列，意指除了多肽序列可以包括SEQ ID NO：31的参考氨基酸的10个氨基酸中每个的最多3个氨基酸改变外，氨基酸序列与参考序列相同。因此，氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性百分比为在参考氨基酸序列的全长上计算。换句话说，为了获得包含与参考氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，参考序列中高达30％的氨基酸残基可以缺失或替代为另一个氨基酸或多个可以插入参考序列中高达总氨基酸残基的30％的氨基酸。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，单独地散布在参考序列的残基之间或参考序列内的一个或多个邻接基团中。
本发明的“核酸”或“核酸序列”可以分别包括嘧啶和嘌呤碱基优选胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶、以及腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或寡聚物(参见Albert L.Lehninger,Principles of Biochemistry,at 793-800(Worth Pub.1982)，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。本发明涵盖任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分及其任何化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。聚合物或低聚物在组成上可以是异质的或均质的，并且可以从天然存在的来源分离或可以人工或合成产生。此外，核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且可以以单链或双链形式永久或过渡地存在，包括同源双链、异源双链和杂交状态。
如本文所用，术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常特征在于不受调节的细胞生长的生理状况。癌症的实例包括但不限于乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、皮肤癌、血癌、白血病、黑素瘤、头颈癌和脑癌。如本文所用，“癌症”也称为恶性肿瘤。
术语“氨基酸序列”或“蛋白质”或“肽”是指由氨基酸链组成的分子，不指具体的作用模式、大小、3维结构或来源。因此，其“片段”或“部分”仍可称为“氨基酸序列”或“蛋白质”或“肽”。“分离的氨基酸序列”用于指不再处于其原始天然环境中的氨基酸序列，例如在体外或在重组细菌或人宿主细胞中。
“T细胞”或“T淋巴细胞”属于一组名为淋巴细胞的白血细胞，其在细胞介导的免疫中起作用。T细胞来源于骨髓中的造血干细胞，在胸腺中成熟(即T的来源)，并在外周淋巴组织中获得其全部功能。在T细胞发育过程中，作为初始β或δTCR基因重排的结果，CD4－CD8－T细胞(对于CD4和CD8共受体均为阴性)致力于αβ或γδ命运。经历早期β链重排的细胞表达由细胞表面上的完整β链和前TCRα链组成的前TCR结构。这样的细胞被转换为CD4+CD8+状态，重排TCRα链基因座，并在表面上表达成熟的αβTCR。在β基因重排之前成功完成γ基因重排的CD4-CD8-T细胞表达功能性γδTCR并保留CD4－CD8－。(Claudio Tripodo et al.Gammadelta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6,707-717(December2009))。T细胞受体与CD3蛋白复合体结合。成熟T细胞，即表达αβTCR或γδTCR，在细胞表面上表达T细胞受体复合体。构成人外周血中T细胞总群体的约1-5％的γδT细胞可以在另外的亚群中分开。γδT细胞亚群构成Vγ9Vδ2 T细胞，其表达Vγ9Vδ2 TCR。在T细胞受体的胞外结构域中，定位了互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)。这些区域通常是最可变的结构域，并且对TCR中的多样性有显著贡献。CDR区在T细胞发育期间组成，其中所谓的可变-(V)、分化-(D)和连接-(J)-基因片段随机组合以产生不同的TCR。
“Vγ9Vδ2 T细胞”是可以在功能上定义的细胞，因为它们被一组非肽磷酸化的类异戊二烯前体(统称为磷酸抗原)特异性、快速激活。磷酸抗原几乎由所有活细胞产生。在动物和人类细胞(包括癌细胞)中发现的最常见的磷酸抗原是异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。IPP是来自甲羟戊酸途径的代谢物。(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸(HMBPP或HMB-PP)是类异戊二烯生物合成的非甲羟戊酸途径的中间体。HMBPP是大多数致病细菌(包括结核分枝杆菌)以及寄生原生动物(例如疟原虫(导致疟疾)和弓形虫)中的必需代谢物。Vγ9Vδ2 T细胞的激活包括克隆扩增、细胞毒性活性和细胞因子的表达。“Vγ9Vδ2 T细胞”也通过Vγ9Vδ2 T细胞受体的表达来定义。例如，可以使用对Vγ9Vδ2 T细胞受体特异的抗体选择细胞，如下所述。这些选择的细胞经历了γ和δ基因的重排，并编码Vγ9 T细胞受体链和Vδ2 T细胞受体链。从这些选择的细胞，可以确定对应于Vγ9 T细胞受体链和Vδ2 T细胞受体链的核酸(或氨基酸)序列。
本领域技术人员能够很好地选择和/或鉴定特征在于在细胞表面上表达抗原或受体的细胞群体，如本文全文所述。应当理解，关于在细胞表面上的表达，例如CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、γδTCR和Vγ9Vδ2 TCR，这通常在细胞群中进行，其中当与具有较低表达水平的细胞相比时，细胞的一部分具有高得多的抗原或受体的表达水平。因此，术语阳性或阴性应理解为是相对的，即阳性细胞与阴性细胞相比具有高得多的表达水平。因此，在这个意义上为阴性的细胞仍然可以具有可检测的表达水平。可以使用荧光激活细胞分选(FACS)分析细胞表面上的表达，并且许多特异性抗体是可商购的，例如适用于这样的FACS分析的CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、γδTCR、Vγ9 TCR链和Vδ2 TCR链，如实施例中所述和可用的。这种特异性抗体是与它们各自的抗原或受体结合的免疫球蛋白。因此，Vγ9Vδ2 T细胞也可以在FACS中被定义和选择为对Vγ9Vδ2 TCR是阳性的。适合于FACS或类似分离技术的抗体(例如与磁珠缀合的抗体)可广泛获得。选择条件，例如由允许选择阴性和/或阳性细胞的抗体制造商提供的条件。可以适合于选择Vγ9Vδ2 T细胞或工程化的Vγ9Vδ2 T细胞(例如可从BD单抗(Pharmingen)(BD,1 Becton Drive,Franklin Lakes,NJ USA)获得)的抗体的实例是Vγ9-PE(克隆B3，#555733)、Vδ2-FITC(克隆B6，#555738)、γδTCR-APC(克隆B1，#555718)或诸如可从Beckman Coulter获得的pan-γδTCR-PE(克隆IMMU510，#IM1418U)。可适用于检测CD25和CD69的抗体的实例是可从BD单抗获得的CD25-PE(克隆M-A251，#555432)和CD69-FITC(克隆L78，#347823)。
发明详述
在本发明的第一方面，提供了人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子，其包含CDR1区和CDR2区，其中CDR1区包含与SEQ ID NO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；其中CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中优选地免疫球蛋白分子为单域抗体。
本发明的人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子是例如结合到诸如SEQ IDNO.71和72所列的Vγ9和Vδ2 T细胞受体链的氨基酸序列所定义的Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白分子。例如，通过FACS分析可以检测与这样的T细胞受体的结合，如实施例部分中所述。例如，表达Vγ9Vδ2 T细胞受体例如SEQ ID NO.71和72的细胞与对照免疫球蛋白分子或结合Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白分子接触。或者，可将来自实施例中描述的健康人供体的Vγ9Vδ2 T细胞与对照免疫球蛋白分子或结合Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白分子接触。当将特异性免疫球蛋白分子与不结合Vγ9Vδ2 T细胞受体的对照免疫球蛋白分子进行比较时，与细胞结合的免疫球蛋白的量增加(参见例如图7)。本发明的人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子可以被定义为，例如导致相对于对照免疫球蛋白平均荧光强度(MFI)增加最小2倍(由流式细胞术测定)的免疫球蛋白。MFI是选择的荧光通道中的荧光强度的平均值(FITC，PE，PerCP等)。作为阴性对照抗体，可以使用针对偶氮染料反应性红6(RR6)的单域抗体(或VHH，纳米抗体)(Spinelli S et al,Biochemistry 2000；39:1217-1222)。因此，本领域技术人员能够很好地选择适当的条件以确定免疫球蛋白分子与Vγ9Vδ2 T细胞受体的结合。免疫球蛋白结合可以根据特异性和亲和力表达。特异性决定了哪种抗原或其表位被免疫球蛋白分子结合。
如本文所用的“免疫球蛋白分子”(缩写为“Ig”)是本领域熟知的并且包括术语“抗体”。本文使用的术语“免疫球蛋白”是指包含具有互补决定区(CDR)的抗原结合位点的任何多肽。该术语包括但不限于抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、单链抗体、仅重链抗体、美洲驼抗体、单域抗体和纳米抗体(例如VHH)。术语“免疫球蛋白分子”还可以包括免疫球蛋白片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他抗体片段或包含保留抗原结合功能的CDR的其他构建体。通常，此类片段包含抗原结合结构域。免疫球蛋白分子或其片段可以是任何已知的抗体同种型及其构象，例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4)或IgM类，或可以构成任何组合的其混合物，例如来自IgG1和IgG2a类的抗体的混合物。
免疫球蛋白是免疫系统相关蛋白。人抗体由四种多肽组成-两条重链和两条轻链连接形成“Y”形分子(参见图9A)。“Y”的末端中的氨基酸序列在不同抗体之间变化很大。每个末端具有结合抗原的特异性。人抗体的可变区包括轻链和重链的末端，即轻链和重链的可变结构域。恒定区决定用于例如激活免疫系统的机理。
根据其重链恒定区结构和免疫功能，将抗体分为五个主要类别，IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如，人IgG重链可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型中的任一种。
每条链，即免疫球蛋白分子，都具有可变结构域。免疫球蛋白分子的可变结构域被细分为高变(HV)区和框架(FR)区。HV区在给定位置相对于该位置中最常见的氨基酸具有高比例的不同氨基酸。高变区称为互补决定区(CDR)。免疫球蛋白分子具有三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。具有更少可变氨基酸序列的四个框架区分隔CDR区。CDR区可以直接结合抗原，例如Vγ9Vδ2 T细胞受体(参见例如图1，其中框架区和CDR区由所选VHH指示)。框架区形成β-片层结构，其用作支架以定位CDR区以接触抗原。
美洲驼抗体由两条重链组成(参见图9B)。每条重链都是具有单个可变结构域的免疫球蛋白分子。这样的抗体称为单链抗体，即其包含一种类型的链。这样的抗体也可以称为仅重链抗体。
单域抗体是含有单个单体可变结构域的免疫球蛋白分子(参见图9C)。单域抗体因此含有单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3。单域抗体可以衍生自单链抗体(或仅重链抗体)。与完整抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特异性抗原。单域抗体可以仅包含具有CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白链的可变结构域和框架区，这样的抗体也可以称为VHH或纳米抗体。由于分子量仅为约12-15kDa，纳米抗体比由两条重链和两条轻链组成的常见抗体(150-160kDa)小得多。
CDR1、CDR2和CDR3序列可以在物种之间交换。例如，从美洲驼免疫球蛋白分子，可以选择CDR序列并与人免疫球蛋白分子中的CDR序列交换，以获得具有源自美洲驼CDR序列的特异性的人免疫球蛋白分子。这可能是有利的，因为与原始美洲驼框架序列相比，人序列对人类免疫原性较低。CDR序列的这种交换称为人源化。因此，本发明的免疫球蛋白分子、单链抗体和单域抗体可以具有人源免疫球蛋白序列或美洲驼来源的免疫球蛋白序列，并且CDR1、CDR2和CDR3序列被替换为本发明的CDR序列，以提供用于人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合。例如，单链人抗体可以包含对应于人重链序列但已经突变的序列，例如，其具有缺失的CH1结构域，从而形成美洲驼样单链抗体(参见例如图9B)，并且所述人重链序列的CDR区被替换为本发明的CDR序列。因此，人免疫球蛋白、人单链抗体或人单域抗体是指框架区和/或恒定区的来源，而不是本发明的CDR1区、CDR2区和CDR3区的来源。
如实施例部分所述，通过使用涉及用人供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞免疫美洲驼和噬菌体展示的策略选择人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子。对选择的VHH序列进行测序，列于表3中并描述于图1中。所选VHH的CDR1区、CDR2区和CDR3区列于下表1中。每个CDR与相应的SEQ ID NO也列于表3中。
表1.在所选的20种VHH中，列出了CDR1、CDR2和CDR3序列。参考CDR1和CDR2如上所列(分别对应于SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32)，并且也列出了每个CDR1区和CDR2区与各自的参考CDR1和CDR2的序列同一性(％)。
CDR1 ％ CDR2 ％ CDR3
Nr 参考 GRTFSNYAMG AISWSGGSTYYADSVKG
1 5C7 GRTFSRYTMG 80 AISWSGGRTNFAGSVKG 71 DWLPVPGRESYDY
2 5E3 GRTFSSYAMG 90 AISWSGGTTYYADSVKG 94 SLDCSGPGCHTAEYDY
3 6H1 GRTFSEYAMG 90 AISWTGSKTYYADSVKG 82 SSDCSGPGCHTEEYDY
4 5G3 GRTFSSYAMG 90 AVSWSGGSTYYADSVKG 94 SQDCSGPGCYTNEYDS
5 5C1 GSIFSNYAMA 70 AVSWSGGRTYYADSVKG 88 SLSCSGPGCSLEEYDY
6 5D3 GRPFSNYAMG 90 VISWSGGSTYYADSVKG 94 QFSGASTVVAGTALDYDY
7 6E3 GRPFSNYGMG 90 GISWSGGSTDYADSVKG 88 VFSGAETAYYPSDDYDY
8 6H4 GRPFSNYGMG 90 GISWSGGSTDYADSVKG 88 VFSGAETAYYPSDDYDY
9 6C1 GRPFSNYGMG 90 GISWSGGSTDYADSVKG 94 VFSGAETAYYPSDDYDY
10 6H3 GRPFSNYGMG 90 GITWSGGSTHYADLVKG 76 VFSGAETAYYPSTEYDY
11 6G3 GRPFNNYGMG 70 GISWSGGSTYYADSVKG 94 VFSGAETAQYPSYDYDY
12 6F6 GRPFSNYAMG 90 AVTWSGGSTYYADSVKG 88 QFNGAENIVPATTTPTSYDY
13 5C8 GRPFSNYAMG 90 AISWSGGSTSYADSVKG 94 QFSGADYGFGRLGIRGYEYDY
14 5E7 GRPFSNYAMG 90 AISWSGGSTSYADSVKG 94 QFSGADYGFGRLGIQGYEYDY
15 5F5 GRTFSNYAMG 100 AISWSGGSTYYADSVKG 100 MFSGSESQLVVVITNLYEYDY
16 6A1 GRTFSNYAMG 100 TISWSGGSTYYADSVKG 94 AFSGSDYANTKKEVEYDY
17 5D7 GRTFSNYAMG 100 AISWSGGMTDHADSVKG 82 AFAGDIPYGSSWYGDPTTYDY
18 5B11 GRTSSTFSMA 50 AINWSGGSTRYADSVSD 76 RRGGIYYSTQNDYDY
19 6C4 VRTFSDYRMG 70 TISWSGGLTYYADSVKG 94 GGGYAGGTYYHPEE
20 6E4 GFTFDDYCIA 40 CITTSDGSTYYADSVKG 76 YFGYGCYGGAQDYRAMDY
发明人选择的用于结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白令人惊讶地与CDR1和CDR2具有实质的序列同一性。不受理论的约束，这样的CDR1和CDR2序列实质上有助于Vγ9Vδ2 T细胞受体的结合。对于CDR3区发现更大的可变性，不受理论的约束，其可以在免疫球蛋白分子的功能中牵涉CDR3序列，即调控类型，例如阻断Vγ9Vδ2 T细胞的激活、诱导Vγ9Vδ2T细胞的激活、或既不阻断Vγ9Vδ2 T细胞的激活也不诱导Vγ9Vδ2 T细胞的激活。因此，免疫球蛋白分子包含CDR1区和CDR2区，其中CDR1区包含与SEQ ID NO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列，并且其中CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。优选地，CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
优选地，免疫球蛋白分子是单链抗体。如所述，免疫球蛋白衍生自美洲驼。美洲驼产生具有通过二硫桥二聚化的单一重链的抗体，即美洲驼抗体具有来自两条链的两个单可变结构域(参见图9B)。
在一个实施方案中，CDR2区包含与SEQ ID NO.32AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。当比较所选CDR2区的序列时，在这些位置的氨基酸不显示变异。因此，不受理论的约束，这些位置似乎对结合Vγ9Vδ2 T细胞受体是重要的。应当理解的是，所提及的位置涉及参考序列中的位置，并且不是指整个免疫球蛋白分子中的位置。因此，CDR2区在指定位置具有与SEQ ID NO.32相同的氨基酸。
如实施例部分所述，CDR1区、CDR2区和CDR3区选自美洲驼抗体。因此，本发明的单链抗体可以包含源自美洲驼的免疫球蛋白分子序列。应当理解的是，在这样的美洲驼单链抗体中，原始CDR序列被替换CDR序列替代，例如表1所列，以得到具有对替换CDR序列特异性的美洲驼单链。类似地，可以用人重链序列进行相同的操作。人单链抗体具有由替换CDR序列支配的特异性。将CDR1区、CDR2区和CDR3区转移到其它框架，例如转移到其他物种，例如本领域熟知的人框架。
在一个实施方案中，单链抗体是单域抗体。单链抗体包含框架区。因此，人单域抗体可以具有人框架区，例如，衍生自人重链和/或人轻链序列以及本发明的CDR1、CDR2和CDR3序列。美洲驼单域抗体具有美洲驼框架区。
在一个实施方案中，一个或多个框架区选自氨基酸序列SEQ ID NO.67-701的组。这些框架区是来自分离的VHH克隆之一的框架区。可以观察到，来自20个分离的克隆的框架区基本上不改变。
在一个实施方案中，免疫球蛋白分子、单链抗体或单域抗体包含CDR3区，其中CDR3区包含选自氨基酸序列SEQ ID NO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的组的氨基酸序列。如下所述，提供这些与CDR1和CDR2序列结合的CDR3区用于结合和功能。
在一个实施方案中，免疫球蛋白分子、单链抗体或单域抗体具有来自如表1中所列的抗体的CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列的组合。在一个实施方案中，免疫球蛋白分子、单链抗体或单域抗体包含选自氨基酸序列SEQ ID NO.47-66的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供如上公开的本发明的免疫球蛋白分子用于医学治疗。应当理解的是，当人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子在体内结合人Vγ9Vδ2 T细胞时，例如，在医学治疗中，可能不期望免疫球蛋白分子是完全功能性的免疫球蛋白分子，因为当与人Vγ9Vδ2 T细胞结合时，其可触发针对人Vγ9Vδ2 T细胞的免疫应答。因此，在这种情况下，优选不具有功能性恒定区，即失活或缺失的免疫球蛋白分子，例如纳米抗体和VHH。当在体内需要人Vγ9Vδ2 T细胞的作用时，这可能是特别有用的。
在一个实施方案中，提供了编码本发明的免疫球蛋白分子的核苷酸序列。本文公开的序列涉及氨基酸序列。因此，本领域技术人员能够提供编码氨基酸序列的核苷酸序列，因为其仅需要使用密码子表将氨基酸序列转化为核苷酸序列。这样的核苷酸序列可以用于将其可操作地连接到启动子序列、polyA信号等，以提供利用其可以表达抗体的遗传构建体。这种包含核苷酸序列的遗传构建体可以包含在宿主细胞中。
在一个实施方案中，提供了制备本发明免疫球蛋白分子的方法，包括：
-培养本发明的宿主细胞，其包含编码本发明免疫球蛋白分子的核苷酸序列；
-允许宿主细胞表达免疫球蛋白；
-获得免疫球蛋白。
此外，本发明还提供了人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子是阻断人Vγ9Vδ2 T细胞激活的免疫球蛋白分子。阻断人Vγ9Vδ2 T细胞的激活在其中不期望激活人Vγ9Vδ2 T细胞的条件和/或治疗中是有利的。
Vγ9Vδ2 T细胞可以被小的非肽磷酸化中间体(称为来自哺乳动物甲羟戊酸途径或微生物脱氧木酮糖磷酸途径的磷酸抗原(pAg))强烈和特异性激活。然后可以利用Vγ9Vδ2 T细胞通过pAg和膜结合的丁酰胆碱3A1/CD277分子之间的相互作用来特异性识别(导致激活)磷酸抗原。如实施例中所示，Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子可以阻断磷酸抗原诱导的Vγ9Vδ2 T细胞的激活。
优选地，人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子是包含CDR1区和CDR2区的人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子，其中该免疫球蛋白分子是阻断人Vγ9Vδ2 T细胞激活的免疫球蛋白分子，其中CDR1区包含与SEQ ID NO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中优选地免疫球蛋白分子是单链抗体。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子的CDR2区包含与SEQ IDNO.2AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一个实施方案中，免疫球蛋白分子是单域抗体，优选地其中单域抗体衍生自美洲驼单链抗体或人单链抗体。在又一个实施方案中，免疫球蛋白分子是单链抗体或单域抗体。在其他实施方案中，免疫球蛋白分子或单链抗体或单域抗体包含一个或多个选自SEQ ID NO.67-70的氨基酸序列的组的框架区。
在一个实施方案中，阻断人Vγ9Vδ2 T细胞激活的所述人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子用于医学治疗。在进一步的实施方案中，所述免疫球蛋白分子用于医学治疗，其中医学治疗包括使用甲羟戊酸途径的抑制剂或其中医学治疗包括治疗癌症。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子用于医学治疗，其中医学治疗包括治疗传染病。
在pAg产生的下游起作用的甲羟戊酸途径的抑制剂，包括通常临床规定的氨基二膦酸盐(aminobisphosphonates)，例如帕米膦酸盐(pamidronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、利塞膦酸盐(risedronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)和唑来膦酸盐(zoledronate)。另一类化合物包括烷基胺，例如异丁胺、异戊胺和正丁胺。这样的化合物可用于治疗佩吉特(Paget’s)疾病、骨质疏松症、高钙血症以及预防在恶性骨转移的情况下的骨骼事件。这导致内源性pAg异戊烯基-焦磷酸(IPP)的胞内积累以及随后的Vγ9Vδ2 T细胞的选择性激活和扩增。施用氨基二膦酸盐(aminobisphosphonate)通常伴随由于Vγ9Vδ2 T细胞的这种选择性激活导致的急性发热反应。该急性期反应具有1天的发病高峰(peakonset)和3天的中值持续时间，并且主要由发热、寒颤(chills)、潮红(flushes)、急性肌肉骨骼症状、疼痛、涉及背部、颈部、胸部或肩部的广义的不适和局部抱怨、恶心、呕吐和腹泻组成。因此，在医学治疗中，阻断人Vγ9Vδ2T细胞激活的所述人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子可以预防由例如在患有佩吉特氏病、骨质疏松症、骨转移和高钙血症的患者中给药氨基二膦酸盐诱导的急性期反应。此外，这样的免疫球蛋白分子在体内Vγ9Vδ2 T细胞的过度激活的医学治疗中也是有利的，其可以发生在例如Vγ9Vδ2 T细胞被过度刺激或长期刺激的感染期间，或在某些癌性病症中，其中肿瘤细胞中甲羟戊酸途径的慢性过度活性可导致Vγ9Vδ2 T细胞耗尽。可以在患者中测量这种(过度)刺激，例如通过测量Vγ9Vδ2T细胞与基线水平相比的增加，或通过测量Vγ9Vδ2 T细胞的超常水平(例如超过5％的T细胞是Vγ9Vδ2 T细胞)，与Vγ9Vδ2 T细胞上的表面标志物例如CD69(早期激活标志物)或CD25(晚期激活标志物)的上调相组合。应当理解，由于Vγ9Vδ2 T细胞从血液迁移到组织，测量Vγ9Vδ2 T细胞的超常水平不是必需的。另一方面，在慢性过度刺激中，Vγ9Vδ2 T细胞可能不太好地被激活，并且也可能是过度刺激的迹象。细胞因子产生(IFN-γ，TNF-α)和细胞毒性颗粒含量也可以通过流式细胞术在细胞内测量。
在一个优选的实施方案中，阻断人Vγ9Vδ2 T细胞激活的所述人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子是包含CDR3区的免疫球蛋白分子，其中CDR3区包含选自氨基酸序列SEQ ID NO.27和30的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，阻断人Vγ9Vδ2 T细胞激活的所述人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子用于阻断人Vγ9Vδ2 T细胞的激活。根据该实施方案，将所述免疫球蛋白分子(其包括单链抗体或单域抗体)用于测定中，例如，如实施例中描述的，以阻断激活。
本发明还提供了激活人Vγ9Vδ2 T细胞的免疫球蛋白分子，其为人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子，其包含CDR1区和CDR2区，其中CDR1区包含与SEQ ID NO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2区包含与SEQID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中优选地免疫球蛋白分子是单链抗体。在一个实施方案中，CDR2区包含与SEQ IDNO.2AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一个实施方案中，免疫球蛋白分子是单域抗体，优选地其中单域抗体是美洲驼单链抗体或人单链抗体。在又一个实施方案中，单链抗体是单域抗体。在其他实施方案中，免疫球蛋白分子或单链抗体或单域抗体包含一个或多个选自SEQ ID NO.67-70的氨基酸序列的组的框架区。
优选地，激活人Vγ9Vδ2 T细胞的所述免疫球蛋白分子包含CDR3区，其中CDR3区包含选自氨基酸序列SEQ ID NO.6、9、11、14、17、20、22、25、29、33、35和46的组的氨基酸序列。
旨在开发Vγ9Vδ2 T细胞的目前策略取决于它们的系统性激活(例如通过氨基二膦酸盐或合成的磷酸抗原如BrHPP)或例如Vγ9Vδ2 T细胞的过继转移。已经证明这些方法对患者具有良好的耐受性，并且已经记载了抗肿瘤活性的迹象。然而，结果不足够一致以允许广泛的临床应用。描述的策略导致Vγ9Vδ2 T细胞的系统性激活，但不导致这些细胞特异性募集至肿瘤，其中假定它们发挥其抗肿瘤作用。激活人Vγ9Vδ2 T细胞并优选连接到试剂的所述免疫球蛋白分子可用于在临床环境中激活Vγ9Vδ2 T细胞。
优选地，激活人Vγ9Vδ2 T细胞的所述免疫球蛋白分子与试剂连接。优选地所述试剂可与靶结合，靶例如癌细胞或受感染细胞如病毒感染的细胞，或非宿主细胞例如细菌。优选地，所述试剂是免疫球蛋白分子。更优选地，所述免疫球蛋白分子是单链抗体或单域抗体。通过连接到试剂，试剂可以在需要人Vγ9Vδ2 T细胞的作用的位点募集并激活人Vγ9Vδ2 T细胞，与系统性激活相反。例如，激活人Vγ9Vδ2 T细胞的所述免疫球蛋白分子可以连接到肿瘤特异性抗体、抗病毒抗体或抗细菌抗体。这样的肿瘤特异性抗体可以是任何抗体。这种与另一种抗体连接的免疫球蛋白分子可以称为双特异性抗体。双特异性抗体还可以由包含本发明的CDR1区、CDR2区和CDR3区的第一免疫球蛋白分子组成，第一免疫球蛋白分子是包含在单链抗体中的链，其中第一免疫球蛋白链与第二免疫球蛋白分子配对，第二免疫球蛋白分子也是包含在单链抗体中的链，其中第二免疫球蛋白结合靶。因此形成具有两条链(类似于图9B所示)的双特异性抗体，每条链具有不同的单一结合结构域，其中一个结合结构域包含本发明的CDR1、CDR2和CDR3，并且另一个结合结构域结合靶。激活人Vγ9Vδ2 T细胞并连接到试剂的所述免疫球蛋白分子也可以是包含两个单域抗体的双特异性抗体，第一单域抗体包含本发明的CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中第一单域抗体与第二单域抗体连接，其中第二单域抗体结合靶。
因此，在一个实施方案中，激活人Vγ9Vδ2 T细胞并且优选连接于试剂的所述免疫球蛋白分子用于医学治疗。优选地，医学治疗是癌症或感染的治疗。
在另一个实施方案中，提供了激活人Vγ9Vδ2 T细胞的所述免疫球蛋白分子用于激活人Vγ9Vδ2 T细胞的用途。这种用途例如可用于如实施例中所述的测定。
在另一个实施方案中，激活人Vγ9Vδ2 T细胞的所述免疫球蛋白分子包含标记。这些免疫球蛋白分子特别用于表达人Vγ9Vδ2 T细胞受体的细胞的流式细胞术。免疫球蛋白分子可以包含标签，例如，如实施例中所述的myc标签或his-标签或荧光蛋白序列，或者其可以偶联至合适的成像染料。此外，当偶联至例如磁珠时，这些免疫球蛋白分子可用于从包括来自外周血的细胞的细胞悬浮液中分离和纯化这些细胞。作为激活人Vγ9Vδ2 T细胞的这些免疫球蛋白，这些免疫球蛋白分子特别用于在激活和扩增细胞群体的同时选择这些细胞。因此，进一步提供了这些免疫球蛋白分子用于标记和/或选择和激活人Vγ9Vδ2 T细胞的用途。
在本发明的另一方面，提供了免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子为不阻断人Vγ9Vδ2 T细胞激活并且不激活人Vγ9Vδ2 T细胞的免疫球蛋白分子；并且其中其是包含CDR1区和CDR2区的人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子，其中CDR1区包含与SEQ IDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中优选地免疫球蛋白分子是单链抗体。在一个实施方案中，CDR2区包含与SEQID NO.2 AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一个实施方案中，免疫球蛋白分子是单域抗体，其中单域抗体优选是美洲驼单链抗体或人单链抗体。在又一个实施方案中，单链抗体是单域抗体。在其他实施方案中，免疫球蛋白分子或单链抗体或单域抗体包含一个或多个选自SEQ ID NO.67-70的氨基酸序列的组的框架区。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含CDR3区，其中免疫球蛋白分子是不阻断人Vγ9Vδ2 T细胞的激活并且也不激活人Vγ9Vδ2 T细胞的免疫球蛋白分子，其中CDR3区包含选自SEQ ID NO.3、37、40及43的组的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含标记，其中免疫球蛋白分子是不阻断人Vγ9Vδ2 T细胞激活的免疫球蛋白分子。
这些免疫球蛋白分子特别用于表达人Vγ9Vδ2 T细胞受体的细胞的流式细胞术或免疫组织化学检测。免疫球蛋白分子可以包含标签，例如，如实施例中所述的myc标签或his-标签或荧光蛋白序列，或者其可以偶联至合适的成像染料。此外，当偶联至例如磁珠时，这些免疫球蛋白分子可用于从包括来自外周血的细胞的细胞悬浮液中分离和纯化这些细胞。这些Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子可被开发为用于在免疫组织化学、流式细胞术、成像中的检测和用于从细胞悬浮液磁性纯化的研究工具。因为这些对人Vγ9Vδ2 T细胞没有影响，所以这些免疫球蛋白分子尤其可用于选择这些细胞用于进一步的用途。因此，进一步提供了这些免疫球蛋白分子用于标记或选择人Vγ9Vδ2 T细胞的用途。
在本发明的另一方面，提供了免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子是包含CDR1区和CDR2区的免疫球蛋白，其中CDR1区包含与SEQ ID NO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；并且其中CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；并且其中优选地免疫球蛋白分子是单链抗体。在一个实施方案中，CDR2区包含与SEQ ID NO.2AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置9具有T，在位置12具有A，在位置15具有V。在另一个实施方案中，免疫球蛋白分子是单域抗体，其中单域抗体优选是美洲驼单链抗体或人单链抗体。在另一个实施方案中，单链抗体是单域抗体。在其他实施方案中，免疫球蛋白分子或单链抗体或单结构域抗体包含一个或多个选自SEQ ID NO.67-70的氨基酸序列的组的框架区。在本发明该方面的另一个实施方案中，免疫球蛋白分子、单链抗体或单结构域抗体包含CDR3区，其中CDR3区包含选自氨基酸序列SEQ ID NO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的组的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，提供了免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白分子包含CDR3区，其中CDR3区包含选自氨基酸序列SEQ ID NO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的组的氨基酸序列。
具体实施方式
供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞的产生
按前述(Schneiders FL,et al.Clin Immunol 2012；142:194-200)生成并培养健康的供体来源的(人)Vγ9Vδ2 T细胞。
Jurkat Vγ9Vδ2 T细胞系和Jurma Vγ9Vδ2 T细胞系的产生
根据先前描述的方法合成表达Vγ9Vδ2 TCR的Jurkat和JurMa细胞系(ScholtenKB,et al.Clin Immunol 2006；119:135-45)。简言之，通过小核糖核酸病毒来源的2A序列分离的克隆G9 Vγ9-和Vδ2-链的蛋白序列(Allison TJ et al.Nature 2001；411:820-4,Davodeau F et al.Eur J Immunol 1993；23:804-8)经过密码子修饰用于产生最佳蛋白质，并通过GeneART(Life technologies)合成，随后克隆至LZRS。转染到Phoenix-A包装细胞系后，收集逆转录病毒上清液以转导Jurkat或Jurma细胞。
抗Vγ9Vδ2 TCR VHH的选择
2只美洲驼在无菌PBS中用1×108人供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞在六周的时间内各免疫四次。按照描述(Roovers RC et al.Cancer Immunol Immunother.2007；56:303-17)从分离自美洲驼PBMC的提取的RNA构建噬菌体文库，并连接到噬菌粒载体pUR8100中。通过两轮噬菌体展示选择产生Vγ9Vδ2 T细胞受体(TCR)特异性VHH。在第1轮中，来自两个文库的噬菌体在4℃下与转导以稳定表达Vγ9Vδ2 TCR(Jurkat Vγ9Vδ2)的Jurkat细胞一起孵育2小时。孵育后，洗涤细胞，并用100mM HCl洗脱噬菌体。在4℃下孵育7分钟后，除去未结合的噬菌体并用Tris-HCl中和，之后将它们感染大肠杆菌(E.coli)。回收选择的噬菌体后，第二轮噬菌体首先在4℃下对Jurkat细胞进行1小时的2次反选(counter selected)，然后将未结合的噬菌体与Jurkat Vγ9Vδ2孵育1小时。如第一轮选择所述，洗脱噬菌体并感染大肠杆菌。将细菌接种在LB/2％葡萄糖/氨苄青霉素(ampicillin)平板上以产生编码洗脱的VHHDNA的单一细菌菌落。
VHH的产生和纯化
来自单个克隆的VHH DNA用Sfi1/BstEII消化，并克隆到质粒pMEK219，将HC-V盒加入至来自pHen1的衍生物(Hoogenboom et al.Nucleic Acids Res 1991)以能够进行Sfi1/BstEII克隆，加入了缺失genIII序列的C-末端myc-和6x HIS-标签。将pMEK219-VHH转化到TG1细菌。使用过夜培养以接种2xTY培养基加上0.1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素。当OD600达到0.5时，加入IPTG至终浓度为1mM。允许2-5小时的蛋白质产生。所有培养物的生长在37℃下在200-220rpm的摇动下进行。通过在4℃下旋转培养物15分钟来停止蛋白质产生。将细菌沉淀(pellet)悬浮在PBS中并冷冻至少1小时。将细菌悬浮液解冻，在4℃下轻微摇动1小时，并以4500rpm旋转30分钟。将上清液用经洗涤的Talon树脂(Clontech,1290 TerraBella Ave.Mountain View,CA,USA)在室温下培养1小时。Talon树脂用PBS洗涤3次，用pH 7的15mM咪唑/PBS洗涤1次，并用pH 7的150mM咪唑/PBS洗脱。将洗脱部分用PBS透析2次。用考马斯(coomassie)染色的蛋白凝胶检查纯化的VHH的纯度。
VHH与供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞或Jurkat Vγ9Vδ2 T细胞的结合
用FACS缓冲液洗涤5×104个供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞。所有孵育在FACS缓冲液中在4℃下进行30分钟。将细胞与25μl 500nM VHH一起孵育。洗涤后，将细胞与10μl 1:500抗myc标签抗体克隆4A6(Merck Millipore,290 Cocord Road Billerica,MA,USA)一起孵育。洗涤后，将细胞与10μl 1:200山羊-抗鼠F(ab)2 APC(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)在4℃孵育30分钟。在最后的洗涤步骤后，通过流式细胞术(FACSCalibur,BDBiosciences)测量与细胞结合的VHH。
通过VHH激活供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞
将平底96孔细胞培养板(Costar)在4℃下用50μl 4μg/ml小鼠抗myc克隆9E10(室内制备)包覆过夜。用PBS洗涤孔，并在室温下用200μl 4％BSA/PBS封闭30分钟。去封闭，并将孔与在PBS中的30μl 500nM VHH在室温下孵育2小时。洗涤孔，每孔加入在200μl IMDM+(Schneiders FL,et al.Clin Immunol 2012；142:194-200)中的1×104 Vγ9Vδ2 T，并在golgiplug(1:500)(BD Biosciences)的存在下在37℃下在具有潮湿气氛的CO2培养箱中孵育过夜，用于细胞内细胞因子的保留。然后使用流式细胞术测定CD25、IFN-γ和粒酶(Granzyme)B表达(如所述；Schneiders FL,et al.Clin Immunol 2012；142:194-200(CD25-PE(克隆M-A251，#555432)、IFN-γAPC(克隆B27#554702)均购自BD Pharmingen。Granzyme B PE(克隆GB-12#M2289)可从Sanquin，Amsterdam，The Netherlands获得))。
通过VHH中和供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞
将HeLa细胞与指定量的氨基二膦酸盐(NBP；ABP Pamidronaat-DiNatrium,Pharmachemie,Haarlem,The Netherlands)在37℃下在具有潮湿气氛的CO2培养箱中孵育2小时。然后洗涤细胞，并以5×104的每孔100μl IMDM+接种在平底96孔细胞培养板(Costar)中，并在37℃下在具有潮湿气氛的CO2培养箱中粘附2小时。用PBS洗涤细胞，并在100μlIMDM+中培养。将供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞用指定的VHH浓度在4℃孵育1小时。将75×103个VHH孵育的Vγ9Vδ2 T细胞加入到NBP处理的HeLa细胞包被的孔中，并在37℃下在具有潮湿气氛的CO2培养箱中孵育。用胰蛋白酶将细胞收获到96孔圆底板中，加入Golgiplug(1:500,BD Biosciences)用于细胞内细胞因子的保留。使用流式细胞术测定CD25、IFN-γ和粒酶B表达(如所述；Schneiders FL,et al.Clin Immunol 2012；142:194-200)。
VHH链特异性
用鼠抗人Vδ2-FITC和鼠抗人Vγ9-PE(均为BD Biosciences)对供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞系染色并用FACS Aria(BD Biosciences)分选群体：单一Vδ2阳性γδT细胞、单一Vγ9阳性γδT细胞、Vγ9Vδ2双阳性γδT细胞和Vγ9Vδ2双阴性γδT细胞。以与供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞系相同的方式培养分选的细胞。对于测定VHH特异性，将所得纯化的分选细胞系中的104个细胞用VHH染色，以类似于所描述的将VHH与供体来源的Vγ9Vδ2 T细胞的结合的方法，同时调整为10μl 1:80山羊抗小鼠-F(ab)2RPE(#R0480，来自Dako,Glostrup,Denmark)用于抗myc抗体检测。
结果
如上所述，测试选择的VHH的特异性，所有20个VHH(参见表2)显示与表达Jurkat细胞以及原始的Vγ9Vδ2 T细胞的Vγ9Vδ2 T细胞受体结合，而它们不结合不表达Vγ9Vδ2 T细胞受体的Jurkat细胞。
阻断磷酸抗原诱导激活的免疫球蛋白分子
克隆6F6和5E7被表征为阻断Vγ9Vδ2 T细胞的磷酸抗原诱导刺激的纳米抗体。克隆6F6和5E7都是结合Vγ9Vδ2 T细胞受体的Vδ2链的纳米抗体。GrB、CD25和IFN-γ表达与未刺激的对照相似，而阳性对照显示相对高的表达水平(参见图2)。在剂量反应曲线中，在暴露于磷酸抗原时，显示了磷酸抗原诱导的Vγ9Vδ2 T细胞激活的剂量依赖性中和(参见图3)。进一步显示，VHH 5E7纳米抗体通过氨基二膦酸(ABP)以剂量依赖性方式抑制Vγ9Vδ2 T细胞的激活，即较高剂量的5E7导致CD25和CD107a表达的相对更强烈的减少，以及干扰素-γ和TNF-α产生也相对更强烈地减少。还显示5E7纳米抗体通过Vγ9Vδ2 T细胞以剂量依赖性方式抑制Daudi细胞的自发裂解，而对照纳米抗体不显示任何显著的效果。在相同的测定中，使用含氮双膦酸帕米膦酸盐激活Vγ9Vδ2 T细胞，导致Daudi细胞的裂解增强。同样，5E7纳米抗体以剂量依赖性方式减少Daudi细胞的裂解。这表明可通过使用阻断Vγ9Vδ2 T细胞激活的纳米抗体来减少Vγ9Vδ2 T细胞的任何不希望的激活。这种阻断Vγ9Vδ2 T细胞激活的抗体可以是结合Vγ9Vδ2 T细胞受体的Vδ2链的抗体。
诱导激活的免疫球蛋白分子
显示各种VHH通过所示的CD25表达的增加和IFN-γ表达的增加激活Vγ9Vδ2 T细胞(参见图4)。此外，这种VHH显示典型的剂量反应，因为VHH剂量的增加导致CD25表达的增加(参见图5，右侧部分)。这种VHH也与免疫球蛋白分子偶联，并研究了对肿瘤细胞凋亡的影响(参见图6)。双特异性VHH(抗癌细胞结合以及Vγ9Vδ2 T细胞结合和激活)显示出对杀死肿瘤细胞的有效的活性。通过抗-Vγ9Vδ2纳米抗体6H4与抗肿瘤的纳米抗体的偶联制备双特异性VHH。作为双特异性对照，将抗-Vγ9Vδ2纳米抗体与对照纳米抗体偶联，并将抗肿瘤纳米抗体与对照纳米抗体偶联。在最高剂量(10nM)的测试中，对照组仅诱导约22％的肿瘤细胞裂解。结合Vγ9Vδ2 T细胞和肿瘤细胞的双特异性VHH(或纳米抗体)诱导由Vγ9Vδ2 T细胞介导的约85％的肿瘤细胞裂解。在剂量反应曲线中，通过Vγ9Vδ2 T细胞的裂解的百分比随剂量的降低(1nM约80％，100pM约78％，10pM约50％，1pM约23％和0约24％)而降低。在没有(双特异性)纳米抗体仅使用双膦酸盐的对照实验中，观察到约80％的肿瘤细胞裂解。这些结果显示，可通过使用双特异性VHH(或纳米抗体)可以增强通过Vγ9Vδ2 T细胞的肿瘤特异性裂解，其中肿瘤和Vγ9Vδ2T细胞均被靶向，并且其中Vγ9Vδ2 T细胞的特异性肿瘤靶向还诱导Vγ9Vδ2 T细胞的激活。
不诱导激活并且不阻断磷酸抗原激活的免疫球蛋白分子
几个VHH(5D7、5C7、5B11和6C4)显示没有人Vγ9Vδ2 T细胞的激活，它也没有阻断磷酸抗原人Vγ9Vδ2 T细胞激活的效果(图8和图5，左侧部分)。这样的VHH例如用于FACS分选中(参见图7)。
磁珠分离
将抗-Vδ2(例如6H4)或Vγ9纳米抗体(例如6H1)生物素化并与PBMC混合。洗涤细胞以除去未结合的纳米抗体。将具有抗生蛋白链菌素(streptavidin)(例如可得自MiltenyiBiotec)的磁珠加入到混合物中并使用磁性分离柱将通过生物素化的纳米抗体结合至珠的细胞与未结合的细胞分离。关于Vγ9和Vδ2表达，对PBMC进行FACS分析。用抗Vδ2和Vγ9纳米抗体都获得了优异的纯化。例如，对于纳米抗体6H4，4.5％的PBMC表达两条链，在磁珠分离后，97.4％的细胞对Vγ9和Vδ2链都是阳性的。不结合磁珠的细胞部分对于Vγ9和Vδ2链(0％)都是阴性的。
表2.VHH与表达Vγ9Vδ2或不表达Vγ9Vδ2或者表达单一Vγ9或Vδ2链的γδT细胞的结合。
Figure BDA0001168363920000271
Figure BDA0001168363920000281
表3.序列。(B＝结合，不激活，不阻断磷酸抗原激活(PA)；A＝激活；PA＝阻断PA激活)
Figure BDA0001168363920000282
Figure BDA0001168363920000291
Figure BDA0001168363920000301
Figure BDA0001168363920000311
Figure BDA0001168363920000321
Figure BDA0001168363920000331
Figure BDA0001168363920000341
序列表
<110> Stichting VU-VUmc
<120> 免疫球蛋白结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体
<130> P31885PC00
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 美洲驼
<400> 31
Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 32
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 33
Met Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gln Leu Val Val Val Ile Thr Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Glu Tyr Asp Tyr
20
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<211> 17
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 34
Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 35
Ala Phe Ser Gly Ser Asp Tyr Ala Asn Thr Lys Lys Glu Val Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 36
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Met Thr Asp His Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 21
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 37
Ala Phe Ala Gly Asp Ile Pro Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Gly Asp Pro
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Asp Tyr
20
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<213> 美洲驼
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Gly Arg Thr Ser Ser Thr Phe Ser Met Ala
1 5 10
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<213> 美洲驼
<400> 39
Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Ser
1 5 10 15
Asp
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<400> 40
Arg Arg Gly Gly Ile Tyr Tyr Ser Thr Gln Asn Asp Tyr Asp Tyr
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Val Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Arg Met Gly
1 5 10
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<400> 42
Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
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<400> 43
Gly Gly Gly Tyr Ala Gly Gly Thr Tyr Tyr His Pro Glu Glu
1 5 10
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<400> 44
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Cys Ile Ala
1 5 10
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<213> 美洲驼
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Cys Ile Thr Thr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 美洲驼
<400> 46
Tyr Phe Gly Tyr Gly Cys Tyr Gly Gly Ala Gln Asp Tyr Arg Ala Met
1 5 10 15
Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 美洲驼
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1 5 10 15
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Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Asn Phe Ala Gly Ser Val
50 55 60
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115 120
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<213> 美洲驼
<400> 48
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> 美洲驼
<400> 49
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Ala
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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<213> 美洲驼
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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<213> 美洲驼
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
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35 40 45
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<213> 美洲驼
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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65 70 75 80
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Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<213> 美洲驼
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val
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Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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85 90 95
Ala Ala Val Phe Ser Gly Ala Glu Thr Ala Tyr Tyr Pro Ser Asp Asp
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 美洲驼
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Ser Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
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100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> 美洲驼
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Val Phe Ser Gly Ala Glu Thr Ala Gln Tyr Pro Ser Tyr Asp
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
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<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Thr Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Phe Asn Gly Ala Glu Asn Ile Val Pro Ala Thr Thr Thr
100 105 110
Pro Thr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
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<211> 130
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile
100 105 110
Arg Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 60
<211> 130
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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Ala Ala Gln Phe Ser Gly Ala Asp Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ile
100 105 110
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115 120 125
Ser Ser
130
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<211> 130
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Asn Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 62
<211> 127
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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Ala Ala Ala Phe Ser Gly Ser Asp Tyr Ala Asn Thr Lys Lys Glu Val
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 63
<211> 130
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Met Thr Asp His Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
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100 105 110
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Ser Ser
130
<210> 64
<211> 124
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr Phe
20 25 30
Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Arg Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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50 55 60
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<210> 65
<211> 123
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Val Arg Thr Phe Ser Asp Tyr
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35 40 45
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 127
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Cys Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Pro Val
35 40 45
Ser Cys Ile Thr Thr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 67
<211> 25
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 68
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 32
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 69
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 美洲驼
<400> 70
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 71
<211> 315
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Met Leu Ser Leu Leu His Ala Ser Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
Cys Val Tyr Gly Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile
35 40 45
Thr Ile Ser Ala Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu
50 55 60
Val Ile Gln Phe Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys
65 70 75 80
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Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Glu Ala Gln Gln Glu Leu Gly Lys
115 120 125
Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr Asp Lys
130 135 140
Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro Ser
145 150 155 160
Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu Leu
165 170 175
Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Glu Glu Lys Lys
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr
245 250 255
Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu
260 265 270
Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu
275 280 285
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290 295 300
Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
305 310 315
<210> 72
<211> 292
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly
1 5 10 15
Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val
20 25 30
Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala
35 40 45
Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr
50 55 60
Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys
65 70 75 80
Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu
85 90 95
Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala
100 105 110
Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe
115 120 125
Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr
130 135 140
Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser
165 170 175
Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly
180 185 190
Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val
195 200 205
Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe
210 215 220
Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu
225 230 235 240
Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val
245 250 255
His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg
260 265 270
Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Phe Leu
290

Claims (10)

1.一种单域抗体，其包括CDR1区、CDR2区和CDR3区，
其中所述CDR1区、所述CDR2区、所述CDR3区的氨基酸序列分别如下所示：
·分别如SEQ ID NO. 15、 SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17所示，或
·分别如SEQ ID NO. 18、 SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20所示，或
·分别如SEQ ID NO. 23、 SEQ ID NO. 24和SEQ ID NO. 25所示，或
·分别如SEQ ID NO. 15、 SEQ ID NO. 28和SEQ ID NO. 29所示，或
·分别如SEQ ID NO. 31、 SEQ ID NO. 32和SEQ ID NO. 33所示，或
·分别如SEQ ID NO. 31、 SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35所示，或
·分别如SEQ ID NO. 44、 SEQ ID NO. 45和SEQ ID NO. 46所示。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其中所述单域抗体为美洲驼单域抗体或人单域抗体。
3.根据权利要求1或2所述的单域抗体，其包含一个或多个选自SEQ ID NO. 67-70的氨基酸序列的框架区。
4.根据权利要求1或2所述的单域抗体，其中所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 57、SEQ ID NO. 59、SEQID NO. 61、SEQ ID NO. 62或SEQ ID NO. 66所示。
5.一种免疫球蛋白分子，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的单域抗体。
6.编码权利要求1-4中任一项所述的单域抗体或编码权利要求5所述的免疫球蛋白分子的核苷酸序列。
7.宿主细胞，其包含权利要求6所述的核苷酸序列。
8.制备权利要求1-4中任一项所述的单域抗体或权利要求5所述的免疫球蛋白分子的方法，其包括：
-培养权利要求7所述的宿主细胞；
-允许所述宿主细胞表达所述单域抗体或免疫球蛋白；
-获得所述单域抗体或免疫球蛋白。
9.一种双特异性抗体，其包含两个单域抗体，第一单域抗体为权利要求1-4中任一项所述的单域抗体，其中所述第一单域抗体与第二单域抗体连接，其中所述第二单域抗体结合癌细胞或受感染的细胞。
10.权利要求1-4任一项所述的单域抗体、权利要求5所述的免疫球蛋白分子或权利要求9所述的双特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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