KR102359264B1 - 인간 Vγ9Vδ2 T 세포에 결합하는 면역글로불린 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 의학 분야 및 면역학에 관한 것이며, 특히 면역글로불린 분자에 결합하는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 관한 것이다. 면역글로불린 분자에 결합하는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체는 특히 의학 분야 및/또는 변조될 수 있는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 분석에 유용하게 사용된다.

Description

인간 Vγ9Vδ2 T 세포에 결합하는 면역글로불린{IMMUNOGLOBULINS BINDING HUMAN Vγ9Vδ2 T CELL RECEPTORS}
본 발명은 의학 분야 및 면역학(immunology)에 관한 것이다. 본 발명은 T 세포에 결합하는 면역글로불린(immunoglobulins)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들면 항체(antibodies), 단일 사슬 항체(single chain antibodies), 또는 단일 도메인 항체(single domain antibodies)와 같이, 조절(modulated)될 수 있는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자를 제공한다.
인간 성인에서 γδ 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes; PBLs)의 대부분은 Vγ9 및 Vδ2 영역을 포함하는 T 세포 수용체(T-cell receptors; TCRs)를 발현한다. Vγ9Vδ2 T 세포는 병원체 및 종양 세포의 다양한 배열에 대해 반응할 수 있다. 이러한 광범위한 반응성은 TCR 의존적 방식에서 이러한 T 세포 부분집합(subset)을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 인산항원(phosphoantigen)에 의해 부여되는 것으로 이해된다. Vγ9Vδ2 T 세포의 광범위한 항균 및 항 종양 반응은 암 및 감염의 면역 제어에서 직접적인 참여를 암시한다. 또한 질환과의 싸움 외에도, 일부 질환 또는 의학적 치료 Vγ9Vδ2 T 세포는 과자극(overstimulated) 또는 사고로 작동될 수 있다.
따라서, Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화시킬 수 있는 제제(agents)는 병원성 또는 감염된 세포 또는 암에 대한 Vγ9Vδ2 T 세포 반응을 촉진함으로써 감염 또는 암의 치료에 유용할 수 있다. 게다가, Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는 제제는 과자극되거나 사고로 작동된 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 저감시키는데 유용하여 질병 또는 의학 치료에 유용할 수 있다. 마지막으로, Vγ9Vδ2 T 세포에 결합할 수 있으나 Vγ9Vδ2 T 세포의 (인산항원) 활성화에 영향을 주지 않는 제제는 Vγ9Vδ2 T 세포를 선택(selecting) 또는 식별(identifying)하기 위한 세포 표지(labelling)에 유용하다. 따라서, Vγ9Vδ2 T 세포에 결합할 수 있는 제제, 및 Vγ9Vδ2 T 세포의 인산항원 활성을 차단할 수 있거나 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 있는 제제를 제공하는 기술이 필요하다.
발명의 요약: 본 발명은 Vγ9Vδ2 T 세포에 결합할 수 있는 새로운 제제(agents)를 제공한다. 상기 제공된 제제는 면역글로불린(immunoglobulins)이다. 상기 제공된 면역글로불린은 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합한다. 놀랍게도, 본 발명에서 제공되는 면역글로불린은 상당한 서열 상동성을 가지는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 제 1 양태에서, CDR1 영역 및 CDR2 영역을 포함하는, 인간 Vγ9Vδ2 T 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자가 제공되며, 여기서 상기 CDR 1 영역은 서열번호 31(GRTFSNYAMG)의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 CDR2 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 상기 면역글로불린 분자는 바람직하게 단일 도메인 항체(single domain antibody)이다.
또한, 이러한 면역글로불린은 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체 결합에 기여하는 CDR3 영역을 포함하고 면역글로불린 분자의 활동(action)에 영향을 미칠 수 있다. 이는, 이론에 얽매이지 않고, Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 유도함으로써, 또는 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화의 차단도 유도도 아니함으로써, 면역글로불린 분자, 즉 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화 차단과 같은 조절(modulation) 형태(type)의 기능에서 CDR3 서열을 연루시킨다.
바람직하게, 본 발명에 따른 상기 면역글로불린 분자는 CDR3 영역을 포함하며, 상기 CDR3 영역은 서열번호 3, 6, 9, 11, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 30, 33, 35, 37, 40, 43, 및 46의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 CDR3 영역은 하기 상세히 설명한 바와 같이, 결합 및 기능에 제공되는 CDR1 및 CDR2 서열과 결합한다.
도 1: 골격(framework) 영역(1, 2, 3 및 4)이 CDR1, CDR2 및 CDR3과 같이 표시되는, VHH 서열의 정렬(alignment). 각 VHH의 코드도 표시된다(즉, 5C7은 VHH 5C7의 서열).
도 2: VHH 5E7 및 VHH 6F6는 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하지 않는다. 데이터는 양성 대조군(인산항원(pAg+) 발현 HeLa 세포)과 비교하여 건강한 공여자에서 유래된 Vγ9Vδ2 T 세포에 의해 활성화 마커 CD25, 친-염증성 사이토카인 IFN-γ, 및 세포 독성 분자 그랜자인 B(granzyme B)의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 3: VHH 5E7는 건강한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 유도하는 인산항원을 중화한다. 대표적인 예로, 비-특이적 VHH(음성 대조군)이 phosphoAg 유도 Vγ9Vδ2 T 세포 활성을 중화시키지 못하는 반면에, VHH 5E7를 이용한 용량 의존적인 phosphoAg 유도 Vγ9Vδ2 T 세포 활성의 중화를 보여준다. 세로 축은 CD25 발현에 의해 정해진 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 나타내고, 가로축은 다른 VHH 농도를 나타낸다. Vγ9Vδ2 T 세포 자극은 아미노비스포스포네이트 팔미드론산(aminobisphosphonate pamidronate) 투여량 증가와 함께 HeLa 세포에 제시됨으로써 생성된(이는 HeLa 세포에 의해 인산항원 발현 레벨을 증가시키는 결과를 가져옴), 인산항원을 발현하는 HeLa 세포를 이용하여 수행된다.
도 4: Vγ9Vδ2 TCR 특이적 VHH는 건강한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포에서 활성화 및 사이토카인 생성 유도가 가능하다. 데이터는 양성 대조군(인산항원(pAg+) 발현 HeLa 세포; 1로 표준화된) 및 음성 대조군 VHH와 비교하여 건강한 공여자에서 유래된 Vγ9Vδ2 T 세포에 의해 활성화 마커 CD25, 친-염증성 사이토카인 IFN-γ, 및 세포 독성 분자 그랜자인 B(granzyme B)의 상대적인 발현을 나타낸다. 각각의 막대는 개별 Vγ9Vδ2 TCR 특이적 VHH를 나타내고; 개별 VHH는 Vγ9Vδ2 T 세포에서 활성화 및 사이토카인 생산을 유도하는 능력에 관하여 상이하다.
도 5: 건강한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포의 용량 의존적 활성화. 데이터는 비-활성 항-Vγ9Vδ2 TCR VHH 또는 활성 항-Vγ9Vδ2 TCR VHH의 어느 하나의 증가된 농도(10-100-500nM)와 함께 24시간 동안 자극 후 CD25 발현(MFI)에서의 변화를 나타낸다.
도 6: Vγ9Vδ2 TCR 특이적 VHH는 이중 특이적(bispecific) 분자와 같이 종양 항원 특이적 VHH에 융합될 때(fused) 종양 세포 사멸을 촉진할 수 있다. 활성화 항-Vγ9Vδ2 TCR VHH에 융합된 종양-항원 특이적 VHH로 구성된 이중특이적 나노바디구조(nanobody construct)의 존재 또는 부재에서, Vγ9Vδ2 T 세포는 종양 세포주 A431와 밤새(overnight) 공배양(co-cultured)된 실험의 대표적인 예이다. 데이터는 Vγ9Vδ2 T 세포 및 7AAD+ 종양 세포의 CD25 발현(활성화), 및 CD107a 발현(탈과립)을 나타낸다(종양 세포 사멸을 나타냄).
도 7: 유동 세포 계측법(flow-cytometry)을 이용하여 결정된 T 세포 수용체 Vγ9 및/또는 Vδ2 결합 특이성: 대표적인 유동 세포 계측 막대 그래프는 Vγ9Vδ2 TCR 특이적 VHH(오픈된 막대) 및 음성 대조군 VHH(채워진 막대)의 Vγ9Vδ2 TCR 발현 세포에의 결합을 나타낸다.
도 8: 클론 VHH 5C7는 건강한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화시키지 못할 뿐더러 인산항원이 유도된 건강한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 중화시키지 못한다. 대표적인 예로, phosphoAg이 유도된 Vγ9Vδ2 T 세포 활성에서 VHH 5C7의 저해뿐만 아니라 활성화 효과를 입증하지 못한다. 세로축은 CD25 발현에 의해 정해진 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 나타내며, 가로축은 상이한 VHH 농도를 나타낸다. Vγ9Vδ2 T 세포 자극은 아미노비스포스포네이트 팔미드론산(aminobisphosphonate pamidronate) 투여량 증가와 함께 HeLa 세포에 제시됨으로써 생성된(이는 HeLa 세포에 의해 인산항원 발현 레벨을 증가시키는 결과를 가져옴), 인산항원을 발현하는 HeLa 세포를 이용하여 수행된다.
도 9: 면역글로불린의 도식화.
A) 두 중쇄(heavy chains) 및 두 경쇄(light chains)로 구성된 인간 항체; B) 각각의 사슬이 가변 도메인(variable domain)을 포함하고, 이황화 다리(disulphide bridges)를 통해 이량체화(dimerize)될 수 있는, 두 단일 사슬(또는 두 개의 중쇄)로 구성된, 단일 사슬 항체(또는 중쇄로만 이루어진 항체). 이러한 단일 사슬 항체(또는 중쇄로만 이루어진 항체)는 라마 항체(llama antibody)일 수 있다; C) 단일 도메인 항체는 하나의 가변 항체 도메인, 즉 단일 사슬 항체(또는 중쇄만을 포함하는 항체)을 포함한다. 단일 도메인 항체는 도시된 바와 같이 오직 결합 영역으로 구성될 수 있다. 가변 도메인은 회색으로 표시되었으며, 반면 불변 영역(constant region)은 흰색으로 표시되었다. 경쇄의 가변 도메인은 흑색으로 표시되었다.
정의:
다음의 설명 및 실시예에서 다수의 용어가 사용된다. 이러한 용어에 부여할 수 있는 범위를 포함하는, 명세서 및 청구범위 및 구절의 명확하고 일관성 있는 이해를 제공하기 위해 다음의 정의를 제공한다. 다르게 정의되지 않는 한, 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 당업자에 의해 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌의 개시 내용은 참고로 본원에 인용된다.
본 발명의 방법에 사용되는 종래의 기술을 수행하는 방법은 당업자에게 명백 할 것이다. 분자 생물학, 생화학, 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA, 생물 정보학, 게놈 시퀀싱 및 종래 기술과 관련된 분야의 실시는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들면 다음과 같은 문헌에서 논의 및 참조될 수 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; 및 the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.
본 명세서, 그리고 이의 청구범위 및 구절에서, 동사 "포함하다" 및 이의 활용형은 이어지는 단어의 항목이 포함된다는 의미로 비 제한적이지만 구체적으로 언급되지 않는 한 상기 항목은 제외되지 않는다. 이는 동사 "필수적으로 구성된" 뿐만 아니라 "구성된"도 포함한다.
본 발명에 사용된, 단수 형태의 "a," "an" 및 "the"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, "a" DNA 분자를 분리하는 방법과 같이 사용되었을 때, 이는 복수의 분자의 분리를 포함한다(즉, 10s, 100s, 1000s, 10s of thousands, 100s of thousands, millions, 또는 그 이상의 분자).
정렬하다(Aligning) 및 정렬(alignment): 용어 "정렬하다" 및 "정렬"은 상동적 또는 비슷한 아미노산의 짧고 긴 서열의 존재에 기초하여, 두 개 또는 그 이상의 아미노산 서열의 비교를 의미한다. 뉴클레오티드 서열의 정렬을 위한 여러 방법은 당업계에 공지되어 있고 하기에서 추가적으로 설명된다.
“유전자의 발현” 또는 “단백질의 발현”은 공정을 지칭하며, 여기서 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 DNA 영역은 RNA로 전사되고, 이는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나 스스로 활성화하는(예를 들어, 전사 후 유전자 침묵에서 또는 RNAi) 단백질 또는 펩티드(또는 활성 펩티드 단편)으로 세포의 기계적으로 번역될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소들의 결합을 말한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결된"다. 예를 들어, 프로모터 또는 오히려 전사 조절 서열은 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된의 의미는 영역을 암호화하는 두 개 또는 그 이상의 단백질의 결합이 필요할 때, 연결된 DNA 서열이 전형적으로 연속되고, 판독 프레임(reading frame)에서 연속되는 것이다.
용어 "유전적 구조(genetic construct)"는 적절한 조절 영역(즉, 프로모터)에 작동가능하게 연결되어 세포에서 RNA 분자(즉, mRNA)로 전사되는, 영역(전사 영역)을 포함하는 DNA 서열을 의미한다. 유전적 구조는 프로모터, (단백질) 암호화 영역, 스플라이스 공여자 및 수용체(splice donor and acceptor) 사이트, 인트론 및 엑손 서열(intronic and exonic sequences)를 포함하는 5' 리더 서열(5' leader sequence), 즉 번역 개시에서 포함되는 서열, 및 번역 중지 서열 사이트를 포함하는 3' 비 번역 서열(3' non-translated sequence)(3' 비번역서열 또는 3'UTR)와 같은 다양한 작동가능하게 연결된 서열을 포함할 수 있다.
"서열 상동성(sequence identity)"은 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 상동성을 측정한다. 일반적으로, 서열은 최상위 순서 매치가 얻어지도록 서열은 정렬된다. "상동성(Identity)" 자체는 기술 분야에서 인정되는 의미를 가지며, 문서 기술을 이용하여 계산될 수 있다. 다음을 예로 들 수 있다: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 다수의 방법은 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 간의 상동성 측정을 위해 존재하지만 "상동성"은 당업자에게 잘 알려져 있다(Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073). 두 서열 사이의 상동성 또는 유사성을 결정하기 위해 일반적으로 사용하는 방법은 이에 한정되지 않지만 여기에 기재되어 있다(GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073). 상동성 및 유사성 결정을 위한 방법은 검퓨터 프로그램 상에서 암호화된다. 두 서열 간의 상동성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCS program package을 포함하지만 이에 한정되지 않는다(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403).
예로써, 서열번호 31의 레퍼런스 아미노산 서열에 대한 적어도 70%의 "서열 상동성"을 가지는 아미노산 서열에서, 이는 서열번호 31의 레퍼런스 아미노산의 10 개의 아미노산 각각에서 최대 3개의 아미노산 변형까지 포함될 수 있는 폴리펩티드 서열을 제외하고, 아미노산 서열은 레퍼런스 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 따라서, 레퍼런스 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열의 상동성 비율은 레퍼런스 아미노산 서열의 총 길이에 걸쳐 계산된다. 다른 말고, 레퍼런스 아미노산 서열에 적어도 70%의 상동성을 포함하는 아미노산 서열을 획득하기 위해, 레퍼런스 서열에서 아미노산 잔기의 최대 30%가 삭제 또는 다른 아미노산으로 치환된어야 하거나, 레퍼런스 서열에서 총 아미노산 잔기의 최대 30% 아미노산 개수가 레퍼런스 서열에 삽입될 수 있다. 레퍼런스 서열의 변화는 레퍼런스 아미노산 서열의 아미노(amino-) 또는 카르복시(carboxy-) 말단 위치에서 일어나거나, 레퍼런스 서열 또는 레퍼런스 서열 내 연속된 그룹의 하나 또는 그 이상의 잔기 사이에서 개별적으로 어느 것이 산재되어 이들의 말단 위치 사이에서 일어난다.
본 발명에 따른 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 각각 피리미딘(pyrimidine) 및 퓨린(purine) 베이스, 바람직하게 시토신(cytosine), 티민(thymine), 및 우라실(uracil) 및, 아데닌(adenine) 및 구아닌(guanine)의 임의의 중합체 또는 올리고머를 포함한다(참조; Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub. 1982), 본 발명의 목적을 위해 전체가 참조로 인용됨). 본 발명은 임의의 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide), 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 또는 펩티드 핵산 성분(peptide nucleic acid component), 및 이들의 베이스의 메틸화(methylated), 히드록시메틸화(hydroxymethylated) 또는 글리코실화(glycosylated) 형태와 같은 이들의 임의의 화학적 변이체, 및 이의 유사체를 고려한다. 중합체 또는 올리고머는 조성물 내에서 이종(heterogeneous) 또는 동종(homogenous)일 수 있고 자연적으로 일어나는 공급원으로부터 분리될 수 있거나 인위적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. 추가적으로, 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고 또는 이들이 혼합물일 수 있으며, 호모듀플렉스(homoduplex), 헤테로듀플렉스(heteroduplex), 및 하이브리드 상태(hybrid states)를 포함하여 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태에서 영구적(permanently)으로 또는 과도적(transitionally)으로 존재할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "암(cancer)"은 포유동물에서 비 조절 세포 성장에 의해 전형적으로 특징화 되는 신체적인 상태를 기술한다. 암의 예로는, 이에 한정되지 않으나, 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 전립선 암(prostate cancer), 간세포 암(hepatocellular cancer), 위암(gastric cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 자궁암(cervical cancer), 난소 암(ovarian cancer), 간암, 방광암(bladder cancer), 요도 암(cancer of the urinary tract), 갑상선 암(thyroid cancer), 신장 암(renal cancer), 암종(carcinoma), 피부 암, 혈액 암(blood cancer), 백혈병(leukemia), 흑색 종(melanoma), 두경부 암(head and neck cancer) 및 뇌 암(brain cancer)을 포함한다. 본 발명에서 사용된 "암"은 악성 신생물(malignant neoplasm)로 칭한다.
용어 "아미노산 서열(amino acid sequence)" 또는 "단백질(protein) 또는 "펩티드(peptide)"는 작동의 특정 모드, 사이즈, 3차원 구조 또는 기원의 레퍼런스 없이 아미노산의 사슬로 구성된 분자를 지칭한다. 이들의 "단편(fragment)" 또는 "부분(portion)"은 따라서 여전히 "아미노산 서열" 또는 "단백질" 또는 "펩티드"로 지칭된다. "분리된 아미노산 서열(isolated amino acid sequence)"은 예를 들어 이들의 오리지날 자연적인 환경에서, 인비트로에서, 또는 재조합 박테리아 또는 인간 수주 세포에서 더이상 존재하지 않는 아미노산 서열을 지칭하는데 사용한다.
"T 세포" 또는 "T 림프구(T lymphocytes)"는 세포 매개 면역에 중요한 역할을 하는 림프구라는 백혈구 그룹에 속한다. T 세포는 흉선(thymus; T는 여기서 부터 유래함)에서 성숙한 골수의 조혈 줄기세포에서 유래하며, 말초 림프 조직에서 이들의 모든 기능을 얻는다. T 세포가 성장하는 동안, CD4-CD8- T-세포(CD4 및 CD8 공동 수용체 모두에게 음성)는 초기 β 또는 δ TCR 유전자 재배열(gene rearrangement)의 결과와 같은 αβ 또는 γδ 운명(fate)에 전념한다. 초기 β 사슬을 겪은 세포는 세포 구조 상의 완전 β 사슬 및 pre-TCRα으로 구성된 pre-TCR 구조를 발현한다. 이러한 세포가 CD4+CD8+로 전환하면, TCRα 사슬 유전자좌를 재배열하고, 성숙한 αβTCR을 표면에 발현한다. β 유전자 재배열 전 γ 유전자 재배열이 성공적으로 완성되면 CD4-CD8- T-세포는 기능적인 γδTCR을 발현하고 CD4-CD8-로 남는다(Claudio Tripodo et al. Gamma delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6, 707-717(December 2009). T 세포 수용체는 CD3 단백질 복합체와 연관된다. 성숙한 T 세포, 즉 αβTCR 또는 γδTCR를 발현하는 T 세포는 세포 표면에 T 세포 수용체 복합체를 발현한다. 인간 말초 혈액의 T 세포의 총 군집의 약 1 내지 5%로 구성된 γδT 세포는 하위 집단으로 더 분류될 수 있다. γδT 세포의 하위 집단은 Vγ9Vδ2 TCR을 발현하는 Vγ9Vδ2 T 세포를 구성한다. 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, CDR3)은 T 세포 수용체의 세포 외 도메인 내에 위치한다. 이들 영역은 일반적으로 가변 도메인이며 TCRs 간의 다양성에 크게 기여한다. CDR 영역은 T 세포가 성장하는 동안 가변(Variable-(V)), 다양(Diversity-(D)) 및 접합(Joining-(J))이라 불리는 유전자 세그먼트가 다양한 TCRdmf 생성하도록 무작위로 조합될 때 구성된다.
"Vγ9Vδ2 T 세포"는 소위 인산항원(phosphoantigens)이라는 비 펩티드 인산화 이소프레노이드 전구체(non-peptidic phosphorylated isoprenoid precursors)의 집합에 의해 특이적으로 및 신속하게 활성화되는 것으로 기능적으로 정의될 수 있는 세포이다. 인산항원은 거의 모든 살아있는 세포에서 생산된다. 동물 및 인간 세포(암 세포 포함)에서 가장 흔한 인산항원은 isopentenyl pyrophosphate (IPP) 및 이들의 이성질체(isomer) dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP)이다. IPP는 메발로네이트 경로의 대사산물이다. (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP 또는 HMB-PP)는 이소프레노이드 생합성의 비 메발로네이트 경로의 중간체이다. HMBPP는 말라리아 원충(Plasmodium) (말라리아를 일으키는) 및 톡소포자충(Toxoplasma gondii)와 같은 원생동물(parasitic protozoans) 뿐만 아니라 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 포함하여 대부분의 병원성 박테리아에서 필수적인 대사산물이다. Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화는 클론 확장, 세포 독성 활성 및 사이토카인의 발현을 포함한다. "Vγ9Vδ2 T 세포"는 또한 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체의 발현에 의해 정의된다. 예를 들어, 세포는 하기 기술되는 바와 같이 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 대해 특이적인 항체를 사용하여 선택될 수 있다. 이들 선택된 세포는 γ and δ 유전자의 재배열을 겪고, Vγ9 T 세포 수용체 사슬 및 Vδ2 T 세포 수용체 사슬을 암호화한다. 이러한 선택된 세포들로부터, Vγ9 T 세포 수용체 사슬 및 Vδ2 T 세포 수용체 사슬에 대응되는 핵산(또는 아미노산) 서열이 결정될 수 있다.
당업자는 본 명세서 전반에 걸쳐 설명된 바와 같이 세포 표면에서 항원 또는 수용체의 발현에 의해 특징지어지는 세포 집단을 선택 및/또는 식별할 수 있다. 이는 CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, γδTCR 및 Vγ9Vδ2 TCR과 같은 세포 표면에서의 발현과 관련이 있는 것으로 이해되며, 이는 전형적으로 낮은 발현을 가지는 세포와 비교했을 때, 항원 또는 수용체의 발현 수준이 매우 높은 세포의 일부인, 세포 집단에서 수행된다. 따라서, 양성 또는 음성의 용어는 상대적으로 이해되어야 하며, 즉, 양성 세포는 음성 세포와 비교하여 높은 발현 수준을 가지는 것이다. 이러한 점에서 음성적인 세포는 탐지될 수 있는 발현 수준을 여전히 가지고 있을 수 있다. 세포의 표면의 발현은 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)을 이용하여 분석될 수 있고, 본 발명의 실시예에서 개시되고 적용 가능한 적절한 FACS 분석을 위한 많은 특이적 항체, 즉 CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, γδTCR, Vγ9 TCR 사슬 및 Vδ2 TCR 사슬에 대해 상업적으로 입수가 가능하다. 이러한 특이적 항체는 이들 각각의 항원 또는 수용체에 결합하는 면역글로불린이다. 따라서, Vγ9Vδ2 T 세포는 FACS에서 Vγ9Vδ2 TCR에 양성인 것으로 선택되고 정의될 수 있다. FACS 또는 유사한 분리 기술(예를 들어, 마그네틱 비드에 접합되는 항체)에 적절한 항체는 널리 이용가능하다. 음성 및/또는 양성 세포의 선택이 허용되는 항체 제조업체에서 제공하는 바와 같이 조건은 선택된다. BD Pharmingen (BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)로부터 Vγ9Vδ2 T 세포 또는 조작된(engineered) Vγ9Vδ2 T 세포의 선택에 적절한 항체는, Vγ9-PE (clone B3, #555733), Vγ2-FITC (clone B6, #555738),γδTCR-APC (clone B1, #555718)이고, Beckman Coulter로부터는 pan-γδTCR-PE (clone IMMU510, #IM1418U)이다. CD25 및 CD69의 검출에 적절한 항체의 예는 CD25-PE (clone M-A251, #555432) 및 CD69-FITC (clone L78, #347823)이며 BD Pharmingen에서 입수가능하다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 제 1양태에서, CDR1 영역 및 CDR2 영역을 포함하는, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자가 제공되며, 여기서 상기 CDR1 영역은 서열번호 31(GRTFSNYAMG)의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CDR2 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며; 여기서 상기 면역글로불린 분자는 바람직하게 단일쇄 항체(single chain antibody)이다.
본 발명에 따른 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 서열번호 71 및 서열번호 72에서 열거된 Vγ9 및 Vδ2T 세포 수용체 사슬의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같이 즉, Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자이다. 이러한 T 세포 수용체에의 결합은 실시예 부분에 개시된 바와 같이 FACS 분석을 통해 검출될 수 있다. 예를 들어, Vγ9Vδ2 T 수용체를 발현하는 세포, 즉 서열번호 71 및 72는 대조군 면역글로불린 분자 또는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자 중 하나와 접촉한다. 대안적으로, 실시예에서 기술된 바와 같이 건강한 공여자 유래의 Vγ9Vδ2 T 세포는 대조군 면역글로불린 분자 또는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자 중 하나와 접촉할 수 있다. 세포에 결합된 면역글로불린의 양은 특이적인 면역글로불린 분자가 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하지 않는 대조군 면역글로불린 분자와 비교하되었을 때 증가된다(실시예 도 7 참조). 본 발명에 따른 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 유세포 분석에 의해 결정된, 대조군 면역글로불린에 상대적으로 평균 형광 강도(MFI)의 최소 2배 증가 결과를 초래하는 면역글로불린으로 정의될 수 있다. 상기 MFI는 선택된 형광 채널에서 형광 강도의 평균이다(FITC, PE, PerCP, 등). 음성 대조군 항체로써, azo-dye reactive red 6 (RR6)에 대한 단일 도메인 항체(또는 VHH, 나노바디)가 사용될 수 있다(Spinelli S et al, Biochemistry 2000;39:1217-1222). 따라서, 당업자는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체와 면역글로불린 분자의 결합을 결정하는 적절한 조건의 선택이 가능하다. 면역글로불린 결합은 특이성(specificity) 및 친화성(affinity)의 용어에서 표현될 수 있다. 상기 특이성은 항원 또는 이들의 에피토프(epitope)가 면역글로불린 분자에 의해 결합되는 것임을 결정한다.
본 명세서에서 쓰이는 "면역글로불린 분자"("Ig"로 약칭)는 공지된 용어이며 "항체"라는 용어를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "면역글로불린" 용어는 상보적 결정 영역(CDR)과 함께 항원-결합 사이트를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 항체, 단일클론 항체, 특이 항체(monospecific antibodies), 다중 특이성 항체(multispecific antibodies), 인간화 항체(humanized antibodies), 키메라 항체(chimeric antibodies), 인간 항체(human antibodies), 단일 사슬 항체(single chain antibodies), 오직 중쇄 항체(heavy chain only antibodies), 라마 항체(llama antibodies), 단일 도메인 항체(single domain antibodies) 및 나노바디(즉, VHH)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "면역글로불린 분자" 용어는 Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 다른 항체 단편 또는 항원-결합 기능을 보유하는 CDRs을 포함하는 다른 구조들과 같은 면역글로불린 단편을 또한 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 단편은 항원-결합 도메인을 포함한다. 면역글로불린 분자 또는 이들의 단편은 공지된 항체 이소타입 및 이들의 입체형, 예를 들면 IgA1 또는 IgA2과 같은 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4과 같은 IgG, 또는 IgM 클래스 중 임의의 것일 수 있고, 또는 IgG1 및 IgG2a 클래스로부터 항체의 혼합물과 같은, 어떤 조합에서 이들의 혼합물로 구성할 수 있다.
면역글로불린은 단백질 관련 면역 시스템이다. 인간 항체는 네 개의 폴리펩티드- 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 "Y" 모양의 분자를 형성하기 위해 결합되어 구성된다(도 9A 참조). "Y"의 선단의 아미노산 서열은 상이한 항체 간에 다양하다. 각각의 상단은 항원 결합에 특이적이다. 인간 항체의 가변 영역은 경쇄 및 중쇄의 끝 부분, 즉 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 포함한다. 불변영역은 면역 시스템을 활성화하기 위해 사용되는 메커니즘을 결정한다.
항체는 이들의 중쇄 불면 영역 구조 및 면역 기능에 기초하여, 5개의 주요 클래스, IgM, IgG, IgA, IgD, 및 IgE로 분할된다. 또한 중쇄의 서브 클래스가 알려져 있다. 예를 들어, 인간에서 IgG 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스 중 어느 것일 수 있다.
각 사슬, 즉 면역글로불린 분자는 가변 도메인을 가진다. 면역 글로불린 분자의 가변 도메인은 초가변(hypervariable; HV) 및 골격(framework; FR) 영역으로 구분된다. HV 영역은 주어진 위치에서 그 위치에서 가장 흔한 아미노산과 비교하여 상이한 아미노산의 높은 비율을 가진다. 초가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)로 언급된다. 면역글로불린 분자는 세 개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 가진다. 더 적은 가변 아미노산 서열과 함께, 네 개의 골격 영역은 CDR 영역으로 분리한다. CDR 영역은 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체(실시예 도 1 참조, 여기서 골격 영역 및 CDR 영역은 선택된 VHH로 표시됨)와 같은 항원에 직접적 결합이 가능하다. 골격 영역은 항원과 접촉하는 CDR 영역을 배치할 수 있는 지지체를 제공하는 베타-시트 구조(beta-sheet structure)를 형성한다.
라마 항체는 두 개의 중쇄로 구성된다(도 9B 참조). 각각의 중쇄는 단일 가변 도메인과 함께 면역글로불린 분자이다. 이러한 항체는 단일 사슬 항체라 지칭하며, 이는 사슬의 한 타입을 포함한다. 이러한 항체는 또는 오직 중쇄 항체로 지칭될 수 있다.
단일 도메인 항체는 단일 단량체 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자이다(도 9C 참조). 단일 도메인 항체는 따라서 단일 CDR1, 단일 CDR2 및 단일 CDR3를 포함한다. 단일 도메인 항체는 단일 사슬 항체(또는 오직 중쇄 항체)로부터 유래될 수 있다. 전체 항체와 같이, 단일 도메인 항체는 항원 특이적으로 선택적으로 결합할 수 있다. 단일 도메인 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 골격 영역을 가지는 면역글로불린 사슬의 가변 도메인만을 포함할 수 있고, 이러한 항체는 VHH 또는 나노바디로 지칭될 수 있다. 약 12 내지 15 kDa의 분자량과 함께, 나노바디는 일단 항체(150 내지 160 kDa)보다 훨씬 작으며, 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄로 구성된다.
CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 종 간에 교환할 수 있다. 예를 들어, 라마 면역글로불린 분자로부터, CDR 서열은 라마 CDR 서열로부터 유래한 특이성을 가지는 인간 면역글로불린 분자를 획득하기 위해, 인간 면역글로불린 분자에서 선택될 수 있고 CDR 서열과 교환될 수 있다. 이는 인간 서열이 오리지날 라마 골격 서열과 비교하여 인간에 대한 적은 면역원성이 될 수 있어 유리할 수 있다. 이러한 CDR 서열의 교환은 인간화(humanization)로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 면역글로불린 분자, 단일 사슬 항체, 및 단일 도메인 항체는 인간 유래 면역글로불린 서열 또는 라마 유래 면역글로불린 서열을 가질 수 있으며, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체 결합에 제공되기 위한 본 발명에 따른 CDR 서열로 대체되는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 인간 항체는 인간 중쇄 사슬 서열에 해당하는 서열을 포함할 수 있지만, CH1 도메인이 삭제된 돌연변이된 것일 수 있고, 이러한 라마 유사 단일 사슬 항체가 형성되고(도 9B 참조), 본 발명에 따른 CDR 서열에 의해 대체된 사기 인간 중쇄 사슬 서열의 CDR 영역을 가진다. 따라서, 인간 면역글로불린, 인간 단일 사슬 항체 또는 인간 단일 도메인 항체는 골격의 근원 및/또는 불변 영역으로 지칭되지만, 본 발명의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 근원으로 지칭되지 않는다.
실시예 부분에서 기재된 바와 같이, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 인간 공여자 유래의 Vγ9Vδ2 T 세포 및 파아지 디스플레이와 함께 라마(Llama glamas)를 면역화하는 단계를 포함하는 전략을 사용함으로써 선택된다. 선택된 VHH 서열은 분석되어 표 3에 열거 및 도 1에 도시하였다. 선택된 VHH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 하기 표 1에 열거하였다. CDR 각각은 표 3에 이에 대응하는 서열번호와 함께 열거하였다.
CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 선택된 20개의 VHH 리스트. 레퍼런스(Ref.) CDR1 및 CDR2는 상기에서 열거되었으며(각각 서열번호 31 및 서열번호 32에 해당), 상대적인 레퍼런스(Ref.) CDR1 및 CDR2와 CDR1 및 CDR2 영역 각각의 서열 상동성(%)이 나열된다.
CDR1 % CDR2 % CDR3
Nr Ref GRTFSNYAMG AISWSGGSTYYADSVKG
1 5C7 GRTFSRYTMG 80 AISWSGGRTNFAGSVKG 71 DWLPVPGRESYDY
2 5E3 GRTFSSYAMG 90 AISWSGGTTYYADSVKG 94 SLDCSGPGCHTAEYDY
3 6H1 GRTFSEYAMG 90 AISWTGSKTYYADSVKG 82 SSDCSGPGCHTEEYDY
4 5G3 GRTFSSYAMG 90 AVSWSGGSTYYADSVKG 94 SQDCSGPGCYTNEYDS
5 5C1 GSIFSNYAMA 70 AVSWSGGRTYYADSVKG 88 SLSCSGPGCSLEEYDY
6 5D3 GRPFSNYAMG 90 VISWSGGSTYYADSVKG 94 QFSGASTVVAGTALDYDY
7 6E3 GRPFSNYGMG 90 GISWSGGSTDYADSVKG 88 VFSGAETAYYPSDDYDY
8 6H4 GRPFSNYGMG 90 GISWSGGSTDYADSVKG 88 VFSGAETAYYPSDDYDY
9 6C1 GRPFSNYGMG 90 GISWSGGSTDYADSVKG 94 VFSGAETAYYPSDDYDY
10 6H3 GRPFSNYGMG 90 GITWSGGSTHYADLVKG 76 VFSGAETAYYPSTEYDY
11 6G3 GRPFNNYGMG 70 GISWSGGSTYYADSVKG 94 VFSGAETAQYPSYDYDY
12 6F6 GRPFSNYAMG 90 AVTWSGGSTYYADSVKG 88 QFNGAENIVPATTTPTSYDY
13 5C8 GRPFSNYAMG 90 AISWSGGSTSYADSVKG 94 QFSGADYGFGRLGIRGYEYDY
14 5E7 GRPFSNYAMG 90 AISWSGGSTSYADSVKG 94 QFSGADYGFGRLGIQGYEYDY
15 5F5 GRTFSNYAMG 100 AISWSGGSTYYADSVKG 100 MFSGSESQLVVVITNLYEYDY
16 6A1 GRTFSNYAMG 100 TISWSGGSTYYADSVKG 94 AFSGSDYANTKKEVEYDY
17 5D7 GRTFSNYAMG 100 AISWSGGMTDHADSVKG 82 AFAGDIPYGSSWYGDPTTYDY
18 5B11 GRTSSTFSMA 50 AINWSGGSTRYADSVSD 76 RRGGIYYSTQNDYDY
19 6C4 VRTFSDYRMG 70 TISWSGGLTYYADSVKG 94 GGGYAGGTYYHPEE
20 6E4 GFTFDDYCIA 40 CITTSDGSTYYADSVKG 76 YFGYGCYGGAQDYRAMDY
인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하기 위해 발명자들에 의해 선택된 면역글로불린은 놀랍게도 CDR1 및 CDR2에 관한 실질적인 서열 상동성을 가지고 있었다. 이론에 구애되지 않고, 이러한 CDR1 및 CDR2 서열은 실질적으로 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합에 기여한다. 더 많은 다양성은 CDR3 영역에서 발견되며, 이론에 구애되지 않고, 이는 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는, Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 유도하는, 또는 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성을 차단도 유도도 안하는 조절 타입인, 면역글로불린 분자의 기능성에서 CDR3 서열이 연루되어 있다. 따라서, 면역글로불린 분자는 CDR1 및 CDR2 영역을 포함하고, 여기서 CDR1 영역은 서열번호 31(GRTFSNYAMG)의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CDR2 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게 CDR2 영역은 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 면역글로불린 분자는 단일 사슬 항체이다. 상기 언급한 바와 같이 면역글로불린은 라마로부터 유래된다. 라마는 이황화 다리(disulphide bridges)를 통해 이량체화되는, 즉 라마 항체는 두 사슬로부터 두 개의 단일 가변 도메인을 가지는 단일 중쇄와 함께 항체를 생산한다(도 9B 참조).
하나의 실시양태에서, CDR2 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 9에서 T, 위치 12에서 A, 및 위치 15에서 V를 가진다. 선택된 CDR2 영역의 서열을 비교할 때 이러한 위치에서의 아미노산은 변화를 보이지 않는다. 따라서, 이론에 제한되지 않고, 이러한 위치는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는데 중요한 것으로 보인다. 이는 상기 위치가 레퍼런스 서열에서이 위치와 관련된 것을 언급되고 전체적으로 면역글로불린 분자에서 상기 위치로 언급되지 않는 것으로 이해된다. 따라서, CDR2 영역은 특정 위치에서 서열번호 32에 대한 동일한 아미노산을 가진다.
실시예 부분에서 기재한 바와 같이, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 라마 항체로부터 선택된다. 따라서, 본 발명에 따른 단일 사슬 항체는 라마로부터 유래된 면역글로불린 분자 서열을 포함한다. 이는 이러한 라마 단일 사슬 항체에서, 오리지날 CDR 서열이 대체 CDR 서열의 특이성을 가지는 라마 단일 사슬에 도달하도록, 표 1에 나열된 바와 같은 대체 CDR 서열에 의해 대체된다. 마찬가지로, 인간 중쇄 서열과 함께 동일하게 수행될 수 있다. 인간 단일 사슬 항체는 특이성을 가지는 것 보다 대체 CDR 서열에 의해 적용된다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 다른 골격으로의 전달, 즉 인간 골결과 같은 다른 종에의 전달이 당업계에 잘 알려져 있다.
하나의 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 단일 도메인 항체이다. 단일 사슬 항체는 골격 영역을 포함한다. 따라서, 인간 단일 도메인 항체는 인간 골격 영역, 즉 다른 인간 중쇄 및/또는 인간 경쇄 사슬 서열 및 본 발명의 CDR1, CDR2 및 CDR 3 서열로부터 유래된 것 중 어느 것을 가질 수 있다. 라마 단일 도메인 항체는 라마 골격 영역이다.
하나의 실시양태에서, 하나 또는 그 이상의 골격 영역은 서열번호 67 내지 70의 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택된다. 이러한 골격 영역은 분리된 VHH 클론의 하나에서의 골격 영역이다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 분리된 20 클론으로부터 골격 영역은 크게 변화하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 면역글로불린 분자, 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체는 CDR3 영역을 포함하고, 상기 CDR3 영역은 서열번호 3, 6, 9, 11, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 30, 33, 35, 37, 40, 43, 및 46의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 CDR3 영역은 후술하는 바와 같이, 결합 및 기능을 위해 제공되는 CDR1 및 CDR2 서열과 조합된다.
하나의 실시양태에서, 면역글로불린 분자, 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체는 표 1에 나열된 바와 같이 항체로부터 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열의 조합을 가진다. 하나의 실시양태에서, 면역글로불린 분자, 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체는 서열번호 47 내지 66으로 구성된 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 개시된 본 발명에 따른 면역글로불린 분자는 의학 치료에 사용하기 위해 제공된다. 이는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포가 인비보에서, 즉 의학 치료에서 결합될 때, 면역글로불린 분자가 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체가 결합하고, 면역글로불린 분자가 인간 Vγ9Vδ2 T 세포에 대해 직접적으로 면역 반응을 일으킬 수 있는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포에 결합함으로써 완전히 기능적인 면역글로불린 분자인 것이 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 이와 같은 시나리오에서, 기능적인 불변 영역을 가지지 않는, 즉 비활성화된 또는 삭제된, 면역글로불린 분자는 바람직하게 나노바디 및 VHH와 같은 것이다. 이는 특히 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 작용이 인비보에서 요구될 때 유용할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 따른 면역글로불린 분자를 암호화하는 것을 제공한다. 본 명세서에 개시된 서열은 아미노산 서열이다. 따라서, 당업자는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이 가능하며, 아미노산 서열을 뉴클레오티드 서열로 변환하기 위한 코돈 표를 사용하도록 요구될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 항체가 발현될 수 있는 유전 구조체를 제공하도록 프로모터 서열, 폴리 A 신호 등에 작동 가능하도록 연결될 수 있다. 이러한 유전 구조체는 숙주 세포 내에서 구성될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 분자를 제조하기 위해 제공되는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
-본 발명에 따른 면역글로불린 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계;
- 숙주 세포가 면역글로불린을 발현하도록 하는 단계;
- 면역글로불린을 수득하는 단계.
또한, 본 발명은 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자를 제공하며, 여기서 상기 면역글로불린 분자는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는 면역글로불린 분자이다. 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화 차단은 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화가 바람직하지 않은 조건 및/또는 치료에 유용한다.
Vγ9Vδ2 T 세포는 포유류 메발론산염 경로(mevalonate pathway) 또는 미생물 디옥시자일룰로스-인산화 경로(deoxyxylulose-phosphate pathways)로부터 인산항원(pAg)으로 지칭되는, 작은 비펩티드 인산화 중간체에 의해 강하고 특이적으로 활성화될 수 있다. 인산항원은 pAg 및 butyrophilin3A1/CD277 분자가 부착된 멤브레인 사이에서의 작용을 통해 Vγ9Vδ2 T 세포에 의해 특이적으로 인식된 것일 수 있다. 실시예에서 개시한 바와 같이, Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화가 유도된 인산항원을 차단할 수 있다.
바람직하게, Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자이며, 여기서 면역글로불린 분자는 CDR1 영역 및 CDR2 영역을 포함하는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자로, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는 면역글로불린 분자이며, 여기서 상기 CDR1 영역은 서열번호 31(GRTFSNYAMG)의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CDR2 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며; 및 상기 면역글로불린 분자는 바람직하게 단일쇄 항체(single chain antibody)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자의 CDR2 영역은 서열번호 2(AISWSGGSTYYADSVKG)와 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기사 상기 아미노산 서열은 위치 9에서 T, 위치 12에서 A, 및 위치 15에서 V를 가진다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 단일 도메인 항체이며, 바람직하게 상기 단일 도메인 항체는 라마 단일 사슬 항체 또는 인간 단일 사슬 항체로부터 유래된 것이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자 또는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 상체는 서열번호 67 내지 70의 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 골격 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 의학 치료에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 의학 치료에 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 의학 치료는 메발론산 경로 억제제 사용을 포함하거나 상기 의학 치료는 암의 치료를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자는 감영성 질환의 치료를 포함하는 의학 치료에 사용하기 위한 것이다.
pAg 생산의 다운스트림에 작용하는 메발론산 경로의 억제제는 통상 임상적 처방되는 파미드로네이트(pamidronate), 알렌드로네이드(alendronate), 리세드로네이트(risedronate), 이반드로네이트(ibandronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate)와 같은 아미노비스포스포네이드(aminobisphosphonates)를 포함한다. 다른 클래스의 화합물은 이소부틸아민(isobutylamine), 이소아밀아민(isoamylamine), 및 n-부틸아민(n-butylamine)과 같은 알킬아민(alkylamines)을 포함한다. 이러한 화합물은 페제트병(Paget`s disease), 골다공증(osteoporosis), 고칼슘혈증(hypercalcemia) 및 골격 이벤트(skeletal events)의 예방 치료에 사용될 수 있다. 이는 내인성 pAg isopentenyl-pyrophosphate (IPP)의 세포 내 축적 및 Vγ9Vδ2 T 세포의 이어지는 선택적 활성화 및 확장의 결과를 가져온다. 아미노비스포스포네이드 투여는 Vγ9Vδ2 T 세포의 선택적 활성에 따른 급성 발열 반응을 자주 수반한다. 이러한 급성기 반응은 하루에 한번 피크를 가지고 3일 동안 평균길이를 가지며, 주로 발열, 오한, 홍조, 급성 근골격계 증상, 통증, 전신 불편으로 구성되고, 등, 목, 가슴 또는 어깨를 포함하는 지역적인 불편함을 나타내며, 메스꺼움, 구토, 설사를 나타낸다. 따라서, 의학 치료에서 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 페제트병, 골다공증, 뼈 전이(bone metastases), 및 고칼슘혈증(hypercalcemia)의 환자에 아미노비스포스포네이드 투여에 의한 급성기 반응을 예방할 수 있다. 또한, 이러한 면역글로불린 분자는 인비보에서 Vγ9Vδ2 T 세포의 과도한 활성화의 의학 치료에서 유리할 수 있으며, 이는 예를 들어 Vγ9Vδ2 T 세포가 과자극되거나 만성적으로 자극되거나 특정 암 환경에 있을 때 감염된 동안 발생할 수 있고, 여기서 종양 세포에서 메발론산 경로의 만성 과활동성은 Vγ9Vδ2 T 세포 고갈의 결과를 초래할 수 있다. 이러한 (과)자극은 환자에서 예를 들어 기준 레벨과 비교하여 Vγ9Vδ2 T 세포에서의 증가를 측정할 수 있고, 또는 Vγ9Vδ2 T 세포에서 CD69 (초기 활성화 마커) 또는 CD25 (후기 활성화 마커)와 같은 표면 마커의 상향조절과 결합하여, 5% 이상의 T 세포는 Vγ9Vδ2 T 세포인, 비 정상적인 Vγ9Vδ2 T 세포의 레벨을 측정할 수 있다. 이는 혈액에서 조직으로의 Vγ9Vδ2 T 세포의 이동에 의한 것이며, Vγ9Vδ2 T 세포의 비 정상적인 레벨 측정은 요구되지 않는다. 반면에, 만성 과자극에서, Vγ9Vδ2 T 세포는 덜 활성화될 수 있을 뿐 아니라, 과자극의 표시가 될 수 있다. 사이토카인 생산(IFN-gamma, TNF-alpha) 및 세포 독성 과립 함량은 유동 세포 계측법에 의해 세포 내에서 측정할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 CDR3 영역을 포함하는 면역글로불린 분자이며, 상기 CDR3 영역은 서열번호 27 내지 30의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하는 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하기위해 사용된다. 본 실시양태에 따른 상기 면역글로불린 분자(단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체를 포함하는)는 활성화 차단을 위해 본 실시예에서 기술한 바와 같은 분석에 이용된다.
본 발명은 또한 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 면역글로불린 분자를 제공하며, 이는 CDR1 영역 및 CDR2 영역을 포함하는, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자이고, 여기서 CDR1 영역은 서열번호 31(GRTFSNYAMG)의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 CDR2 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 면역글로불린 분자는 바람직하게 단일 사슬 항체이다. 하나의 실시양태에서, CDR2 영역은 서열번호 2(AISWSGGSTYYADSVKG)와 적어도 60%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 9에서 T, 위치 12에서 A, 및 위치 15에서 V를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 단일 도메인 항체이며, 바람직하게 상기 단일 도메인 항체는 라마 단일 사슬 항체 또는 인간 단일 사슬 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 단일 도메인 항체이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자 또는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체는 서열번호 67 내지 70의 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택되는 골격 영역의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
바람직하게, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 상기 면역글로불린 분자는 CDR3 영역을 포함하며, 상기 CDR3 영역은 서열번호 6, 9, 11, 14, 17, 20, 22, 25, 29, 33, 35, 및 46의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
Vγ9Vδ2 T 세포를 이용하기 위한 목표인 현재 전략은 이들의 조직적 활성화(아미노비스포스포네이트 또는 BrHPP와 같은 합성 인산항원) 또는 Vγ9Vδ2 T 세포의 대체 전송에 의존한다. 이러한 접근은 잘 기록된 환자 및 항종양 활성의 징후에 의해 허용되는 것으로 보여진다. 그러나, 결과는 광범위한 임상 적용을 허용할 정도로 일치하지 않는다. 기재된 전략은 Vγ9Vδ2 T 세포의 전신적 활성화 결과를 초래하나, 이들의 항 종양 효과를 발휘하기 위해 예상되는 종양, 이러한 세포의 특정 집단을 초래하지 않는다. 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하고, 제제에 연결되는 것이 바람직한 면역글로불린 분자는 임상에서 Vγ9Vδ2 T세포를 활성화하는데 사용될 수 있다.
바람직하게, 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 면역글로불린 분자는 제제에 연결되어 있다. 상기 제제는 바람직하게는 암 세포 또는 감염된 세포, 즉 바이러스에 감염된 또는 비-숙주 세포 즉 박테리아에 감염된 세포를 타겟으로 결합할 수 있는 제제이다. 바람직하게 상기 제제는 면역글로불린 분자이다. 더욱 바람직하게는, 상기 면역글로불린 분자가 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체이다. 제제와 결합함으로써, 상기 제제는 전신 활성화와 달리, 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 작용이 필요로 하는 사이트에서 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 모집하고 활성화할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 면역글로불린 분자는 종양 특이적 항체, 항바이러스 항체, 또는 항 박테리아 항체와 결합할 수 있다. 이러한 종양 특이적 항체는 어떤 항체일 수 있다. 이러한 다른 항체에 결합된 면역글로불린 분자는 이중 특이적 항체로 지칭된다. 이중 특이적 항체는 본 발명에 따른 단일 사슬 항체에서 구성된 것과 같은 사슬인, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 첫 번째 면역글로불린 분자로 구성될 수 있고, 상기 첫 번째 면역글로불린 사슬은 또한 단일 사슬 항체로 구성된 것과 같은 사슬인, 타겟과 결합하는 두 번째 면역글로불린 분자와 짝을 이룬다. 이중 특이적 항체는 따라서 두 개의 사슬(도 9B에 도식한 것과 유사)로 형성되며, 각각의 사슬은 상이한 단일 결합 도메인(binding domain)을 가지는데 하나의 결합 도메인은 본 발명에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고 또 다른 하나의 결합 도메인은 타겟에 결합한다. 상기 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하고 제제에 연결되는 면역글로불린 분자는 두 개의 단일 항체를 구성하는 이중 특이성 항체가 될 수 있는데, 여기서 상기 첫 번째 단일 도메인 항체는 본 발명의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고, 타겟에 결합하는 두 번째 단일 도메인 항체와 연결된다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하고 제제에 결합하는 면역글로불린 분자는 의학적 치료에서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 의학적 치료는 암 또는 감염의 치료이다.
다른 실시양태에서, 상기 사용은 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하기 위해 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 상기 면역글로불린 분자를 제공한다. 이러한 사용은 예를 들어 실시예에서 설명된 바와 같은 분석에서 유용하다.
다른 실시양태에서, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 상기 면역글로불린 분자는 표지(label)을 포함한다. 이러한 면역글로불린 분자는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체를 발현하는 세포의 유동 세포 계측법에 특히 유용하다. 면역글로불린 분자는 실시예에서 사용된 myc tag 또는 his-tag 또는 형광 단백질 서열과 같은 태그(tag)를 포함할 수 있고, 또는 적절한 영상 색소(imaging dye)와 결합될 수 있다. 또한, 마그네틱 비드와 결합할 때, 이러한 면역글로불린 분자는 말초 혈액으로부터를 포함한 세포 현탁액으로부터 이러한 세포의 분리 및 정제를 위해 사용될 수 있다. 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 면역글로불린과 같이, 이러한 면역글로불린 분자는 세포 집단을 동시에 활성화 및 확대하는 동안 이러한 세포의 선택에 특히 유용하다. 따라서, 상기 사용은 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 표지(labelling) 및/또는 선택(selecting), 및 활성화(activating)하기 위해 이러한 면역글로불린 분자가 추가적으로 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자가 제공되는데 여기서 상기 면역글로불린 분자는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하지 않는 면역글로불린 분자이고; Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하지 않으며 여기서 이는 CDR1 영역 및 CDR2 영역을 포함하는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자이고, 여기서 CDR1 영역은 서열번호 31(GRTFSNYAMG)의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 상기 CDR 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 또한 바람직하게 상기 면역글로불린 분자는 단일 사슬 항체이다. 하나의 실시양태에서, CDR2 영역은 서열번호 2(AISWSGGSTYYADSVKG)와 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 9에서 T, 위치 12에서 A, 및 위치 15에서 V를 가진다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 단일 도메인 항체이며, 바람직하게 상기 단일 도메인 항체는 라마 단일 사슬 항체 또는 인간 단일 사슬 항체이다. 다른 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 단일 도메인 항체이다. 다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자 또는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체는 서열번호 67 내지 70의 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택되는 골격 영역의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성을 차단하지 않거나 활성화하지 않는 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 3, 37, 40 및 43으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함한다.
다른 실시양태에서, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하지 않는 면역글로불린 분자인, 상기 면역글로불린 분자는 표지를 포함한다.
이러한 면역글로불린 분자는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체를 발현하는 세포의 유동 세포 계측(flow cytometric) 또는 면역조직화학적(immunohistochemical) 검출에 특히 유용하다. 면역글로불린 분자는 실시예에서 사용된 myc tag 또는 his-tag 또는 형광 단백질 서열과 같은 태그(tag)를 포함할 수 있고, 또는 적절한 영상 색소(imaging dye)와 결합될 수 있다. 또한, 마그네틱 비드와 결합할 때, 이러한 면역글로불린 분자는 말초 혈액으로부터를 포함한 세포 현탁액으로부터 이러한 세포의 분리 및 정제를 위해 사용될 수 있다. 이러한 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자는 면역조직화학, 유동계측법, 이미징(imaging) 및 세포 현탁액으로부터의 마그네틱 정제(magnetic purification)에서 검출을 위한 연구 도구로 개발될 수 있다. 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 영향을 주지 않기 때문에 이러한 면역글로불린 분자는 또 다른 사용에 이러한 세포 선택에 특히 유용한다. 따라서, 상기 사용은 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 표지(labelling) 또는 선택(selecting)을 위한 면역글로불린 분자를 추가적으로 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 면역글로불린 분자는 CDR 영역 및 CDR2 영역을 포함하는 면역글로불린이고, 여기서 CDR1 영역은 서열번호 31(GRTFSNYAMG)의 아미노산 서열과 적어도 40%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 상기 CDR 영역은 서열번호 32(AISWSGGSTYYADSVKG)의 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 또한 바람직하게 상기 면역글로불린 분자는 단일 사슬 항체이다. 하나의 실시양태에서, CDR2 영역은 서열번호 2(AISWSGGSTYYADSVKG)와 적어도 60%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 9에서 T, 위치 12에서 A, 및 위치 15에서 V를 가진다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 단일 도메인 항체이며, 바람직하게 상기 단일 도메인 항체는 라마 단일 사슬 항체 또는 인간 단일 사슬 항체이다. 다른 실시양태에서, 단일 사슬 항체는 단일 도메인 항체이다. 다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자 또는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체는 서열번호 67 내지 70의 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택되는 골격 영역의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 본 발명의 본 측면의 다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린 분자, 상기 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체는 CDR3 영역을 포함하고, 여기서 CDR3 영역은 서열번호 3, 6, 9, 11, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 30, 33, 35, 37, 40, 43, 및 46의 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 면역글로불린 분자가 제공되는데, 여기서 상기 면역글로불린 분자는 CDR3 영역을 포함하고, 여기서 상기 CDR 영역은 서열번호 3, 6, 9, 11, 14, 17, 20, 22, 25, 27, 29, 30, 33, 35, 37, 40, 43, 및 46의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 :
공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포의 생성
건강한 공여자 유래 (인간) Vγ9Vδ2 T 세포는 기술된 바와 같이 생성 및 배양하였다(Schneiders FL, et al.Clin Immunol 2012; 142:194-200).
Jurkat Vγ9Vδ2 T 세포주 및 Jurma Vγ9Vδ2 T 세포주의 생성
Vγ9Vδ2 TCR을 발현하는 Jurkat 및 JurMa 세포주는 앞에서 설명된 방법에 따라 합성하였다(Scholten KB, et al. Clin Immunol 2006; 119:135-45). 간략하게, 피코르나 바이러스(picorna virus) 유래 2A 서열로부터 분리된, 클론 G9 Vγ9- 및 Vδ2-사슬의 단백질 서열(Allison TJ et al. Nature 2001; 411:820-4), Davodeau F et al. Eur J Immunol 1993; 23:804-8)은 GeneART (Life technologies)에 의한 최적 단백질 생산 및 합성을 위해 코돈 수정되었으며 이어서 LZRSfh 클로닝 되었다. Phoenix-A 패키징 세포주로 형질감염 후, 레트로바이러스 상청액(supernatants)은 Jurkat 또는 Jurma 세포로 형질도입을 위해 수집되었다.
항- Vγ9Vδ2 TCR VHH의 선택
2 라마(Llama glamas)는 6주에 걸쳐 멸균 PBS에 있는 1x108 인간 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포로 각각 4회 접종하였다(immunized). 파지 라이브러리(Phage libraries)는 기술된 llama PBMCs로부터 분리된 추출 RNA로부터 구성되었고(Roovers RC et al. Cancer Immunol Immunother. 2007;56:303-17), 파지미드(phagemid) 벡터 pUR8100로 결찰하였다(ligated). Vγ9Vδ2 T 세포 수용체(TCR) 특이적 VHH는 파지 디스플레이 선택 항목의 두 차례 라운드에 의해 생성되었다. 첫 번째 라운드에서, 각각의 라이브러리로부터의 파지는 2시간 동안 4℃에서 Vγ9Vδ2 TCR (Jurkat Vγ9Vδ2)를 안정적으로 발현하도록 형질도입된 Jurkat 세포와 함께 배양되었다. 배양 후, 세포는 세척하고 파지는 100 mM HCl로 용출하였다. 4℃에서 7분 배양 후, 이들이 E. coli에 감염된 후에 결합하지 않은 파지는 제거하고 Tris-HCl로 중화시켰다. 선택된 파지의 복구 후, 두 번째 라운드 파지는 결합하지 않은 파지들이 Jurkat Vγ9Vδ2와 1시간 동안 배양된 후, Jurkat 세포로 4℃에서 1시간 동안 2배로 선택된 첫 카운터(first counter)이다. 파지는 첫 번째 라운드 선택에 기술된 바와 같이 용출되고 E. coli에 감염시켰다. 박테리아는 LB/ 2% 글루코오스/ 앰피실린(ampicillin) 플레이트에 도말되어 용출된 VHH DNA를 코딩하는 단일 박테이라 콜로니를 생성하였다.
VHH의 생산 및 정제
각각의 클론으로부터의 VHH DNA는 Sfi1/ BstEII로 절단하고, genIII 서열이 삭제된 myc- 및 6x HIS-tag를 C-말단에 추가함으로써 Sfi1/BstEII 클로닝이 가능하게하는 HC-V 카세트의 추가와 함께 pHen1로부터의 유도체인, 플라스미드 pMEK219(Hoogenboom et al. Nucleic Acids Res 1991)로 클로닝되었다. pMEK219-VHH는 TG1 박테리아로 형질전환되었다. 밤새 배양한 것은 2x의 TY 배지에 0.1% 글루코오스 및 100 ug/ml의 엠피실린(ampicillin)을 더하여 접종에 사용하였다. OD600에서 0.5에 다다랐을 때, IPTG를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하였다. 단백질 생산은 2 내지 5시간 동안 수행하였다. 모든 배양액의 성장은 37℃에서 200 내지 220 rpm으로 진탕하며 수행되었다. 단백질 생산은 4℃에서 15분 동안 배지를 회전시켜 중단하였다. 박테리아 펠렛은 PBS로 현탁하고 적어도 1시간 동안 동결하였다. 박테리아 현탁액을 1시간 동안 4℃에서 약간 진탕하여 녹이고 30분 동안 4500 rpm에서 스핀하였다. 상등액은 탈론 수지(Talon resin)(Clontech, 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA, USA)로 세척과 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 탈론 수지는 PBS로 3회, 15 mM 이미다졸(imidazole/PBS pH 7)로 1회 세척하고, 150 mM 이미다졸(imidazole/PBS pH 7)로 용출시켰다. 용출된 분획은 PBS의 2배로 투석하였다. 정제된 VHH는 쿠마시(coomassie)로 염색된 단백질 젤의 순도를 체크하였다.
공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포 또는 Jurkat Vγ9Vδ2 T 세포에 대한 VHH의 결합
5*104의 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포는 FACS 버퍼로 세척되었다. 모든 배양은 FACS 버퍼에서 30분간 4℃에서 수행되었다. 세포는 25 μl의 500 nM VHH와 함께 배양되었다. 세척 후, 세포는 10 μl의 1:500 항-myc tag 항체 클론 4A6 (Merck Millipore, 290 Cocord Road Billerica, MA, USA)와 함께 배양되었다. 세척 후, 세포는 10 μl의 1:200 goat-anti-mouse F(ab)2 APC (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)로 30분간 4℃에서 배양되었다. 마지막 세적 단계 후, 세포에 결합하는 VHH는 유세포 분석기(flowcytometry (FACSCalibur, BD Biosciences))에 의해 측정되었다.
VHH에 의한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화
평평한 바닥의 96 웰 세포 배양 플레이트(Costar)는 50 μl의 4 ug/ml mouse-anti-myc 클론 9E10 (made in house)으로 밤새 4℃에서 코팅되었다. 웰은 PBS로 세척하였으며 200 μl의 4% BSA/PBS로 실온에서 30분 동안 차단하였다(blocked). 차단을 폐기하고 웰은 PBS 상의 30 μl 500 nM VHH으로 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 웰은 세척하였고 200 μl의 IMDM+ (Schneiders FL, et al.Clin Immunol 2012; 142:194-200) 상의 1x104 Vγ9Vδ2 T 세포를 각 웰마다 추가하고 세포 내 사이토카인 보존을 위한 golgiplug (1:500) (BD Biosciences)의 존재 하에서 가습 대기의 CO2 인큐베이터에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 유세포분석은 CD25, IFN-γ 및 그랜자임(Granzyme) B 발현을 확인하기 위해 사용되었다(다음과 같이 기재된 바와 같음; Schneiders FL, et al.Clin Immunol 2012; 142:194-200 (CD25-PE (클론 M-A251, #555432), IFN-γ APC (클론 B27 #554702) BD Pharmingen로부터 둘 다 사용 가능. 그랜자임 B PE (클론 GB-12 #M2289) Sanquin, Amsterdam, The Netherlands로부터 사용 가능).
VHH에 의한 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포의 중화
HeLa 세포는 가습 대기의 CO2 인큐베이터에서 지시된 양의 aminobisphosphonates (NBP;ABP Pamidronaat-DiNatrium, Pharmachemie, Haarlem, The Netherlands)를 2시간 동안 37℃에서 배양되었다. 세포는 세척하고 100 μl의 IMDM+ 내의 5*104로 평평한 바닥의 96 웰 세포 배양 플레이트(Costar)의 각 웰에 뿌렸으며 가습 대기의 CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 37℃에서 부착되도록 하였다. 세포는 PBS로 세척하고 100 μl의 IMDM+에서 배양하였다. 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포는 지시된 VHH 농도와 함께 1시간 동안 4℃에서 배양되었다. 75*103 VHH와 함께 배양된 Vγ9Vδ2 T 세포는 NBP 처리된 HeLa 세포에 첨가되어 웰을 코팅하고 가습 대기의 CO2 인큐베이터에서 배양되었다. 세포는 트립신으로 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 처리하여 수확하고 세포 내 사이토카인 유지를 위한 Golgiplug (1:500, BD Biosciences)를 첨가하였다. 유세포 분석은 CD25, IFN-γ 및 그랜자임 B 발현을 확인하기 위해 사용되었다(다음에 기술된 것과 같다; Schneiders FL, et al. Clin Immunol 2012; 142:194-200)
VHH 사슬 특이성
공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포주는 mouse-anti-human Vδ2-FITC 및 mouse-anti-human Vγ9-PE (both BD Biosciences)으로 염색되었고, FACS Aria (BD Biosciences)로 집단에 대하 분류되었다: 단일 Vδ2 양성 γδ T-세포, 단일 Vγ9 양성 γδ T 세포, Vγ9Vδ2 이중 양성 γδ T-세포 및 Vγ9Vδ2 이중 음성 γδ T-세포. 분류된 세포는 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포주와 같은 방식으로 배양되었다. VHH 특이성 확인을 위해 정제된 분류 세포주 결과물의 104 세포는 공여자 유래 Vγ9Vδ2 T 세포에 VHH의 결합을 위해 10μl의 1:80 goat-anti-mouse-F(ab)2 RPE (#R0480 from Dako, Glostrup, Denmark)를 항-myc 항체 검출을 위한 사용 조절을 통해 서술되는 비슷한 방법으로 VHH로 염색되었다.
결과
선택된 VHH는 상기 기술된 바와 같이 특이성에 대해 시험되었고, 모든 20 VHH(표 2 참조)는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체를 발현하는 Jurkat 세포뿐만 아니라 일차 Vγ9Vδ2 T 세포에의 결합을 보여주며, 여기서 이들은 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체를 발현하지 않는 Jurkat 세포에 결합하지 않는다.
활성화가 유도된 인산항원을 차단하는 면역글로불린 분자
클론 6F6 및 5E7은 Vγ9Vδ2 T 세포의 자극을 유도하는 인산항원을 차단하는 나노바디(nanobodies)로써 특징지어진다. 각각의 클론 6F6 및 5E7은 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체의 Vδ2 사슬에 결합하는 나노바디이다. GrB, CD25 및 IFN-gamma 발현은 자극되지 않은 대조군과 비슷하며, 여기서 양성 대조군은 상대적으로 높은 발현 레벨을 나타낸다(도 2 참조). 용량 반응 곡선에 있어서, 인산항원에의 노출에 따라 용량 의존적인 Vγ9Vδ2 T 세포 반응성이 유도된 인산항원의 중화가 보여진다(도 3 참조). 이는 추가적으로 VHH 5E7 나노바디가 aminobisphosphonates (ABP) 용량 의존적으로, 즉 5E7의 높은 용량은 상대적으로 CD25 및 CD107a의 상대적으로 강한 감소 결과를 나타내고, 인터페론-γ 및 TNF-α 생산 또한 상대적으로 강한 감소 결과를 나타내는, Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 억제하는 것을 보여준다. 5E7 나노바디는 또한 Vγ9Vδ2 T 세포에 의해 용량 의존적으로 Daudi 세포의 자발적 분해를 억제하는 것을 보여주며, 대조군 나노바디는 어떤 유의적인 효과를 나타내지 않았다. 같은 분석에서, 질소를 함유하는 비스포스포네이트 팔미드론산(bisphosphonate pamidronate)는 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하여 Daudi 세포의 분해를 증진시키기 위해 사용되었다. 또한, 5E7 나노바디는 용량 의존적으로 Daudi 세포의 분해를 저감시킨다. 이는 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 차단하는 나노바디를 사용함으로써 Vγ9Vδ2 T 세포의 임의의 원하지 않던 활성화가 저감될 수 있는 것을 나타낸다. 이러한 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 차단하는 항체는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체의 Vδ2 사슬에 결합하는 항체일 수 있다.
활성화를 유도하는 면역글로불린 분자
다양한 VHH는 CD25 발현에 있어서 증가 및 IFN-gamma 발현에 있어서 증가에 의해 보여진 바와 같이, Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화시키는 것을 보여준다(도 4 참조). 더욱이, 이러한 VHH는 VHH의 용량이 증가하면 CD25 발현이 증가하는 결과를 보이는, 전형적인 용량 의존적인 것을 보여준다(도 5, 오른쪽 패널 참조). 이러한 VHH는 또한 면역글로불린 분자에 결합하고 연구된 종양 세포의 세포사멸에 영향을 미친다(도 6 참조). 이중 특이적 VHH(항암 세포 결합 및 Vγ9Vδ2 T 세포 결합 및 활성화)는 종양 세포에 대한 잠재적 사멸 효과를 나타낸다. 이중 특이적 VHH는 항-Vγ9Vδ2 나노바디 6H4의 종양에 대한 나노바디와의 커플링에 의해 만들어졌다. 이중 특이적 대조군으로써, 항-Vγ9Vδ2 나노바디는 대조군 나노바디와 결합되며, 항-종양 나노바디는 대조군 나노바디와 결합된다. 가장 높은 용량의 테스트(10nM)에서, 대조군은 종양 세포에 대해 약 22% 분해가 유도되었다. Vγ9Vδ2 T 세포 및 종양 세포 각각에 결합하는 이중 특이적 VHH(또는 나노바디)는 Vγ9Vδ2 T 세포에 의해 매개된, 약 85%의 종양 세포 분해를 유도한다. 투여량 반응 곡선에서, Vγ9Vδ2 T 세포에 의한 분해 백분율은 낮은 용량에서 감소하였다(1 nM, 약 80%, 100 pM 약 78%, 10 pM 약 50%, 1 pM 약 23% 및 0 약 24%). (이중 특이적) 나노바디의 사용 없이 오직 비스포스포네이트(bisphosphonates)를 사용한 대조군 실험에서, 약 80%의 종양 세포 분해가 관찰되었다. 이러한 결과는 Vγ9Vδ2 T 세포에 의한 종양 특이적 분해가 이중 특이적 VHH(또는 나노바디)를 사용함으로써 향상될 수 있고, 여기서 각각의 종양 및 Vγ9Vδ2 T 세포는 표적화되고, 여기서 Vγ9Vδ2 T 세포의 특이적 종양 타겟은 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 유도한다.
활성화를 유도하지 않고 인산항원 활성화를 차단하지 않는 면역글로불린 분자
몇몇 VHH(5D7, 5C7, 5B11 및 6C4)는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 나타내지 않고, 인산 항원 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화 차단에의 효과를 가지지 않는다(도 8 및 도 5, 왼쪽 패널 참조). 이러한 VHH는 FACS 분류의 예로써 유용하다(도 7 참조).
마그네틱 비드 (Magnetic bead) 분리
항-Vδ2 (즉, 6H4) 또는 Vγ9 나노바디 (즉, 6H1)는 바이오틴화(biotinylated) 되었으며 PBMCs와 혼합하였다. 세포는 세척하여 결합되지 않은 나노바디를 제거하였다. 스트렙타빈(streptavidin) (Miltenyi Biotec에서 사용 가능)과 함께 마그네틱 비드는 혼합물에 첨가되고, 바이오틴화된 나노바디를 통해 비드에 결합된 세포들은 마그네틱 분리 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 세포로부터 분리하였다. PBMC는 Vγ9 및 Vδ2 발현에 관한 분석된 FACS이다. 우수한 정제는 항-Vδ2 및 Vγ9 나노바디 모두와 함께 수득되었다. 예를 들어, 각각의 사슬에 발현되는 PBMC의 4.5% 나노바디 6H4와 함께, 마그네틱 비드 분리 후, 세포의 97.4%가 Vγ9 및 Vδ2 사슬 각각에 대해 양성이었다. 마그네킥 비드에 결합하지 않는 세포의 분획은 Vγ9 및 Vδ2 사슬 각각에 음성이었다(0%).
Vγ9Vδ2를 발현하거나 Vγ9Vδ2를 발현하지 않거나 단일 Vγ9 또는 Vδ2 사슬을 발현하는 γδ T 세포에의 VHH의 결합
Nr Ref Vδ2 + Vγ9 + Vγ9Vδ2 + Vγ9Vδ2 -
1 5C7 +/- - +/- -
2 5E3 - ++ ++ -
3 6H1 - ++ ++ -
4 5G3 - ++ ++ -
5 5C1 +/- ++ ++ -
6 5D3 ++ - ++ -
7 6E3 ++ - ++ -
8 6H4 ++ - ++ -
9 6C1 ++ - ++ -
10 6H3 ++ +/- ++ -
11 6G3 ++ - ++ -
12 6F6 ++ - ++ -
13 5C8 ++ - ++ -
14 5E7 ++ - ++ -
15 5F5 ++ - ++ -
16 6A1 ++ - ++ -
17 5D7 ++ - ++ -
18 5B11 - - + -
19 6C4 +/- ++ ++ -
20 6E4 ++ - ++ -
서열(B= 결합, 활성화하지 않음, 인산항원 활성화(PA) 차단하지 않음; A= 활성화; PA= PA 활성화 차단)
서열번호 코드 설명 서열
1 5C7 CDR1 B GRTFSRYTMG
2 5C7 CDR2 B AISWSGGRTNFAGSVKG
3 5C7 CDR3 B DWLPVPGRESYDY
4 5E3 CDR1 A GRTFSSYAMG
5 5E3 CDR2 A AISWSGGTTYYADSVKG
6 5E3 CDR3 A SLDCSGPGCHTAEYDY
7 6H1 CDR1 A GRTFSEYAMG
8 6H1 CDR2 A AISWTGSKTYYADSVKG
9 6H1 CDR3 A SSDCSGPGCHTEEYDY
4 5G3 CDR1 A GRTFSSYAMG
10 5G3 CDR2 A AVSWSGGSTYYADSVKG
11 5G3 CDR3 A SQDCSGPGCYTNEYDS
12 5C1 CDR1 A GSIFSNYAMA
13 5C1 CDR2 A AVSWSGGRTYYADSVKG
14 5C1 CDR3 A SLSCSGPGCSLEEYDY
15 5D3 CDR1 A GRPFSNYAMG
16 5D3 CDR2 A VISWSGGSTYYADSVKG
17 5D3 CDR3 A QFSGASTVVAGTALDYDY
18 6E3 CDR1 A GRPFSNYGMG
19 6E3 CDR2 A GISWSGGSTDYADSVKG
20 6E3 CDR3 A VFSGAETAYYPSDDYDY
18 6H4 CDR1 A GRPFSNYGMG
19 6H4 CDR2 A GISWSGGSTDYADSVKG
20 6H4 CDR3 A VFSGAETAYYPSDDYDY
18 6C1 CDR1 A GRPFSNYGMG
19 6C1 CDR2 A GISWSGGSTDYADSVKG
20 6C1 CDR3 A VFSGAETAYYPSDDYDY
18 6H3 CDR1 A GRPFSNYGMG
21 6H3 CDR2 A GITWSGGSTHYADLVKG
22 6H3 CDR3 A VFSGAETAYYPSTEYDY
23 6G3 CDR1 A GRPFNNYGMG
24 6G3 CDR2 A GISWSGGSTYYADSVKG
25 6G3 CDR3 A VFSGAETAQYPSYDYDY
15 6F6 CDR1 PA GRPFSNYAMG
26 6F6 CDR2 PA AVTWSGGSTYYADSVKG
27 6F6 CDR3 PA QFNGAENIVPATTTPTSYDY
15 5C8 CDR1 A GRPFSNYAMG
28 5C8 CDR2 A AISWSGGSTSYADSVKG
29 5C8 CDR3 A QFSGADYGFGRLGIRGYEYDY
15 5E7 CDR1 PA GRPFSNYAMG
28 5E7 CDR2 PA AISWSGGSTSYADSVKG
30 5E7 CDR3 PA QFSGADYGFGRLGIQGYEYDY
31 5F5 CDR1 A GRTFSNYAMG
32 5F5 CDR2 A AISWSGGSTYYADSVKG
33 5F5 CDR3 A MFSGSESQLVVVITNLYEYDY
31 6A1 CDR1 A GRTFSNYAMG
34 6A1 CDR2 A TISWSGGSTYYADSVKG
35 6A1 CDR3 A AFSGSDYANTKKEVEYDY
31 5D7 CDR1 B GRTFSNYAMG
36 5D7 CDR2 B AISWSGGMTDHADSVKG
37 5D7 CDR3 B AFAGDIPYGSSWYGDPTTYDY
38 5B11 CDR1 B GRTSSTFSMA
39 5B11 CDR2 B AINWSGGSTRYADSVSD
40 5B11 CDR3 B RRGGIYYSTQNDYDY
41 6C4 CDR1 B VRTFSDYRMG
42 6C4 CDR2 B TISWSGGLTYYADSVKG
43 6C4 CDR3 B GGGYAGGTYYHPEE
44 6E4 CDR1 A GFTFDDYCIA
45 6E4 CDR2 A CITTSDGSTYYADSVKG
46 6E4 CDR3 A YFGYGCYGGAQDYRAMDY
47 5C7 VHH EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGRTNFAGSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADWLPVPGRESYDYWGQGTQVTVSS
48 5E3 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYFCAASLDCSGPGCHTAEYDYWGQGTQVTVSS
49 6H1 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAATGRTFSEYAMGWFRQAPGKEREFAAAISWTGSKTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASSDCSGPGCHTEEYDYWGQGTQVTVSS
50 5G3 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAVSWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLNPEDTAVYYCAASQDCSGPGCYTNEYDSWGQGTQVTVSS
51 5C1 VHH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSNYAMAWFRQAPEKERDFLAAVSWSGGRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYYCAASLSCSGPGCSLEEYDYWGQGTQVTVSS
52 5D3 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQAPGKEREFVTVISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQFSGASTVVAGTALDYDYWGQGTRVTVSS
53 6E3 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRLTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSS
54 6H4 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSS
55 6C1 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKRESVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSS
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<212> PRT <213> Llama gama <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Met Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gln Leu Val Val Val Ile Thr 100 105 110 Asn Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 62 <211> 127 <212> PRT <213> Llama gama <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Phe Ser Gly Ser Asp Tyr Ala Asn Thr Lys Lys Glu Val 100 105 110 Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 63 <211> 130 <212> PRT <213> Llama gama <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Met Thr Asp His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Phe Ala Gly Asp Ile Pro Tyr Gly Ser Ser Trp Tyr Gly 100 105 110 Asp Pro Thr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 64 <211> 124 <212> PRT <213> Llama gama <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr Phe 20 25 30 Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Arg Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Ser Asp Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Arg Gly Gly Ile Tyr Tyr Ser Thr Gln Asn Asp Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 65 <211> 123 <212> PRT <213> Llama gama <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Val Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Ala Gly Gly Thr Tyr Tyr His Pro Glu Glu 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 66 <211> 127 <212> PRT <213> Llama gama <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Cys Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Pro Val 35 40 45 Ser Cys Ile Thr Thr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Phe Gly Tyr Gly Cys Tyr Gly Gly Ala Gln Asp Tyr Arg 100 105 110 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 67 <211> 25 <212> PRT <213> Llama glama <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Llama gama <400> 68 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 69 <211> 32 <212> PRT <213> Llama gama <400> 69 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Llama gama <400> 70 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 315 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 71 Met Leu Ser Leu Leu His Ala Ser Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 Cys Val Tyr Gly Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr 20 25 30 Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile 35 40 45 Thr Ile Ser Ala Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu 50 55 60 Val Ile Gln Phe Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys 65 70 75 80 Glu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu 85 90 95 Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Glu Ala Gln Gln Glu Leu Gly Lys 115 120 125 Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr Asp Lys 130 135 140 Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro Ser 145 150 155 160 Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu Leu 165 170 175 Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Glu Glu Lys Lys 180 185 190 Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys Thr Asn 195 200 205 Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys Ser Leu 210 215 220 Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys Asn Gly 225 230 235 240 Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr 245 250 255 Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu 260 265 270 Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu 275 280 285 Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg 290 295 300 Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser 305 310 315 <210> 72 <211> 292 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 72 Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly 1 5 10 15 Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val 20 25 30 Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala 35 40 45 Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr 50 55 60 Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys 65 70 75 80 Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu 85 90 95 Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe 115 120 125 Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr 130 135 140 Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser 165 170 175 Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly 180 185 190 Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val 195 200 205 Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe 210 215 220 Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu 225 230 235 240 Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val 245 250 255 His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg 260 265 270 Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys 275 280 285 Leu Phe Phe Leu 290

Claims (26)

  1. CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin) 분자로서, 상기 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은:
    각각 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 4, 5 및 6의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 7, 8 및 9의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 4, 10 및 11의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 12, 13 및 14의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 15, 16 및 17의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 18, 19 및 20의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 18, 21 및 22의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 23, 24 및 25의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 15, 26 및 27의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 15, 28 및 29의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 15, 28 및 30의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 31, 32 및 33의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 31, 34 및 35의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 31, 36 및 37의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 38, 39 및 40의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 41, 42 및 43의 아미노산, 또는
    각각 서열번호 44, 45 및 46의 아미노산, 을 포함하는
    인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합하는 면역글로불린 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자는 단일쇄 항체(single chain antibody)인 것인, 면역글로불린 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단일쇄 항체는 라마(llama) 단일쇄 항체인 것인, 면역글로불린 분자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단일쇄 항체는 인간(human) 단일쇄 항체인 것인, 면역글로불린 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자는 단일 도메인 항체(single domain antibody)인 것인, 면역글로불린 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단일 도메인 항체는 라마(llama) 단일 도메인 항체인 것인, 면역글로불린 분자.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단일 도메인 항체는 인간(human) 단일 도메인 항체인 것인, 면역글로불린 분자.
  8. 제1항에 있어서, 두 개의 단일 도메인 항체로 구성된 이중특이적 항체로, 첫 번째 단일 도메인 항체는 제1항의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고, 상기 첫 번째 단일 도메인 항체는 두 번째 단일 도메인 항체와 연결되고, 상기 두번째 단일 도메인 항체는 표적에 결합하는 것인, 면역글로불린 분자.
  9. 제1항에 있어서, 두 개의 단일 도메인 항체로 구성된 이중특이적 항체로, 첫 번째 단일 도메인 항체는 제1항의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고, 상기 첫 번째 단일 도메인 항체는 두 번째 단일 도메인 항체와 연결되고, 상기 두번째 단일 도메인 항체는 암 세포에 결합하는 것인, 면역글로불린 분자.
  10. 제1항에 있어서, 서열번호 67 내지 70의 아미노산 서열의 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 골격 영역(framework regions)을 포함하는 면역글로불린 분자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자는 서열번호 47 내지 66의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것인 면역글로불린 분자.
  12. 제1항에 따른 면역글로불린 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
  13. 제12항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 숙주 세포.
  14. 제13항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계;
    숙주 세포에서 면역글로불린을 발현시키는 단계; 및
    면역글로불린을 수득하는 단계;
    를 포함하는 제1항에 따른 면역글로불린 분자를 제조하는 방법.
  15. 의학적 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 분자.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자가 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성을 차단하는 면역글로불린 분자인, 면역글로불린 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 CDR3 영역은 서열번호 27 및 30의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자.
  18. 메발론산 경로(mevalonate pathway) 억제제의 사용을 포함하는 의학적 치료, 또는 암 또는 감염성 질환의 치료를 포함하는 의학적 치료에 사용하기 위한, 제16항에 따른 면역글로불린 분자.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자가 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 면역글로불린 분자인, 면역글로불린 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 CDR3 영역은 서열번호 6, 9, 11, 14, 17, 20, 22, 25, 29, 33, 35, 및 46의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 분자.
  21. 제19항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자는 제제(agent)와 연결된 것인 면역글로불린 분자.
  22. 암 치료에 사용하기 위한 제19항에 따른 면역글로불린 분자.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 차단하지 않고; 및
    인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하지 않는 면역글로불린 분자인 것인, 면역글로불린 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 CDR3 영역은 서열번호 3, 37, 40 및 43으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 면역글로불린 분자.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자 또는 이의 항원-결합 부분은 표지(label)를 포함하는 것인 면역글로불린 분자.


  26. 삭제
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